Soutenance mémoire
Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études
Diagnostic biologique indirect : la sérologie anti-palustre
La recherche d’anticorps spécifiquement dirigés contre Plasmodium spp. dans le sérum repose sur de nombreuses techniques immunologiques, dont la technique de référence reste l’immunofluorescence indirecte. Cette technique de détection des anticorps totaux par un conjugué anti-immunoglobulines humaines fluorescent est réalisée le plus souvent avec des plasmodiums, au stade schizonte, comme principale source d’antigènes figurés intra-érythrocytaires. Les espèces de plasmodium les plus souvent utilisées pour la préparation des antigènes sont Plasmodium cynomolgi à partir d’une infestation de singes macaques en laboratoire ou des souches de laboratoire de Plasmodium falciparum, cultivées en hématies humaines in vitro dont les communautés antigéniques permettent de détecter les anticorps dirigés contre Plasmodium spp. [62]. Cette technique, sensible, spécifique et facilement réalisable est néanmoins soumise à une interprétation subjective dépendante de l’expérience de l’opérateur qui fait la lecture au microscope à fluorescence de la fixation des anticorps marqués [62].
De part les pré requis indispensables au diagnostic du paludisme liés à l’urgence médicale qu’il représente, la sérologie anti-palustre ne constitue en aucun cas un test diagnostique de première intention pour une recherche de paludisme lors d’un accès aigu. Les indications de la sérologie anti-palustre sont limitées à 3 situations : le diagnostic rétrospectif pour des patients traités pour un paludisme et pour lesquels aucune forme parasitaire circulante n’a été préalablement détectée, l’identification de porteurs asymptomatiques ayant séjourné en zone d’endémie dans le cadre de la prévention du paludisme post transfusionnel et enfin lors d’études séro-épidémiologiques en zone d’endémie afin d’évaluer l’exposition des populations au parasite et contrôler l’efficacité des campagnes d’éradication [62]. L’utilisation de l’immunofluorescence indirecte pour évaluer l’immunité anti-palustre reste controversée, mais cependant, la sérologie évolue parallèlement à l’âge et à l’acquisition d’une immunité protectrice. A l’inverse, il est difficile de mettre en évidence des anticorps protecteurs parmi ce mélange d’anticorps détectés sur schizontes entiers intra-érythrocytaires [62].
De nouvelles techniques sérologiques immunoenzymatiques ont par la suite été développées telles que l’ELISA pour suppléer l’immunofluorescence indirecte, technique qui n’était pas à la portée de tous les laboratoires notamment pour le maintien de souches de plasmodium en culture et peu adapté aux grosses cadences d’analyses. Ces techniques ELISA, contenant un ou plusieurs antigènes figurés spécifiques de Plasmodium spp., ont démontré des performances équivalentes à l’immunofluorescence indirect dans certaines études [63].
Physiopathologie de l’accès palustre grave
La survenue d’un accès palustre grave résulte d’un processus multifactoriel complexe faisant intervenir de nombreux mécanismes liés à l’hôte et au parasite. Deux évènements semblent néanmoins majoritaires et abondamment décrits dans la littérature : la séquestration parasitaire et les mécanismes immunopathologiques associés au déséquilibre entre réponse immunitaire innée pro- et anti-inflammatoire.
La séquestration parasitaire
La séquestration parasitaire est un des principaux mécanismes physiopathologiques de l’accès palustre grave à l’origine de l’atteinte cérébrale et du paludisme gestationnel. Résultant d’un phénomène, appelé « cytoadhérence », elle repose sur l’adhésion des globules rouges parasités à la surface des cellules endothéliales vasculaires de l’hôte, à la capacité du globule rouge parasité de s’agglutiner avec des globules rouges non parasités (rosetting) ainsi qu’à l’agglutination des globules rouges parasités facilitée par les plaquettes (clumping) (figure 7) via des protubérances à la surface de la membrane du GR appelées knobs. La séquestration parasitaire permet aux formes matures asexuées de Plasmodium falciparum (trophozoïtes âgés et schizontes) [64], contrairement à la forme sexuée gamétocytique [65], de pouvoir échapper à la clairance splénique de l’hôte et favorise l’augmentation de la biomasse parasitaire par une multiplication facilitée dans l’environnement anaérobique des veinules post-capillaires. Ce processus de séquestration est indispensable au bon développement du parasite lui conférant un avantage pour sa survie contrairement aux autres espèces non-falciparum [66], [67].
