Soutenance mémoire
Immunité cellulaire
Les cellules présentes dans l’ hémolymphe qui jouent un rôle clé dans l’ immunité sont appelées hémocytes. Leur observation a donné lieu par le passé à différents types de classifications, selon leur morphologie, leur fonctionnalité ou encore leur reconnaissance avec des anticorps monoclonaux (Noël et al., 1994). La littérature reconnaît généralement la présence de deux types cellulaires principaux dans l’hémolymphe de la moule bleue. Ces types cellulaires se différencient visuellement par leur granularité : les cellules agranulaires sont appelées hyalinocytes tandis que les cellules granulaires sont les granulocytes (Cheng, 1981). Pipe et al. (1997) ont effectué des séparations des hémocytes par des gradients de « Percoll », dont les trois couches montraient respectivement des cellules basophiles, un mélange basophile et éosinophile et une couche majoritairement éosinophile. Les hyalinocytes se trouvaient dans la première couche et les granulocytes dans la 2e et la 3e couche, la 2e couche contenant majoritairement des cellules à petits granules que l’on peut considérer comme intermédiaires. Les hémocytes effectuent la majeure partie de la réponse immunitaire face à une infection par des actions directes sur les particules étrangères. Parmi les fonctions remplies par les hémocytes, la phagocytose des particules étrangères est l’une des plus importantes pour la défense de l’organisme (Noël et al., 1994). La réponse phagocytaire est parfois différente selon la nature des particules étrangères, ce qui pourrait être relié à une différence dans les antigènes de surface présents et les différents mécanismes de détection des cellules (Bayne et al., 1979). La phagocytose est souvent observée au microscope à partir de 1 h seulement après l’ajout de particules, et se poursuit ensuite jusqu’ à la saturation des cellules ou jusqu’ au captage de toutes les particules, qui sont toujours observables dans les cellules après 14 heures (Bayne et al., 1979). Selon certaines recherches, la majorité des cellules phagocytaires chez les bivalves sont les granulocytes (Pipe et al., 1997). Mais comment ces cellules détectent-elles les corps étrangers?Des protéines se liant de manière spécifique à des molécules de sucres, les lectines, pourraient jouer un rôle important dans ce mécanisme. La détection des lectines par des glycoprotéines à la surface des hémocytes entraînerait le chimiotactisme, c’ est-à-dire la migration des hémocytes vers un corps étranger, suivi de son absorption par phagocytose (Cheng et al., 1995). Puisque ce sont les granulocytes qui effectuent davantage de phagocytose, ces cellules sont également les plus susceptibles de détecter une plus grande variété de lectines, possédant par nécessité un système de reconnaissance des particules étrangères plus sophistiqué (Pipe et al., 1997). Elles devraient donc avoir une plus grande variété de glycoprotéines sur leur paroi cellulaire. Les lectines sont également appelées agglutinines par leur capacité à coaguler des cellules sanguines à une dose déterminée (Renwrantz et al., 1985). Dans des protocoles permettant de suivre les particules détectées jusqu’ à leur internalisation par les hémocytes, les particules de WGA « weat germ agglutinine » ont été détectées à l’ intérieur des plus grosses granules des granulocytes,tandis que les particules de PNA « pean ut agglutinine» présentaient plutôt une affinité pour l’hétérochromatine du noyau cellulaire (Pipe, 1990a). Ces différences pourraient faire état de chaînes de réactions distinctes et donc indiquer également des capacités cellulaires différentes déclenchées par la détection de ces particules.
