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Vecteurs à base de lipides modifiés
La synthèse de lipides permet aujourd’hui de disposer d’un panel de molécules, chimiquement modifiées ou synthétiques, qui peuvent présenter despropriétés d’auto-assemblage, formant des complexes supramoléculaires. C’est ainsi qu’une catégorie de vésicules incorporant ces lipides modifiés a été exploitée en tant que nanomédicaments pour véhiculer des molécules actives.
Les bolasomes
Ces vésicules sont constituées de molécules bolaamphiphiles (ou Bolas) comprenant 2 têtes polaires (identiques ou non) liées entre elles par une chaîne hydrocarbonée.Initialement extraits de microorganismes (archéobactéries), ces lipides sont désormais issus de synthèses chimiques leur conférant ainsi des propriétés de stabilité, de pureté ou de clivage adaptées aux applications désirées. En milieux aqueux, ces lipides sont notamment capables de former des vésicules monocouches MLM ( MonolayerLipid Membrane) de taille comprise 15 entre 24 et 120 nm accompagnée d’une architecture vésiculaire compacte. Le caractère bipolaire des bolas assure à la monocouche formée des propriétés surfaciques internes et externes différentes et modulables (en opposition aux liposomes dont les deux faces sont identiques). Cette ambivalence a été exploitée pour façonner des vecteurs répondant aux critères de la vectorisation de principes actifs [18-20] .
Les bioconjugaisons lipidiques
En utilisant la chimie de bioconjugaison développée par les biochimistes, les lipides ont été associés de façon covalente à des molécules actives, souvent hydrosolubles, dans le but d’augmenter leur caractère lipophile.
Ces bioconjugués lipidiques ( Lipid Drug Conjugates) assurent aux molécules associées une plus grande stabilité en milieu biologique, une diminution de leur toxicité, ou encore une distribution dans l’organisme différente des molécules parentes initiales. La liaison mise en place entre le lipide et la molécule active doit se cliver dans des conditions biologiques appropriées (action enzymatique), afin que cette dernière puisse recouvrer son activité biologique intrinsèque. Cette approche a été appliquée, comme seconde chance de vectorisation, à des molécules peu solubles et difficilement administrables chez l’Homme comme le paclitaxel [22,1].Toutefois, les bioconjugués en tant que tels ne forment généralement pas de structures auto-assemblées et doivent être incorporés dans des systèmes plus complexes, tels que des nanoparticules polymériques ou lipidiques, afin de promouvoirleurs propriétés pharmacocinétiques une fois injectés. Il faut cependant citer le concept particulier de la « squalénisation » développé par l’équipe de Couvreur [21]. Le squalène et des molécules actives, s’auto-associent spontanément sous forme de nanoparticules (de 60 à 300 nm) en milieu aqueux. L’organisation supramoléculaire de forme hexagonale, a permis l’encapsulation de plusieurs analogues nucléosidiques à activité antivirale (gemcitabine, Ara-C) ou d’agents anticancéreux (cisplatine ou paclitaxel). Les taux de charge en principes actifs dans cet arrangement très organisé sont élevés (de l’ordre de 30 à 50 %) comparés aux analogues lipidiques tels que les liposomes (3 à 8 %) ou les nanoémulsions (8 à 10 %)[22,1].
Les nanosphères et les nanocapsules lipidiques
Les nanoémulsions
La conception des nanosphères ou nanocapsules lipidiques repose sur la formation d’une nanoémulsion à savoir un mélange de deux liquides non miscibles, conduisant à la dispersion d’un liquide (phase dispersée) dans l’autre (phase continue), sous la forme de nanogouttelettes stabilisées par des tensioactifs (figure 3).