PfEMP1
PfEMP1 est une des protéines majoritaires des VSA, considérée comme le facteur de virulence majeur de Plasmodium falciparum, insérée dans les protubérances des knobs à la surface du globule rouge parasité [72], [73]. Cette famille de polypeptides présente un intérêt majeur dans la physiopathologie de l’accès grave puisqu’elle est directement impliquée dans les phénomènes de séquestration parasitaire par interaction avec des récepteurs de l’hôte à la surface des cellules endothéliales [67]. Cette adhésion à la surface des globules rouges via PfEMP1 a été confirmée dans certaines hémoglobinopathies comme la drépanocytose, l’hémoglobinose C et l’ovalocytose où la déformation des globules rouges liée à la maladie sous jacente altère l’exposition de PfEMP1 à leur surface et par conséquent la séquestration parasitaire [70], [74].
PfEMP1 est un polypeptide parasitaire de haut poids moléculaire (200 à 400 kDa), sensible à la digestion trypsique, qui est inséré dans la membrane du globule rouge parasité. Sa structure typique est composée de 4 parties distinctes : un segment N terminal extracellulaire variable (NTS), une région de domaines protéiques variables qui interagit avec les récepteurs cellulaires, un domaine transmembranaire (TM) et un segment C terminal intracellulaire conservé (ATS) qui interagit avec la protéine KAHRP intra cytoplasmique [67], [69] (figure 10).
Les mécanismes immunopathologiques
Les mécanismes de cytoadhérence ne peuvent expliquer à eux seuls les lésions vasculaires observées lors d’un accès palustre grave. La présence de leucocytes, de plaquettes et d’autres cellules inflammatoires au sein des amas de globules rouges séquestrés dans la microcirculation capillaire, semble indiquer un rôle délétère de la réaction inflammatoire développée vis-à-vis de l’infection par Plasmodium falciparum via un déséquilibre de la balance de sécrétion de cytokines pro et anti-inflammatoires [70], [125]. L’indépendance de la séquestration parasitaire vis-à-vis de ces mécanismes immunopathologiques lors d’un accès palustre grave n’est cependant pas totalement prouvée et il semblerait que ces 2 mécanismes soient finalement intimement liés.
Une des principales causes identifiées dans la littérature à l’origine de ces mécanismes immunopathologiques serait la production de toxines malariques qui aurait pour conséquence une hyperproduction de cytokines pro-inflammatoires chez l’hôte infecté. Néanmoins, la reconnaissance de motifs antigéniques parasitaires tel que le motif protéique DBLα de PfEMP1 par les lymphocytes CD4 [126]–[128] ou d’autres motifs antigéniques par les récepteurs cellulaires Toll-Like Receptors (TLR) ou CD36 des macrophages, des plaquettes, des cellules dendritiques et cellules Natural killer (NK) peut être à l’origine d’une réponse pro-inflammatoire exacerbée [129]–[132].
Les toxines malariques sont des produits synthétisés et sécrétés par le parasite lors des stades matures de son développement intra-érythrocytaire et notamment lors de la rupture du globule rouge parasité par le schizonte. Les principales toxines malariques identifiées dans la physiopathologie de l’accès palustre grave sont la famille des protéines transmembranaires ancrées à des résidus glycosylphosphatidylinositol (GPI) [133] et les complexes d’hémozoïnes (Hz) produits par le parasite lors de la détoxification de l’hème [67]. L’interaction des protéines GPI avec diverses cellules de l’immunité innée et adaptative, et la phagocytose par les monocytes/macrophages de l’hémozoïne libérée module la synthèse des médiateurs de l’inflammation. Même si les cytokines pro-inflammatoires, tumor necrosis factor-α (TNF-α), interféron gamma (IFN-γ), interleukine-6 (IL-6), interleukine-2 (IL-2) et interleukine-1 (IL-1) jouent un rôle précoce majeur dans le contrôle de la multiplication parasitaire, une hyperproduction de ces cytokines stimulée entre autre par la sécrétion des toxines malariques, sans régulation par les lymphocytes T régulateurs (Treg) ni par la cytokine anti-inflammatoire interleukine-10 (IL-10) [129], a un effet délétère pour l’hôte infecté [67], [129], [134].