Immunité humorale
L’immunité humorale des bivalves comprend surtout des peptides antimicrobiens, des enzymes hydrolytiques, des exopeptidases ou des agglutinines (Chu, 1988). Ces substances sont majoritairement produites dans les granulocytes et libérées dans l’ hémolymphe lors de l’infection. Les peptides antimicrobiens peuvent agir comme bactéricides à différentes étapes de l’ infection bactérienne et contre différents types de bactéries (Mitta et al., 1999). Très diversifiés, généralement de petite taille et cationiques, certains d ‘ entre eux ont également un effet fongicide (Charlet et aL, 1996). Les agglutinines ont la capacité de créer des liaisons non covalentes avec des glycoprotéines de surfaces sur les cellules qui peuvent provoquer leur agglutination. Les enzymes hydrolytiques catalysent des molécules par des réactions impliquant la lyse d’une molécule d’eau (Chu, 1988; de Almeida et al., 2007). La libération d’enzymes lysosomales par les hémocytes est, avec la production de ROS et NOx, un mécanisme essentiel pour lyser les pathogènes (Pipe, 1990b). Parmi les activités enzymatiques d’ intérêt pour l’ immunité des bivalves, l’ enzyme hydrolytique Iysosomale phosphatase acide a été détectée dans des granules présents dans tous les granulocytes et dans certains hyalinocytes de Mytilus galloprovincialis (Carballal et aL, 1997). Sa présence dans les hémocytes de Mytilus edulis est donc très probable. Puis, la leucine aminopeptidase est une protéase sérique capable de lyser les protéines et les peptides en coupant la portion aminoterminale au niveau de la leucine (Donald et aL, 2003; Matsui et al., 2006). Elle est reconnue pour son implication dans la régulation de la production d’ 0 2- et fait partie du processus d’adhésion cellulaire nécessaire à l’encapsulation des particules étrangères (Renwrantz et aL, 2009). Finalement, la proPhénoloxydase fait probablement également partie du système de défense de Mytilu edulis puisque son activité augmente dans le cas d ‘ infections bactériennes et de parasitisme léger à modéré chez plusieurs arthropodes et bivalves (Carballal et al., 1997a; Hong et al., 2006). Notons aussi que son activité peut aussi être stimulée lors d’ une blessure physique (Matsui et aL, 2006) et que différentes études ont montré chez plusieurs bivalves qu ‘ il pourrait s’agir d’ une forme préculirice de la phénoloxydase, d’abord synthétisée sous cette forme inactive mais potentiellement activée par un éliciteur qui pourrait être endogène ou encore exogène (Coles et Pipe, 1994).
Variation saisonnière de l ‘immunocompétence
L’un des aspects très important, mais souvent négligé lors de recherches sur les bivalves, est la variation temporelle de l’ immunocompétence. Par exemple, l’activité des hémocytes de Mytilus galloprovincialis présente une importante variation saisonnière, notamment par leur production d’oxyde ni treux et leur quantité de récepteurs d’Interleukine-2 (Cao et al., 2007). Les capacités immunitaires de la moule peuvent être modulées par de nombreux facteurs environnementaux, tant biotiques qu ‘ abiotiques. Parmi les facteurs abiotiques, la température et la salinité peuvent moduler le métabolisme et la réponse immunitaire de Mytilus edulis (Bussell et al., 2008). Chez l’huître par exemple, une augmentation soudaine de la température de l’eau de quelques degrés Celsius pendant une semaine peut avoir pour effet de diminuer la taille des hémocytes et leur capacité phagocytaire (Hégaret et al., 2003a; b). Bien que les bivalves soient des espèces capables de s’adapter à des variations importantes de température et de salinité, leurs hemocytes ont une activité plus stable avec une salinité d’environ 28%0 et une température autour de 15 oC, en se basant sur des observations de Hauton et al. (1998) pour Ostrea edulis.Parmi les facteurs biotiques, le cycle reproducteur est un facteur physiologique clé qui engendre une variation saisonnière de l’ immunité, car la gamétogénèse et la libération des gamètes demandent beaucoup d’énergie. Lemaire et al. (2006) ont d’ailleurs observé une baisse de la capacité phagocytaire, chez Mytilus edulis au Québec après la ponte. La disponibilité du phytoplancton comme source de nourriture peut également affecter grandement la quantité d’hémocytes présents dans l’hémolymphe (Carballal et al., 1998) et leur activité (Delaporte et al., 2006). La qualité de la nourriture est également importante, puisque la richesse en acide gras de l’alimentation influence directement la proportion que les hémocytes contiennent, ce qui leur confèrent une plus grande stabilité (Delaporte et al., 2003). La nourriture disponible peut donc constituer un facteur important, puisqu ‘ il est nécessaire d’avoir une nourriture suffisamment abondante pour subvenir aux besoins de la moule tant pour le cycle reproducteur que pour la défense de l’organisme.
