Soutenance mémoire
Validation de la chaîne analytique de criblage HRM et séquençage
But et projet de l’étude
Nous avons vu que le statut mutationnel somatique des gènes KRAS, BRAF et REGF est indispensable pour l’orientation des nouvelles thérapies ciblées dans certains cancers du colon et du poumon. Actuellement l’INCa subventionne 28 plateformes en France, dont notre laboratoire, pour les CBNPC sur la recherche des mutations des gènes REGF (Exons 18 à 21), KRAS, BRAF, HER2 et PI3KCA (9 PCR) et pour les CCR sur la recherche des mutations des gènes KRAS et BRAF (2 PCR). Par semaine, nous effectuons la recherche de mutations sur environ 50 échantillons. L’obtention d’un résultat fiable dans un délai compatible avec le traitement est notre priorité. Pour cela il nous a fallu mettre au point et valider une méthode permettant un criblage, des mutations, rapide et moins coûteux que le séquençage.
Criblage avant séquençage
La détection de mutations somatiques ne peut être effectuée que dans la tumeur. Indépendamment de l’accès à cette tumeur, l’analyse est gênée par :
– la contamination du tissu tumoral par des cellules normales du stroma (fibroblastes, lymphocytes, cellules endothéliales) dont le génotype est normal ;
– l’hétérogénéité intratumorale avec présence de la mutation dans un sous-clone de cellules uniquement ;
– l’existence de mutations à l’état hémizygote, présentes sur un seul des deux allèles seulement.
Tout cela a pour conséquence la nécessité de techniques de détection de ces mutations somatiques hautement sensibles (43). A la différence des recherches de polymorphismes, l’analyse de mutations somatiques nécessite soit un balayage complet de la séquence d’un gène, soit de quelques exons, ou dans le meilleur des cas de positions spécifiques (Hotspot). La mise au point de technique de criblage de mutations est d’une importance capitale pour la diminution des coûts et du temps d’analyse. Méthode de criblage pré-séquençage : (cf. figure 14) L’utilisation de la technique PCR-high resolution melting curve (PCR-HRM) permet, après validation par comparaison avec les résultats obtenus par séquençage d’une série importante d’échantillons, de ne séquencer plus que les prélèvements suspectés mutés.
Cette technique repose sur l’utilisation de molécules de type SYTO9, EvaGreen® ou ResoLight® qui fluorescent à 535nm uniquement lorsqu’elles s’intercalent dans le petit sillon de l’ADN double brin. La mesure de la spécificité de la réaction se fait par analyse de la courbe de fusion (Tm) du produit de PCR quantitative (amplicon): la montée en température d’une solution contenant l’amplicon et la molécule fluorescente provoque la dissociation du double brin d’ADN occasionnant une chute de la fluorescence liée à la « libération » de la molécule fluorescente devenant ainsi indétectable. La température de dénaturation du produit amplifié est caractéristique de sa composition en GC, de l’enchaînement de ses bases, de sa taille et de la composition en sel du milieu réactionnel. Avec la fusion à haute résolution, des amorces ou des sondes spécifiques ne sont pas nécessaires pour cibler les divers variants (amorces communes entre la PCRHRM et le séquençage), et ces variants peuvent être détectés indépendamment de leur position au sein du fragment. Cette technique ne permet pas de déterminer le type de mutations, mais permet de valider les profils HRM normaux comme non mutés sans que le séquençage soit nécessaire. Par contre, les profils HRM anormaux sont séquencés afin de confirmer la présence d’une mutation et de la typer.
PCR HRM : elle contient 2 périodes : les cycles de PCR (dénaturation de l’ADN en simple brin, hybridation des amorces avec l’ADN et synthèse de l’amplicon) avec 4 phases fluorescentes (1- amplicon non détectable, 2- phase exponentielle, 3- phase linéaire et 4- le plateau contenant des amplicons sauvages et/ou mutés) ; le test de fusion avec une dénaturation suivi d’une hybridation, pour créer, si présence de mutation, des hétérodimères (allèle sauvage hybridé avec allèle muté), et des homodimères (2 brins sauvages et/ou 2 brins mutés), suivi d’une augmentation progressive de la température permettant la dissociation des hétérodimères puis des homodimères , qui après analyse par le logiciel GeneScanning™ de Roche donne un profil HRM avec des groupes d’échantillons (Normal, 50 % hétérozygote, 20 % hétérozygote, 10 % hétérozygote et indéterminé).
Dans une démarche de qualité, nous avons effectué la validation de la méthode pour les gènes KRAS (exon 2), REGF (exons 18 à 21) et BRAF (exon 15) par une démarche et un ensemble d’opérations réalisées conformément aux exigences du § 5.5.2 de la norme NF EN ISO 15189:2007 et selon les recommandations du guide SH GTA 04 révision 00 avril 2011 (http://www.cofrac.fr/documentation/SHGTA 04). Cette validation technique a été effectuée sur les prélèvements colique et pulmonaire arrivés dans le laboratoire pour les dosages de routine, sur un STIC KRAS MOKAECM, un STIC REGF ERMETIC-2 et sur des prélèvements de CCR de patients marocains. Des contrôles de qualité externes sont organisés également pour un certain nombre de gènes afin de s’assurer de la justesse de notre technique.