Les principales conséquences sont une majoration de la symptomatologie clinique, une dysrégularisation de certains mécanismes cellulaires mais également une déstabilisation de la réaction immunitaire nécessaire au contrôle du parasite par une régulation positive ou négative de chemokines et cytokines pro- et anti-inflammatoires [134]. L’augmentation de la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire TNF-α amplifie la symptomatologie de l’accès palustre tels que les courbatures, les frissons, les nausées, les vomissements, les diarrhées et la fièvre via l’activation de la cyclooxygenase de type 2 favorisant la production des prostaglandines [134]. L’hyperproduction d’IL-6 stimule le recrutement des leucocytes au niveau du site d’infection ce qui peut avoir comme effet d’entraîner une boucle d’amplification de la réaction inflammatoire. Les cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IFN-γ activent les cellules endothéliales vasculaires entrainant une augmentation de la densité de récepteurs impliqués dans la cytoadhérence à la surface des cellules ainsi que la perméabilité de la paroi vasculaire [67], [134]. La corrélation entre une hyperproduction cytokinique et un accès palustre grave a été mise en évidence chez des cohortes de patients, enfants et adultes, résidant ou non en zone d’endémie. Une augmentation des concentrations plasmatiques d’interleukine 12 (IL-12) , IL-1, d’IL-6, d’IL-10, d’IL-2, de TNF-α, d’IFN-γ, d’interleukine 8 (IL-8), d’interleukine 4 (IL-4) et une diminution de production de tumor growth factor β1 (TGF-β1) sont des facteurs favorisant la survenue d’un accès palustre grave chez les personnes non exposées « naïves » tels que les enfants en zone d’endémie et les voyageurs par rapport à des populations adultes vivant en zone d’endémie [135]–[137]. Cette réponse de type Th1 favorisant la réponse immunitaire à médiation cellulaire semble indépendante de l’âge du patient infecté et serait plutôt liée aux premiers contacts avec Plasmodium falciparum [135]. Cette réponse immunitaire extrême délétère pour l’organisme de l’hôte est proche de celle décrite dans le syndrome de reconstitution immunitaire (IRIS) [138].
Conséquences de l’infection par Plasmodium falciparum
Au niveau cellulaire
La séquestration parasitaire dans la microcirculation des veinules post-capillaires entraîne une activation des cellules endothéliales vasculaires à l’origine de nombreuses répercussions physiologiques (figure 14).
L’activation de l’endothélium vasculaire par contact direct avec le globule rouge favorise tout d’abord un état pro-adhésif endothélial par une augmentation de la densité de récepteurs impliqués dans le phénomène de cytoadhérence à la surface des cellules [139]. L’adhésion à l’endothélium est également à l’origine de troubles de la coagulation par l’induction de l’expression du facteur tissulaire via l’activation des cellules endothéliales, qui entraîne l’activation de la cascade de la coagulation avec une consommation des plaquettes. La thrombopénie qui en résulte peut être associée à une augmentation du risque hémorragique au niveau des tissus touchés.
