Soutenance mémoire
Les composés pétroliers
Les pétroles bruts sont constitués de différentes familles des composés (Figure I.2.) dont la composition chimique varie énormément selon leur origine géographique et géologique (Tissot et Welte, 1984). Les hydrocarbures constituent la fraction la plus importante d’un brut pétrolier, ils représentent entre 65 et 95 % de la plupart des pétroles bruts. Les composés pétroliers peuvent être classés en quatre familles principales qui sont présentes en proportions variables selon l’origine: les hydrocarbures saturés (30 à 70 %), les hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques (20 à 40 %), les composés polaires (5 à 25 %) et les asphaltènes (0 à 10 %). Les produits pétroliers sont aussi introduits dans l’environnement marin sous forme de produits raffinés: carburants et huiles, leurs compositions dépendent de l’origine du pétrole et des opérations subies au cours du raffinage. On dénombre environ 230 composants pour l’essence et de l’ordre de 2000 pour un fuel lourd.
Les hydrocarbures saturés Parmi lesquels, on distingue
* Les alcanes linéaires (n-alcanes, CnH2n+2), dont la longueur de chaîne varie de 7 à 40 atomes de carbone, constituent une des classes les plus abondantes (10 à 40 % des hydrocarbures totaux d’un brut pétrolier).
* Les alcanes ramifiés: les plus abondants sont les iso-alcanes (groupement méthyle en position 2), les autres composés ramifiés antéiso (groupement méthyle en position 3) ou polyramifiés tels que les isoprénoïdes (exemple: pristane, phytane) sont beaucoup moins nombreux. Ces composés se trouvent dans le pétrole brut dans des proportions sensiblement égales à celles des n-alcanes. Par contre le pétrole brut d’origine fossile ne contient en général pas d’alcènes.
* Les cycloalcanes: renferment des composés cycliques (à 5 ou 6 atomes de carbone) saturés et le plus souvent substitués. Quelques dérivés polycycliques sont aussi présents et certains d’entre eux tels les stéranes et les triterpanes sont caractéristiques d’un pétrole brut. Cette famille peut représenter entre 30 et 50 % des hydrocarbures totaux d’un pétrole brut.
Les hydrocarbures aromatiques Plusieurs familles d’hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques dont le nombre denoyaux varie de 2 à 6 sont présents dans les pétroles bruts. Ces composés sont dominés par des composés mono-, di- et tri-aromatiques (Neff, 1979). En général, les hydrocarbures aromatiques sont moins abondants que les alcanes, et ne représentent que 10 à 30 % des hydrocarbures totaux d’un brut pétrolier. Les composés alkylés sont, la plupart du temps, plus abondants que les molécules parentales dont ils dérivent. Certains cycles aromatiques peuvent être associés à des noyaux (cycle à 5 ou à 6 atomes de carbone) saturés (naphtéoaromatiques).
Les composés polaires Cette fraction correspond à des molécules hétérocycliques, telles que:
– des composés oxygénés: phénols, acides carboxyliques, alcools, aldéhydes,…
– des composés soufrés: mercaptans, sulfures, disulfures,…
– des composés azotés: pyridines, quinoléines,…
Les dérivés soufrés sont dans la plupart des cas plus abondants que les composés oxygénés ou azotés.
Les asphaltènes Les asphaltènes correspondent à une classe de composés de hauts poids moléculaires,insolubles dans le pentane ou l’hexane. La structure de ces composés est mal connue du fait, d’une part de leur composition chimique complexe (à base de cycles aromatiques condensés, de naphtéo-aromatiques, de ramifications et d’hétéroatomes (O, N, S), d’autre part de méthodes analytiques difficilement utilisables. Les métaux sont également présents mais à l’état de traces. Les plus abondants sont le vanadium et le nickel, mais du fer, du sodium, du cuivre et de l’uranium ont également été détectés.
Les hydrocarbures aliphatiques saturés
* Les alcanes linéaires (n-alcanes): Les n-alcanes sont des constituants prédominants dans la distribution des hydrocarbures dans l’environnement marin. Les espèces phytoplanctoniques et les macro-algues synthétisent des n-alcanes dont les longueurs de chaînes varient respectivement de n-C14 à n-C32 et de n-C20 à n-C30 (Saliot, 1981), avec un maximum à n-C15 ou n-C17 (Blumer et al. 1971; Gelpi et al., 1970; Clark et Blumer, 1967; Youngblood et al., 1971). Une distribution des n-alcanes sans prédominance paire / impaire a été observée chez les bactéries (C13 à C31) et les plantes inférieures terrestres (C15 à C23) avec un maximum dans la zone de C17 à C20 pour les bactéries (Han and Calvin, 1969; Oro et al., 1967). Cependant, les plantes supérieures synthétisent des n-alcanes de haut poids moléculaire (C23 à C33) à prédominance impaire.