Parmi les différentes émulsions développées, celles utilisées pour la délivrance de médicaments sont généralement des nanoémulsions d’huile dans l’eau (H/E) dont les fines gouttelettes d’huile (20 à 200 nm) incorporent les principes actifs. Ces émulsions « classiques » furent les premiers systèmes introduits dès les années 1950. Leur faible taille a tout d’abord permis de les utiliser pour le transport et la délivrance de lipides par voie systémique dans le cadre de la nutrition parentérale. Leur utilisation comme nanocargos fut ensuite très vite envisagée. Cependant, ces systèmes souffrent généralement de problèmes de stabilité. Il faut rappeler que d’un point de vue thermodynamique, les (nano)émulsions sont des systèmes métastables pouvant cependant présenter une stabilité cinétique allant de quelques mois à quelques années. Cette caractéristique de stabilité cinétique conduit souvent à une confusion entre les nanoémulsions et les microémulsions ces dernières étant caractérisées par une stabilité thermodynamique.Enfin, ces systèmes ne permettent pas d’obtenir des relargages prolongés des molécules encapsulées à cause de la faible viscosité de la phase dispersée, d’un très grand ratio surface/volume, ainsi que de la faible rigidité de la membrane de tensioactifs. Ces caractéristiques conduisent ainsi généralement à une fuite rapide des molécules encapsulées vers la phase continue. Comme nous le verrons plus tard, une compréhension fondamentale de ces systèmes a permis de mettre en œuvre des stratégies de formulation pour l’obtention de stabilités colloïdales conséquentes. Parallèlement, la rigidification de la membrane detensioactifs a permis d’améliorer le contrôle de la cinétique de relargage des espèces encapsulées [23,24]
Les microémulsions
Les microémulsions (appelées aussi micelles gonflées) sont par contre, des systèmes à l’équilibre thermodynamique formés par auto-assemblage spontané. Comme les nanoémulsions, elles sont formées de deux liquides non miscibles (huile et eau), d’un tensioactif, et éventuellement d’un cotensioactif. Cependant, la dissolution de molécules amphiphiles et d’huile dans l’eau, par exemple, conduit à l’obtention d’une phase unique, optiquement isotrope, de micelles gonflées, définissant l’état d’équilibre thermodynamique du système. D’un point de vue énergétique, le système est stable, c’est-à-dire que sa séparation en 2 phases macroscopiques d’huile et d’eau n’abaisserait en rien son énergie libre. Les microémulsions ne sont donc pas des émulsions au sens thermodynamique.
Les nanoparticules lipidiques solides
Les nanoparticules lipidiques solides SLN (Solid Lipid Nanoparticules) ont alors été proposées pour passer outre les limitations classiques des nanoémulsions. De structure identique aux nanoémulsions, ces systèmes se singularisent par l’utilisation de lipides cristallins pour former le coeur des particules, ce qui leur confère un caractère solide [25-27].Les SLN sont ainsi généralement composées de triglycérides à longues chaînes, de cires ou encore d’acides carboxyliques à longues chaînes alkyles. Comme les nanoémulsions, ces particules peuvent être stabilisées par de nombreux tensioactifs ; leur choix reposant principalement sur la voie d’administration envisagée. La fabrication des SLN consiste à disperser finement la phase huileuse dans la phase aqueuse, puis à faire cristalliser la phase lipidique. Pour cela, la phase lipidique est chauffée au-dessus de la température de fusion des lipides, afin de faciliter la réduction de la taille des particules. La cristallisation des lipides a ensuite lieu suite au refroidissement des échantillons et/ou au cours du stockage. La solidification des lipides permet d’obtenir un relargage prolongé des molécules encapsulées par diffusion. Cependant, comme nous le détaillerons plus tard, les taux d’encapsulation effectifs sont généralement plus faibles qu’avec les nanoémulsions car la cristallisation des lipides conduit généralement à l’expulsion d’une grande partie des molécules initialement encapsulées [28].
Vecteurs lipidiques nanostructurés
Les vecteurs lipidiques nanostructurés NLC (NanostructuredLipid Carriers) furent ainsi introduits comme une sorte de compromis entre ces deux premiers systèmes. Leur cœur lipidique est constitué d’un mélange de lipides de natures chimiques et physiques très différentes, comme un mélange de lipides solides et liquides [22].