Cette altération de la cascade de la coagulation est également liée à un défaut de la voie métabolique de la protéine C favorisant un état pro-coagulant fréquemment rencontré dans le neuropaludisme. Ce déficit métabolique est en partie associé à l’occupation des sites de liaison de la protéine par la protéine PfEMP1 du globule rouge parasité mais également à une perte des récepteurs EPCR à la surface des cellules endothéliales dont la répercussion est plus importante dans les tissus cérébraux, liée à leur faible nombre de départ contrairement aux tissus endothéliaux périphériques [92], [140]. La perte des EPCR membranaires cérébraux est associée à un relargage de ces récepteurs sous forme soluble dont la quantité est corrélée à la gravité de l’infection chez les enfants de moins de 5 ans en zone d’endémie [141]. L’activation des cellules endothéliales est également accompagnée de l’exocytose de corps de Weibel-Palade libérant du facteur Von Willebrand de grande taille, son propeptide et de l’angiopoïetine-2 contenus dans ces structures [125]. Le facteur Von Willebrand de grande taille a la capacité de se fixer à l’endothélium activé mais également de fixer des plaquettes qui serviront de ponts via les récepteurs CD36 pour les globules rouges parasités [142]. La formation de ce complexe globule rouge-plaquette-Von Willebrand consomme les plaquettes, ce qui favorise encore la thrombopénie. L’élimination de cette structure de l’endothélium entraîne la consommation d’ADAMTS13, protéase spécifique du clivage du facteur Von Willebrand, potentiellement à l’origine d’un processus de micro-angiopathies thrombotiques [142]. Sous l’effet du VEGF, l’angiopoïetine-2 possède un effet sur la régulation de la réponse inflammatoire, sur l’activation de l’endothélium mais surtout sur son intégrité. Ainsi, l’angiopoïetine-2 est considéré comme un marqueur de gravité car responsable de la rupture de la barrière endothéliale.
En parallèle, l’activation de cellules de l’immunité innée via la séquestration parasitaire et la production de toxines parasitaires décrite précédemment sont à l’origine de la production de cytokines pro-inflammatoires favorisant le recrutement et l’activation d’autres cellules inflammatoires et de l’immunité telles que les leucocytes, les plaquettes et les lymphocytes cytotoxiques. Le passage dans la circulation générale de ces cytokines pro-inflammatoires peut avoir des répercussions sur l’érythropoïèse dont les conséquences directes sont l’anémie chez le sujet infecté [134]. L’activation des monocytes par le parasite stimule la production importante de radicaux libres et de monoxyde d’azote (NO) dont les effets protecteurs de départ sur l’endothélium vasculaire peuvent avoir un effet délétère, l’hyperproduction de la synthèse de NO via l’induction de la NO synthase (iNOS) par les cytokines pro-inflammatoires dont le TNF-α peut rompre la barrière endothéliale [125], [129], [143].
L’immunité anti-palustre
Dogme de l’acquisition de l’immunité naturelle
Historique
L’hypothèse de l’existence d’une immunité anti-palustre protectrice avait déjà été évoquée par les colons européens en zone intertropicale en observant la résistance des populations locales à l’infection palustre et cela avant même la découverte de l’agent infectieux du paludisme au 19ème siècle [153]. En Indonésie, Robert Koch avait également remarqué une résistance clinique des habitants locaux face à l’infection palustre qui maitrisaient davantage la multiplication parasitaire avec l’observation d’une plus faible parasitémie, ce qui lui avait fait envisager l’existence de mécanismes immunologiques à l’origine de cette protection [153]. En 1920, les bases de cette immunité protectrice furent posées décrivant une immunité bâtie sur une exposition ininterrompue au parasite, de durée de vie courte, spécifique d’espèces et du stade parasitaire et dépendant du degrés d’exposition [153]. L’utilisation de la malariathérapie dans le traitement de la syphilis tertiaire a permis de démontrer par la suite qu’une immunisation palustre induite par les injections répétées de souches de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax et Plasmodium malariae est possible [153]. Néanmoins, cette immunité anti-palustre est d’acquisition complexe et semble être régie par trois principaux facteurs.
Influence de l’âge et du temps d’exposition au parasite
L’âge est un des facteurs prépondérants pour l’acquisition de l’immunité anti-palustre en zone d’endémie mais qu’il est parfois difficile de dissocier du temps d’exposition au parasite [154].