* Les alcanes ramifiés: Les hydrocarbures isopréniques sont les plus fréquents dans l’environnement marin et ils présentent plusieurs origines (Saliot, 1981). Le pristane (2,6,10,14-21tetraméthylpentadécane) a été identifié en faible quantité chez les phytoplanctons, chez les macro-algues, les zooplanctons et pourrait être l’hydrocarbure majeur chez certaines bactéries anaérobies. Han et Clavin (1969), ont identifié le phytane (2,6,10,14-tetramethylhexadecane) en faibles concentrations chez des bactéries, qui a été aussi identifié chez des micro-algues (Volkman et al., 1980). On trouve également d’autres composés comme le 7-méthylheptadécane et 8- méthylheptadécane, identifiés chez les micro-algues. Ces alcanes portant une ramification méthyle sont absents chez les autres organismes et en particulier les bactéries. Cesdernières sont caractérisées par des hydrocarbures à courtes chaînes, avec une prédominance marquéede composés à nombre impair d’atomes de carbone et surtout ramifiés en position iso et antéiso (Kolattukudy, 1976). D’autres sources peuvent être également à l’origine des hydrocarbures ramifiés notamment les plantes dont les iso-alcanes pourraient constituer dans certains cas plus de 50 % des hydrocarbures totaux (Eglinton et al., 1962; Saliot, 1981).
Photo-oxydation
La photo-oxydation est observée au niveau de la surface de l’eau où l’air (oxygène) et la lumière (radiations solaires) sont présents pour la transformation des hydrocarbures (Payne 24 et Phillips, 1985). L’efficacité de ce phénomène dépend de la nature des hydrocarbures et de la présence de composés non hydrocarbonés (Bertrand et Mille, 1989). Ainsi, la photooxydation touche plus particulièrement les composés aromatiques qui sont plus photosensibles que les composés aliphatiques. Parmi ces derniers, les composés ramifiés sont plus facilement photo-oxydés que les n-alcanes (Rontani et Giusti, 1987). La photo-oxydation conduit à la formation de composés solubles dans l’eau (acides, alcools, cétones, peroxides et sulfoxides) et certains travaux de recherche ont montré leur toxicité pour les communautés microbiennes (Payne and Phillips, 1985; Larson et al., 1979; Maki et al., 2001) alors que Rontani et al. (1987, 1992), ont montré l’existence d’interactions entre la photo-oxydation et la biodégradation pour l’élimination des alkylbenzènes et de l’anthracène. L’action simultanée de ces deux phénomènes permet une élimination plus rapide de ces deux familles de composés.
Biodégradation des alcanes ramifiés
Les alcanes ramifiés sont généralement moins sensibles à la biodégradation, ce qui peut provoquer leur accumulation dans l’environnement. La présence d’un groupement méthyle en position β, va empêcher la β-oxydation, ce qui nécessite l’intervention d’un autre mécanisme comme l’α-oxydation ou une oxydation à l’autre extrémité. Chez certaines bactéries, la voie métabolique passe alors par la voie dite de « citronelleol »; c’est le cas de Pseudomonas citronellolis capable de dégrader le 2-octene, le 3,6-dimethyloctane et le 2,6- dimethyldecane (Figure I.10) (Fall et al., 1978), ainsi que chez plusieurs autres espèces Pseudomonas (Cantwell et al., 1978). L’augmentation du nombre de ramifications a pour effet de diminuer leur biodégradabilité (Davis, 1967; Foster, 1962; McKenna, 1972). Par contre une ramification en α n’empêche pas une β-oxidation (Rontani et Giusti, 1986; Schaeffer et al., 1979), c’est ce qui explique la biodégradation de composés polyramifiés de type isoprenoïque tel le pristane (2,6,10,14-tétraméthyl pentadecane) (Mckenna et Kallio, 1971; Pirnik et al., 1974; Rontani et al., 1986; Ko et Lebealt, 1999; Alvarez, 2003). L’oxydation des alcanes ramifiés commence généralement par le groupement méthyle terminal le plus éloigné de la ramification et l’acide gras formé est ensuite incorporé dans les lipides cellulaires. Par β-oxydation, la dégradation peut se poursuivre jusqu’à la ramification où une ω-oxydation sera alors nécessaire pour une minéralisation complète de l’alcane.