Cela permet d’obtenir de meilleurs taux d’encapsulation, en limitant la cristallinité des lipides, tout en permettant l’obtention de relargages prolongés grâce au caractère solide de la phase lipidique. Plusieurs structures de NLC peuvent théoriquement être obtenues (figure 4) [28] :
NLC de type cristal imparfait (imperfect type), dont la cristallinité est réduite en créant des imperfections dans l’arrangement cristallin ;
NLC de type amorphe (structureless type), qui est solide mais amorphe ; NLC de type multiple d’huile dans cire dans eau (multiple oil in at in water type), dans lequel de petites gouttes de lipides liquides sont emprisonnées dans une matrice de lipides solides.
Alors que le premier type est largement répandu, l’obtention des deux autres structures est encore sujette à débat. Certains auteurs apportent ainsi l’obtention de lipides en surfusion liquide, au lieude l’obtention d’une matrice solide amorphe concernant le second type ; ou encore l’obtention d’une séparation de phase complète entre lipides liquides et solides sous la forme de structures en ‘nanocuillères’ dans le cas du troisième type [31-34].
Les nanoparticules lipidiques de cœur amorphe
A mi-chemin entre les nanovecteurs SLN et NLC, des nanoparticules lipidiques de coeur amorphe, nommées Lipidots, ont été développées par le CEA (figure 5) [37-39]. Leur coeur est composé d’un mélange d’huile et de cire, solide à température ambiante et qui, sous l’effet du confinement nanoparticulaire, se trouve dans un état amorphe (c’est-à-dire solide ou liquide sans structure cristalline) de viscosité variable selon, la proportion huile/cire initialement introduite [41].
Cette caractéristique confère au système des propriétés physico- chimiques modulables pour l’encapsulation et le relargage d’actifs [41]. Originellement conçues pour encapsuler des fluorophores lipophiles au service de l’imagerie de fluorescence (DiD, DiO, DiR, vert d’indocyanine), ces particules ont été utilisées très rapidement pour la délivrance de principes actifs (anticancéreux, photosensibilisateurs, anti-inflammatoires…) en répondant aux exigences du cahier des charges des nanomédicaments. Leur procédé de fabrication se fait par émulsification en utilisant les ultrasons (ultrasonication) ou l’homogénéisation haute pression comme source d’énergie et est ainsi industrialisable à bas coût et sans résidu chimique. Enfin, la membrane lipidique des nanoparticules lipidiques peut être volontairement rigidifiée afin de gagner en stabilité colloïdale : c’est ainsi que l’on distingue les nanocapsules lipidiques, des nanosphères décrites ci-dessus. Elles sont formulées à partir de microémulsions en mettant à profit certaines propriétés topologiques micellaires de tensioactifs s’exerçant sous effet thermique [42]. L’étape ultime de leur fabrication consiste en une dilution par trempe dans l’eau très froide (4oC) figeant les lipides à la surface et générant des nanocapsules structurellement très stables [33]. Par ailleurs, le choix des constituants du coeur et de la membrane a permis l’encapsulation de principes actifs à caractère lipophile (taxane, étoposide, chlorydrate de doxorubicine, tamoxifène…), hydrophile (insuline, siRNA, ADN, peptides) et amphiphile (amiodarone) [33-35].
Les liposomes : développement, compositionet classification
La première description des systèmes phospholipidiques comme modèles membranaires, a été publiée par Alec Bangham et ses collègues dans les années1960. Ces systèmes ont été ensuite nommés « liposomes ». Le terme « liposome » est dérivé de deux mots d’origine grecque, « lipos » qui signifie gras et« soma » qui signifie corps. Les liposomes (figure 13) sont définis comme des vésicules lipidiques sphériques avec une taille allant de 20 nm à quelques micromètres. Ils sont constitués d’une ou plusieurs bicouches phospholipidiques entourant des compartiments aqueux, où les groupes de têtes polaires sont orientés vers les phases aqueuses intérieures et extérieures. Les liposomes ont été principalement utilisés comme modèles de membranes artificielles imitant les membranes phospholipidiques pour l’étude des mécanismes de transport et de diffusion à travers la membrane et des caractéristiques physicochimiques de la membrane dans des conditions différentes de température et de pH[1].