Les enfants de moins de 5 ans sont considérés comme à risque de développer un accès palustre grave du fait de l’absence d’une immunité palustre à cet âge. Exposé durant toute l’enfance en zone de forte endémicité, l’enfant va au départ rapidement mais progressivement développer une immunité « anti-maladie », entre environ 3 mois et 5 ans, qui lui permettra de mieux maîtriser la symptomatologie liée à l’infection palustre et ainsi limiter l’apparition des formes graves de la maladie. Par la suite, il développera dans un second temps une immunité « anti-parasitaire » qui lui permettra de contrôler le développement parasitaire et ainsi de limiter la densité parasitaire. Enfin, une immunité dite de « prémunition » vis-à-vis de l’accès palustre se développera à l’adolescence et chez l’adulte associée au maintien d’une infection asymptomatique sans fièvre avec de très faibles densités parasitaires [153]. Cette immunité demeure cependant non stérilisante et n’empêche pas une réinfection du sujet. De plus, cette immunité est considérée comme de courte durée en l’absence d’exposition continue au parasite resoumettant les patients aux formes graves de l’infection quelques mois à quelques années après l’arrêt de l’exposition.
Indépendamment du temps d’exposition au parasite, l’âge de l’hôte reste un facteur important pour le développement d’une immunité protectrice contre un large répertoire antigénique [154]–[162]. Alors que le jeune enfant en zone d’endémie a besoin d’une exposition longue pour développer une immunité palustre, il semblerait que les enfants dont l’exposition au parasite est retardé de plusieurs mois par l’administration d’un traitement chimioprophylactique ou les adultes n’ayant jamais été exposés au parasite, développent beaucoup plus rapidement une immunité protectrice vis-à-vis notamment des infections graves, lorsqu’ils sont soumis à une forte exposition sur une courte durée. Cette protection est plus ou moins associée à de forts taux d’anticorps et apparait quelque soit l’âge de l’hôte [154]–[158], [162] faisant suite aux premières infections qui apparaissent cependant plus graves que celles constatées chez l’enfant exposé en continu [157], [158], [163]. Une des hypothèses de cette différence de vitesse de développement de l’immunité anti-palustre repose sur la maturité du système immunitaire de l’hôte [156]. Contrairement aux patients adultes, les enfants sont considérés comme immatures immunologiquement vis-à-vis du parasite [156], [164]. Cette maturité immunologique semble coïncider avec l’apparition de la puberté et la production de certaines hormones telle que le sulfate de dehydroepiandrosterone confirmant que le passage à l’âge adulte est un évènement indispensable pour l’acquisition rapide d’une immunité anti-palustre efficace [164].
Influence des infections à répétition
L’acquisition d’une immunité anti-palustre en zone d’endémie est longue et met plusieurs années à se développer avant de devenir protectrice contre les formes graves à l’âge adulte. Par conséquent, les enfants en zone d’endémie doivent être exposés durant toute leur enfance afin d’acquérir une immunité protectrice. L’existence d’une variabilité importante de certains antigènes de Plasmodium falciparum et le développement d’une immunité spécifique de la souche infectante sont à l’origine de cette acquisition longue et tardive [165], [166]. Les infections répétées dès le plus jeune âge permettent à l’hôte de se constituer un répertoire immunologique spécifiquement dirigé contre les antigènes de la souche infectante mais également contre d’autres variants d’antigènes plasmodiaux de souches circulantes de la zone endémique via une immunité croisée entre les souches présentant des épitopes communs pour un phénotype de cytoadhésion donné. Ceci explique l’acquisition « rapide » d’une immunité vis-à-vis d’un très grand nombre d’antigènes de surface [153], [160], [167].