Principe et intérêt de la technique de criblage
La technique consiste en l’analyse de la courbe de dissociation du produit de PCR : la montée en température d’une solution contenant l’amplicon et un fluorophore intercalant (EvaGreen®) provoque la séparation des brins anti-complémentaires de l’amplicon, et donc la «libération» du fluorophore et la diminution de la fluorescence. La température de dissociation du produit amplifié est caractéristique de sa composition en GC, de l’enchaînement de ses bases, de sa taille et de la composition en sel du milieu réactionnel ; ainsi, les mutations deviennent détectables car elles modifient la courbe de dissociation. La technique de criblage par qPCR-HRM (high resolution melting curve), permet d’éviter le séquençage inutile des ADN non mutés. Tout le contenu des exons est séquencé afin de rechercher des mutations de résistance rares ou de nouvelles mutations. Le mélange réactionnel de PCR (HRM Master Mix 2X®, Roche) contient une molécule fluorescente (EvaGreen®) qui fluoresce à 535 nm quand elle est intercalée dans l’ADN double brin. L’étape de distribution des échantillons et du mix, en plaques 96 puits, est automatisée (Evo75®, Tecan). Des échantillons de référence mutés (lignées cellulaires) ainsi que de l’ADN normal (placenta) sont inclus dans l’analyse en même temps que les échantillons à analyser. La PCR est ensuite réalisée sur le LightCycler® 480, (Roche). La mesure consiste en l’analyse de la courbe de dissociation (fusion) des produits de PCR grâce au logiciel GeneScanning (LightCycler® 480, Roche). Les profils de dissociation des échantillons à analyser sont comparés aux échantillons de référence, permettant de les classer en cas « normaux » ou « anormaux ». Par la suite, seuls les échantillons de profils anormaux ou douteux sont séquencés. La valeur prédictive négative de ce test est validée sur 250 échantillons, dans le but de ne pas séquencer les échantillons normaux. Bien que l’analyse de la qPCR-HRM se fasse en « point final », c’est à dire à la fin de la phase d’amplification PCR, la réaction présente une phase exponentielle qui permet de déduire la quantité d’ADN total initiale par rapport à un échantillon de référence et de mettre en évidence l’éventuelle présence d’inhibiteur de PCR. La PCR est réalisée sur une plaque de 96 puits. Chaque puits contient 18µl de mélange réactionnel préparé avec du Mix 2X®, des amorces sens et antisens diluées à 10µM, et de l’eau stérile, et 2µl d’ADN à amplifier. Les puits sont remplis en réalisant des duplicates. La plaque de PCR contient, en plus des ADN de patients, de placenta et de lignées mutées diluées, également des contrôles négatifs appelés « zéro déparaffinage » contenant les réactifs utilisés lors de l’action de la pronase, « zéro extraction » correspondant à l’extraction d’un puits vide et « zéro PCR » contenant uniquement le mélange réactionnel de PCR. Cette technique peut être considérée comme une première technique de mise en évidence d’altération génomique (Wittwer High résolution DNA melting Analysis 2009).
Le criblage par qPCR-HRM, pourquoi ?
Le séquençage est largement reconnu comme le « Gold Standard » en matière de mutations, mais sa sensibilité (20%) oblige à trouver d’autres méthodes de criblage.
La publication de Chen N et col. (44) confirme le rôle de référence du séquençage Sanger, signale son coût élevé, et plaide pour le développement de méthodes de criblage (screening methods). […] Extensive allelic heterogeneity necessitates analysis of all exons and splice sites to identify mutations for individual patients. Although Sanger sequencing is the gold standard for mutation detection, screening methods supplemented with targeted sequencing can provide a cost-effective alternative.
La chaîne analytique dans son ensemble
Le résultat d’une méthode qualitative n’apporte pas d’information sur la quantité de l’analyte, mais seulement sur sa présence ou non, ou l’identification de la caractéristique recherchée. Il est possible d’utiliser des techniques de biologie moléculaire développées en interne à partir de données issues de publications scientifiques et des bases de données internet (séquences, variants, logiciels d’analyses de séquences…).
La méthode de validation présentée suit les exigences du § 5.5.2 de la norme NF EN ISO 15189:2007 et les recommandations du guide technique d’accréditation de validation (portée B) de méthode en biologie médicale (SH GTA 04 – Avril 2011).
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Table des matières
I. Introduction au travail
A. Généralités – prise en charge actuelle des cancers
B. Epidémiologie
C. Initiation et développement des tumeurs solides
1. Cancérogenèse
a) Phase préclinique : état précancéreux et notion biologique de « haut risque »
b) Phase infraclinique
2. Tumorigenèse
a) Progression
a) TEM
3. Phase clinique
D. Cibles moléculaires en Oncologie Biologique
1. Fonctions des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeurs
2. Caractérisation des cellules tumorales / Synthèse
3. Cancer du poumon
4. Cancers colorectaux
5. Thérapies ciblées
6. Voie du REGF
a) Rappels fondamentaux sur le REGF – Inhibiteurs 1ère génération
b) Résistance aux traitements – Inhibiteurs de 2nde génération
7. La voie RAS/RAF/MEK/ERK
II. Validation de la chaîne analytique de criblage HRM et séquençage
A. But et projet de l’étude
B. Principe et intérêt de la technique de criblage
C. La chaîne analytique dans son ensemble
D. Définition des critères de performance pour la validation d’une méthode qualitative
1. Spécificité analytique
2. Sensibilité diagnostique
3. Domaine analytique
4. Contamination entre échantillons
5. Robustesse
a) La répétabilité
b) La reproductibilité
6. Stabilité des réactifs (si nécessaire)
7. Comparaison avec une méthode de référence
a) Corrélation avec le séquençage
b) Comparaison avec d’autres méthodes
c) Concordance avec les résultats nationaux
8. Validation de la méthode par publication dans des journaux scientifiques internationaux
9. Justesse
a) CQE
b) Comparaisons interlaboratoires
III. Bibliographie