Etat physique et concentration des hydrocarbures ou du pétrole
Les hydrocarbures tendent à se dissiper dans l’eau formant ainsi des marées noires. Sous l’action du vent et des vagues, le pétrole dans l’eau et l’eau dans le pétrole peuvent former des émulsions, ce qui augmente la surface du pétrole et par conséquence favorise l’attaque microbienne. Par contre les grandes masses ou les nappes de mousse pétrolière de viscosité très importante et qui ont un rapport surface/volume faible inhibent la croissance. La formation d’émulsions par la production et la sécrétion de biosurfactants est un processus très important dans l’assimilation des hydrocarbures par les bactéries (Kaplan et al., 1987; Hommel, 1994; Goswani et Singh, 1991; Broderick et Cooney, 1982; Pines et Gutnick, 1986, Zhang et Miller, 1992). La dispersion artificielle a été étudiée comme moyen d’augmentation de la surface de contact entre les hydrocarbures et les membranes cellulaires des microorganismes, cependant, les dispersants sont dans la plupart du temps toxiques et peuvent conduire à des dommages dans la faune et la flore, et ils peuvent aussi inhiber le processus microbien (Leahy et Colwell,1990). Les hydrocarbures à faibles poids moléculaires sont considérés comme des composés toxiques pour les microorganismes à cause de leur grande solubilité et par conséquent leur concentration très élevée dans les phases aqueuses. Ratledge (1978) rapporte que les n alcanes de courtes chaînes (< C9) sont très toxiques pour les mircrooganismes alors que ceux plus longs que le n-nonane, les alcènes > C12, les alkyle-bromides > C10, et les alcanols > C14 ne sont toxiques pour aucun microorganisme. Broderick et Cooney (1982), ont montré que la dégradation des n-alcanes longs (≥ C12), pour lesquels les solubilités sont inférieures à 0,01 mg/l s’effectue à des vitesses qui dépassent les vitesses de dissolution des hydrocarbures et sont fonction de la surface des hydrocarbures disponibles pour l’émulsification et leur fixation par les cellules.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I Rappels bibliographiques
I. POLLUTION DE L’ENVIRONNEMENT MARIN PAR LES HYDROCARBURES
I.1. INTRODUCTION
I.2. FORMULES CHIMIQUES DES HYDROCARBURES DE DIFFERENTES SOURCES DANS LES ENVIRONNEMENTS MARINS
I.2.1. Les composés pétroliers
I.2.1.1. Les hydrocarbures saturés
I.2.1.2. Les hydrocarbures aromatiques
I.2.1.3. Les composés polaires
I.2.1.4. Les asphaltènes
I.2.2. Les hydrocarbures biogènes
I.2.2.1. Les hydrocarbures aliphatiques saturés
I.2.2.2. Les hydrocarbures aliphatiques insaturés
I.2.2.3. Les cycloalcanes et les cycloalcènes
I.2.2.4. Les hydrocarbures aromatiques
I.3. DEVENIR DES HYDROCARBURES EN MILIEU MARIN
I.3.1. Facteurs abiotiques dans l’élimination des hydrocarbures
I.3.1.1. Evaporation
I.3.1.2. Solubilisation
I.3.1.3. Emulsification
I.3.1.4. Sédimentation
I.3.1.5. Photo-oxydation
I.3.1.6. Biodégradation
I.3.2. Pénétration des hydrocarbures dans la chaîne alimentaire
II. BIODEGRADATION AEROBIE DES HYDROCARBURES PAR LES MICROORGANISMES
II.1. INTRODUCTION
II.2. PROCESSUS D’OXYDATION DES HYDROCARBURES
II.2.1. Voies métaboliques de la dégradation des hydrocarbures aliphatiques
II.2.1.1. Dégradation des n-alcanes
II.2.1.1.1. L’oxydation monoterminale
II.2.1.1.2. Oxydation des n-alcanes par le système de dioxygénase
II.2.1.1.3. Oxydation des alcanes via alcènes
II.2.1.1.4. Oxydation subterminale
II.2.1.1.5. Oxydation diterminale
II.2.1.2. Biodégradation des alcanes ramifiés
II.2.1.3. Biodégradation des alcènes
II.2.2. Voies métaboliques de dégradation des hydrocarbures saturés cycliques
II.2.3. Biodégradation des hydrocarbures aromatiques
II.3. FACTEURS PHYSIQUES ET CHIMIQUES AFFECTANT LA BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES
II.3.1. Composition chimique des hydrocarbures
II.3.2. Etat physique et concentration des hydrocarbures ou du pétrole
II.3.3. Influence de la température
II.3.4. Influence de l’oxygène
II.3.5. Influences des éléments nutritifs