Cellular immunity
Hemocyte analysis by flow cytometry Ali cellular analyses were done with a Flow cytometer FACSCAN (Becton, Dickinson) using the CellQuest Software (Becton, Dickinson). A minimum of 8000 events were recorded for each analysis. To characterize the hemocytes and disregard debris during cell analysis, a sample was incubated with SYBR Green (lnvitrogen 559657) a RNA/DNA specifie and fluorescent dye which permeates dead and live cells. The commercial solution of SYBR green was diluted with Dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma D8418) 1: 10 and added to samples (1: l 00) for a 10 minutes incubation in the dark. Then hemocytes were visllalized on the cytogram plotting Side Scatter height (SSC-H related to cell complexity) versus Forward Scatter height (FSC-H related to cell size) and could undoubtedly be discriminated from debris by their high nllclear content measurable by the FLI detector. The voltage settings of the flow cytometer as weil as the gate on the cytogram specifie to the hemocytes were saved and sllbsequently lIsed for ail further analysis of cellular fluorescence.
Cell counts Cell counts were do ne using known cytometer’s high flow rate and counting ail gated events (see above) for 90 seconds as described by Duchemin et al. (2008).
Viability assessment Each sample was analysed using Propidium Iodine (PI; Sigma P4170) according to Fourn ier et al. (2001). PI is a fluorescent DNA/RNA-specific dye that only permeates dead cells. A final concentration of lO Ilg/ml PI was added to 200 ilL of each pool. The PI fluorescence was measured in cell by the FL2 detector of the flow cytometer and the percentage of viable cells was calculated by deducting the percentage of dead cells detected by their fluorescence.
Phagocytic Index Protocol was adapted from Ouchemin et al. (2008) usmg Yellow Green latex FluoSpheres (Floresbrite YG, l.71/lm diameter). A ratio of 30 beads per cells (30: 1) were added to each samples placed in wells of a microplate gently centrifuged (300 g, 5 min.) before a 3-hour incubation in the dark. The supernatant was then discarded and the pellet was resuspended in a fixative solution composed of 0.2% sodium azide (S8032) and 0.5% formaldehyde. Results are expressed as phagocytic index, which is the relative percentage of efficient hemocytes having engulfed at least three beads. Percentage of cells having beads adhered to the cell walls without phagocytosis was evaluated by a 2 hour preincubation of a sample into 2% sodium azide according to Oelaporte et al. (2003). Reactive Oxygen species (ROS) and Nitrous Oxides (NOx) production Production of ROS and NOx was detected with specific molecular probes getting fluorescent in presence of ROS or NOx. OCFDA probe (Sigma 21884 in October andInvitrogen C400 in February and May because of technical problems) detects the ROS production and DAF-FM probe (Invitrogen 01821) is used to evaluate NOx production. Fluorescence was detected by the FL-l detector of the cytometer. The final dilution of both probes was 10 /lM with a stock solution prepared with 1: 1 0 DMSO. Stimulation of ROS and NOx production was promoted with Lipopolysaccharides (LPS) (Sigma L2880), BGlucan (Sigma L9634) or Zymosan (Sigma Z4250). Samples were exposed for 2 hours in the dark to 10 ug/mI LPS, 10 ug/ml B-Glucans or to 30 particles of Zymosan/cell, aIl diluted in filtered sea water (FSW). A control without stimulation was also made by omitting the stimulant before the incubation with each probe. Cytometer’s settings were saved and reused to ensure a constant sensitivity to quantify cell fluorescence (FU was 607 for ROS and 533 for NOx). However, in October, samples for the ROS cannot be compared to those from February and May since a different probe was used to detect them, as previously mentioned. The ROS and NOx production were expressed in arbitrary unit of fluorescence (A.U.). For graphical representation, results were expressed for each pool as a percentage of the fluorescence observed in comparison to the control (unstimulated) value (mean ± S.D.).