Cependant, la survenue d’un accès palustre grave ne semble être due qu’à l’expression non aléatoire d’un groupe restreint de gènes var du groupe A et B/A codant pour un groupe d’antigènes de surface conférant un avantage sélectif au parasite en terme de croissance et de cytoadhérence. Cette hypothèse fut confirmée notamment par Nielsen et al., qui mit en évidence une reconnaissance rapide, par les anticorps de patients semi-immuns, des antigènes de surface exprimés par les parasites chez les enfants présentant une forme grave de la maladie palustre [168]. D’autres études in vitro sur la réponse immunitaire protectrice vont dans ce sens à travers l’étude de la réaction immunitaire dirigée contre des antigènes de surface recombinants, produits de l’expression de gènes var du groupe A et B/A [169] tel que le gène PF11_0008 [170]. Par conséquent, la construction d’une immunité protectrice contre certaines formes graves de l’infection palustre semble être plus rapide et apparaitrait après 1 à 2 infections [171]. Des lacunes dans le répertoire immunologique de l’hôte vis-à-vis de l’expression de nouveaux variants antigéniques de Plasmodium falciparum ne permettent pas un contrôle suffisant de la souche parasitaire ce qui est à l’origine de la réapparition de symptômes de l’accès palustre [168], [172].
|
Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE 1 : REVUES BIBLIOGRAPHIQUES
I. Le paludisme : généralités
1. L’agent pathogène : Plasmodium spp.
a. Historique
b. Phylogénie et principales espèces retrouvées chez l’homme
c. Cycle parasitaire de Plasmodium falciparum
2. Epidémiologie du paludisme
a. Epidémiologie mondiale
b. Epidémiologie du paludisme d’importation en France métropolitaine
3. Les différentes formes cliniques de l’accès palustre
a. Accès palustre grave
i. Définition de l’accès palustre grave selon l’OMS (score OMS)
ii. Facteurs de gravité dans le contexte de paludisme d’importation
iii. Atteinte neurologique ou neuropaludisme (accès pernicieux)
iv. Autres formes graves non neurologiques
b. Accès palustre simple
c. Forme clinique atypique : accès palustre chez la femme enceinte
4. Le diagnostic biologique du paludisme
a. Eléments d’orientation et principe de réalisation du diagnostic biologique
b. Le frottis sanguin
c. La goutte épaisse
d. Les tests de diagnostiques rapides (TDR)
e. La détection à l’acridine orange
f. Diagnostic biologique par amplification génique (PCR)
g. Les autres marqueurs biologiques d’orientation associés à l’accès palustre
h. Diagnostic biologique indirect : la sérologie anti-palustre
II. Physiopathologie de l’accès palustre grave
1. La séquestration parasitaire
a. Formation des knobs
b. PfEMP1
c. Les récepteurs de l’hôte impliqués
d. Les gènes var
2. Les mécanismes immunopathologiques
3. Conséquences de l’infection par Plasmodium falciparum
a. Au niveau cellulaire
b. Au niveau clinico-biologique
III. L’immunité anti-palustre
1. Dogme de l’acquisition de l’immunité naturelle
a. Historique
b. Influence de l’âge et du temps d’exposition au parasite
c. Influence des infections à répétition
d. Influence de l’endémicité
e. Cas particulier du paludisme d’importation
2. La réponse immunitaire dirigée contre PfEMP1
a. Le rôle des anticorps
b. Les effets de la réponse immunitaire humorale lors de l’infection palustre
3. Les effets immunomodulateurs de Plasmodium falciparum
CHAPITRE 2 : PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS DE THESE
I. Objectifs de la thèse
II. Cadre de l’étude
1. Réseau du centre national de référence du paludisme
2. Diagnostic parasitologique au laboratoire du CNR
3. Critères d’inclusion des échantillons/patients
RESULTATS
CHAPITRE 1: LIMITATION DE LA SEQUESTRATION DE P. FALCIPARUM APRES PRE EXPOSITION AU PARASITE DANS LE PALUDISME D’IMPORTATION EN FRANCE
CHAPITRE 2 : ANALYSE DE L’EXPRESSION DES GENES VAR ET DE DOMAINES CASSETTES DANS LE CONTEXTE DU PALUDISME D’IMPORTATION
CHAPITRE 3 : ETUDE DU PHENOTYPE DE CYTOADHERENCE DES ISOLATS DE P. FALCIPARUM DANS LE CADRE DU PALUDISME D’IMPORTATION.
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES
Télécharger le rapport complet