II.3.6. Effet de la salinité et du pH
II.3.7. Effet de la pression
III. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES DANS LES GISEMENTS DE PETROLE ET VOIES ANAEROBIES
III.1. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES DANS LES PUITS DE PETROLE
III.1. VOIES DE DEGRADATION ANAEROBIE
IV. LES LIPIDES DES BACTERIES GRAM-NEGATIVES
IV.1. LES PHOSPHOLIPIDES
IV.2. LES LIPOPOLYSACCHARIDES
IV.3. INFLUENCE DES PARAMETRES ENVIRONMENTAUX SUR LA COMPOSITION LIPIDIQUE DES BACTERIES GRAM-NEGATIVES
IV.3.1. Influence de la température sur la composition lipidique
IV.3.2. Influence de la salinité sur la composition lipidique
IV.3.3. Influence de la source de carbone sur la composition lipidique
V. BIOMARQUEURS
V.1. NOTION DE BIOMARQUEURS
V.2. BIOMARQUEURS BACTERIENS
V.2.1. Les acides gras
V.2.1.1. Les acides gras saturés normaux
V.2.1.2. Les acides gras insaturés
V.2.1.3. Les acides gras ramifiés
V.2.1.4. Les acides gras cyclopropaniques
V.2.2. Les hydroxy acides
V.2.3. Autres marqueurs bactériens
V.3. LES HYDROCARBURES
CHAPITRE II Etude expérimentale
I. ORIGINE DES SOUCHES
II. MILIEUX ET CONDITIONS DE CULTURE
II.1. COMPOSITION CHIMIQUE DES MILIEUX DE CULTURES
II.2. CONSEVATION DES SOUCHES
II.3. CULTURE SUR HYDROCARBURES
III. SYNTHESE DES HYDROCARBURES
IV. EXTRACTION DES LIPIDES DES DIFFERENTES CULTURES
IV.1. ISOLEMENT DES LIPIDES FACILEMENT EXTRACTIBLES
IV.2. EXTRACTION DES LIPIDES EN MILIEU BASIQUE
IV.3. EXTRACTION DES ACIDES LABILES EN MILIEU ACIDE
V. SYNTHESE DU DIAZOMETHANE
VI. PREPARATION DES DERIVES DIMETHYL DISULFURES (DMDS)
VII. DETERMINATION DE LA POSITION DU GROUPEMENT HYDROXYLE DES HYDROXYACIDES ET DES ALCOOLs: PREPARATION DES DERIVES TRIMETHYLSILYLES
VIII. FORMATION DES DERIVES N-ACYL-PYRROLIDIDES
IX. REDUCTION CATALYTIQUE DES ACIDES GRAS INSATURES
X. METHODES UTILISEES POUR L’ANALYSE DES LIPIDES
X.1. CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE
X.2. CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE PAR IMPACT ELECTRONIQUE
CHAPITRE III Biodégradation de différentes familles d’hydrocarbures par Marinobacter hydrocarbonoclasticus: influence sur la composition lipidique et voies métaboliques
I. INTRODUCTION
II. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DE M. hydrocarbonoclasticus
III. HYDROCARBURES TESTES ET CULTURES
IV. PROTOCOLE D’EXTRACTION DES LIPIDES ET RESULTATS QUANTITATIFS
V. IDENTIFICATION ET DISTRIBUTION DES LIPIDES DE M. hydrocarbonoclasticus CULTIVEE SUR ALCANES NORMAUX (C19 ET C21)
V.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES EN SPECTROMETRIE DE MASSE
V.1.1. Esters méthyliques d’acides gras normaux saturés
V.1.2. Dérivés DMDS des esters méthyliques d’acides gras insaturés
V.1.3. Dérivés N-acyl pyrrolidides
V.1.4. Dérivés TMS des alcools gras saturés et insaturés
V.I.5. Dérivés TMS des esters méthyliques des β-hydroxy acides
V.1.6. β-Méthoxy acides
V.2. LIPIDES « NON LIES »
V.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE
V.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE
VI. CULTURE DE M. hydrocarbonoclasticus SUR HYDROCARBURES RAMIFIES
VI.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES
VI.2. LIPIDES « NON LIES »
VI.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE
VI.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE
VI.5. CONCLUSIONS PARTIELLES SUR L’INFLUENCE DES ALCANES LINEAIRES
VI.5.1. Influence de la parité des alcanes sur la composition lipidique
VI.5.2. Influence de la ramification des alcanes sur la composition lipidique
VI.5.3. Voies de dégradation des alcanes linéaires par M. hydrocarbonoclasticus
VII. CULTURE DE M. hydrocarbonoclasticus SUR ALCENE: n-NONADEC-1-ENE
VII.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES
VII.2. LIPIDES « NON LIES »
VII.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE
VII.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE
VII.5. CONCLUSIONS PARTIELLES SUR LA DEGRADATION DU NONADEC-1-ENE
VII.5.1. Influence sur la composition lipidique