Discussion
Farming of Mytilus edulis in the province of Québec (eastern Canada) is a growing industry which currently involves a dozen fat·mers. Mortalities were first reported in 1975 and were still occurring regularly until a more resistant population was introduced (Myrand et al., 2000). Assessment of the immunity of these mussels could provide important observations regarding how they can face environmental stress and help determine what could triggers mortalities in other populations. The reproductive cycle is one of the most impoltant aspects that explains the seasonal variation of immunity (Santarem et al., 1994). In Eastern Canada, the blue mussel is spawning usually in June until end of July. Our data show that mussels in October had the lowest GSI, therefore demonstrating that they were free of gametes and had not yet started gametogenesis. Mussels sampled in February, however, had an intermediate GSI and the greatest variation in GSI between individuals within the sample. This suggests that at this moment gametogenesis was actively taking place within the mussel population. If developing gametes took up most of the energy in February, it is assumed that the energy available to the immune system was minimal at this period (Myrand et al., 2000). The mussels sampled in May had the highest GSI, indicating that the mussels were sexually mature and getting ready for spawning in June. A high hemocyte concentration in October could be associated with a complete recovery after 3 months following the end of spawning. During this period, chlorophyll concentration is high in Baie-de-Plaisance (Madeleine Nadeau, pers. comm) and this high fo od supply may have benefitted the mussels, allowing them to gain higher energy levels before the winter. Hemocyte count in May was 56% of what was measured in October, although most cells were viable in ail three periods. It seems that as the energy balance is shifted toward the mantle during gametogenesis (Delaporte et al., 2006), the hemocyte count in the hemolymph gradually gets lower. It may be the result of the migration of the hemocytes to the gamete to support gametogenesis (Cochennec-Laureau et al. , 2003). However, this lower hemocyte counts also suggests a potential diminution in immunocompetence as mussel health highly depends on the number of effective immune cells that can detect and destroy foreign material (Auffret et al., 2006). Since phagocytosis is the most efficient way of getting rid of foreign particles, a stable phagocytic index is very important to maintain immune capacity. In this study, hemocytes were slightly more efficient in the spring than in the fall (54 % and 37%). However, sorne authors reported that the phagocytic capacity in Mytilus edulis and other species like Crassostrea gigas was lower during spawning and reached a maximum in autumn (Lemaire et al., 2006; Duchemin et al., 2007). However, if we consider the THe taken in October and in May, more cells were capable of phagocytosis in October (estimated to be 296 000 cells per mL) th an in May (estit:\ated to be around 234 000 cells per mL), although these numbers are very close together. This means that the phagocytic capacity of the immune system is approximately the same in ail samples. Granulocytes are thought to be the main cell type responsible for phagocytosis (Goedken et al., 2004). Differences in phagocytic index measured could therefore be due to the proportion of each cell types. Ford et al. (1993) have previously observed that the migration of cells in the tissues of infected oysters occurs differently for the two cell types. Granulocyte migration in tissues have been confirmed to occur within gill mantle and connective tissue (Xue and Renault, 2001). Our study did not separate the hyalinocytes and the granulocytes, but according to the phagocytic index, there could be slightly more circulating granulocytes in May.The reactive oxygen specles production per hemocytes is required to eliminate phagocytised particles and our results show that the oxidative burst following similar stimulation was extremely variable from October to February. Other authors have also encountered these observations and for most of the research done with bivalves the greatest challenge is to deal with the important inter-individual variation, especially for the oxidative burst (Buggé et al., 2007). Nevertheless, the stimulation of the ROS production better reflects the efficiency of the oxidative burst in presence of phagocytised particles, which is why we realised in vitro stimulations of sam pied hemocytes with zymosan, LPS, beta glucans to mimic the presence of bacteria. In October, ail stimulants raised ROS production, even if the rise was not considered different from the control value. This seems to indicate an adequately working ROS system which could be able to respond adequately to an infection. On the contrary, adding zymosan, LPS or beta glucans in February hindered ROS production compared to the control group. How is this possible? One way of assessing those results is that the production of ROS can be reduced by the high production of antioxidants, which is used to prevent damage to the organelles by the oxidative burst (Buggé et al., 2007). 1t is also possible that the hemocytes had already been stimulated by the stress of physical manipulation alone and that adding a stimulant only triggered down regulation of this system (Delapotte et al., 2003). In May, however, the control signal is much lower than in February and stimulation raised the ROS production to at least 150% for beta-glucans from up to almost 300% for zymosan. This indicates that in May, the mussels were potentially more able of killing pathogens than in February
|
Table des matières
INTRODUCTION GÉNÉRALE
CHAPITRE 1 VARIATION SAISONNIÈRE DE L’IMMUNITÉ CELLULAIRE ET HUMORALE DE LA MOULE BLEUE, MYTILUS EDULIS
1.0 RÉSUMÉ EN FRANÇAIS
1.1 INTRODUCTION
1.2 MATÉRIEL ET MÉTHODE
1.3 RÉSULTATS
1.4 DISCUSSION
CHAPITRE 2 PHÉNOTYPAGE DES HÉMOCYTES DE LA MOULE BLEUE, MYTILUS EDULIS PAR L’UTILISATION DE LECTINES
2.0 RÉSUMÉ EN FRANÇAIS
2.1 INTRODUCTION
2.2 MATÉRIEL ET MÉTHODE
2.3 RÉSULTATS
2.4 DISCUSSION
DISCUSSION GÉNÉRALE
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Télécharger le rapport complet