VII.5.2. Voies métaboliques du n-nonadéc-1-ène
VIII. CULTURES DE M. hydrocarbonoclasticus SUR CYCLOHEXYLET PHENYL-ALCANES
VIII.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES
VIII.2. LIPIDES « NON LIES »
VIII.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE
VIII.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE
VIII.5. CONCLUSION PARTIELLE SUR LA DEGRADATION DES HYDROCARBURES CYCLIQUES PAR M. hydrocarbonoclasticus
VIII.5.1. Influence des cyclohexyl- et phényl-alcanes sur la composition en acides gras de M. hydrocarbonoclasticus
VIII.5.2. Voies métaboliques des cyclohexyl- et phényl-alcanes
IX. Les hydroxy acides indicateurs de l’activité bactérienne
X. CONCLUSION
CHAPITRE IV Influence de la source de carbone sur la composition lipidique de bactéries Gram-négatives, Marinobacter aquaeolei, Acinetobacter calcoaceticus et Pseudomonas oleovorans. Distribution des β-hydroxy acides de la membrane extérieure
I. INTRODUCTION
II. PRESENTATION DES BACTERIES ETUDIEES
II.1. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DE Marinobacter aquaeolei
II.2. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES D’Acinetobacter calcoaceticus
II.3. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DE Pseudomonas Oleovorans
III. RESULTATS QUANTITATIfs
IV. IDENTIFICATION DES LIPIDES
V. DISTRIBUTION DES LIPIDES DE M. AQUAEOLEI EN FONCTION DE LA SOURCE DE CARBONE ET COMPARAISONS AVEC M. hydrocarbonoclasticus
V.1. RESULTATS
V.1.1. Cultures sur acétate d’ammonium
V.1.1.1. Lipides « non liés »
V.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique
V.1.1.3. Lipides labiles en milieu acide
V.1.2. Cultures sur n-nonadécane
V.1.2.1. Lipides « non liés »
V.1.2.2. Lipides labiles en milieu basique
V.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide
V.1.3. Culture sur iso-nonadécane
V.1.3.1. Lipides « non liés »
V.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique
V.1.3.3. Lipides labiles en milieu acide
V.2. DISCUSSION
V.2.1. Influence de la nature de la source de carbone sur la composition lipidique
V.2.2. Variation de la composition en β-hydroxy acides
V.2.3. Métabolisme des hydrocarbures
VI. DISTRIBUTION DES LIPIDES D’A. calcoaceticus EN FONCTION DE LA SOURCE DE CARBONE ET COMPARAISON AVEC M. hydrocarbonoclasticus
VI.1. RESULTATS
VI.1.1. Culture sur acétate
VI.1.1.1. Lipides « non liés »
VI.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique
VI.1.1.3. Lipides labiles en milieu acide
VI.1.2. Culture sur n-nonadécane
VI.1.2.1. Lipides « non liés »
VI.1.2.2. Lipides labiles en milieu basique
VI.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide
VI.1.3. Culture sur iso-nonadécane
VI.1.3.1. Lipides « non liés »
VI.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique
VI.1.3.3. Lipides labiles en milieu acide
VI.2. DISCUSSION
VI.2.1. Influence de la nature de la source de carbone sur la composition lipidique
VI.2.2. Influence de la source de carbone sur la composition en alcools
VI.2.3. Variation de la composition en hydroxy acides
VI.2.4. Métabolisme des hydrocarbures
VII. INFLUENCE DE LA SOURCE DE CARBONE SUR LA COMPOSITION LIPIDIQUE DE Pseudomonas oleovorans 59.11T
VII.1. RESULTATS
VII.1.1. Culture sur acétate d’ammonium
VII.1.1.1. Lipides « non liés »
VII.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique
VII.1.1.3. Lipides labiles en milieu acide
VII.1.2. Culture sur n-octane
VII.1.2.1. Lipides « non liés »
VII.1.2.2. Lipides labiles en milieu basique
VII.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide
VII.1.3. Culture sur 2-méthylheptane
VII.1.3.1. Lipides « non liés »
VII.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique
VII.1.3.3. Lipides labiles en milieu acide
VII.2. DISCUSSION
VII.2.1. Influence de la source de carbone sur la composition lipidique
VII.2.2. Variation de la composition en β-hydroxy acides
VII.2.3. Métabolisme des alcanes courts par P. oleovorans
VIII. CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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