Développement des liposomes
Dans les années 1970, plusieurs études ont établi le concept que les liposomes peuvent encapsuler des substances et être utilisés comme systèmes de transport. D’autres études, ont montré que les liposomes peuvent changer la distribution in vivo des médicaments encapsulés En parallèle, des méthodes ont été développées pour permettre la préparation de larges liposomes unilamellaires (LUV) avec des améliorations de l’efficacité d’encapsulation et de l’homogénéité (Szoka and Papahadjopoulos 1978). La production des LUV par extrusion des vésicules multilamellaires (MLV) à travers des membranes de polycarbonate avec des pores de dimensions inférieureou égale à 100 nm a été un progrès très important. Dans les années 1926 et 1990, des progrès dans la formulation des liposomes ont été obtenus afin de prolonger leur durée de vie dans la circulation sanguine. On distingue ainsi les liposomes furtifs ayant une barrière stérique créée tout autour de la bicouche lipidique le plus souvent par des polymères hydrophiles comme le polyéthylène glycol (PEG) couplés par des liaisons covalentes aux phospholipides membranaires. Les immunoliposomesqui portent à leur surface des anticorps spécifiques de cibles antigéniques et pouvant être furtifs aussi, se fixent spécifiquement à la surface des cellules cibles (cellules tumorales par exemple). Parallèlement, les LUV ont été utilisés comme modèle membranaire pour étudier l’effet de certaines molécules ayant un intérêt biologique, pharmacologique ou thérapeutique ou de certains facteurs comme la taille et la composition des liposomes sur la perméabilité de la membrane biologique. Ils sont utilisés aussi pour étudier l’effet de certaines molécules bioactives sur la morphologie et les propriétés surfaciques des membranes lipidiques. Une approche robotique pour la construction d’un modèle cellulaire artificiel au niveau moléculaire a été récemment proposée Ce modèle est basé sur les liposomes géants dont la membrane est connue comme le modèle le plus simple de membrane de cellules vivantes. Le système ainsi nommé « robotique moléculaire », est constitué d’un liposome géant (GUV) encapsulant un gène pour permettre la synthèse des protéines membranaires, d’une formule moléculaire artificielle à base d’ADN utilisée pour attacher les liposomes à la membrane des cellules vivantes et de molécules peptidiques membranaires et artificielles qui entrent dans les processus de reconnaissance de surface et de signalisation cellulaire.
Classification des liposomes
Selon les critères morphologiques
Elle est principalement basée sur leur taille et leur lamellarité (nombre de bicouches)
On distingue alors :
les liposomes unilamellaires qui sont formés d’une seule lamelle ou bicouche concentrique enfermant un compartiment aqueux et, les liposomes multilamellaires qui ont une structure en forme d’oignon qui sont formés de plusieurs lamelles ou bicouches concentriques séparées par des couches de compartiments aqueux.Parmi les vésicules unilamellaires, on peut différencier celle de petite taille (20-100nm) ou «smallunilamellarvesicles, SUV», les vésicules de grande taille «Large unilamellarvesicles, LUV» dont la taille varie de 100 à 1000nm et les vésicules géantes «giantunilamellarvesicles, GUV» dont la taille est généralement supérieure à 1000nm (1µm).
Les vésicules multilamellaires «multilamellarvesicles, MLV» comptent plusieurs bicouches concentriques et ont environ un diamètre compris entre 1 μm et 10 μm alors que les vésicules 24 multivésiculaires «multivesicularvesicles, MVV» sont formées de plusieurs bicouches non concentriques emprisonnées dans une vésicule plus grosse. Les liposomes classés selon leurs critères morphologiques sont représentés dans le tableau III et leurs structures représentées sur la figure 6 suivante[47 -49].
Selon leur composition et leur application in vivo
Suivant cette classification on distingue :
Liposomes conventionnels
Ils peuvent être définis comme des liposomes typiquement composés de phospholipides(neutres ou chargés négativement) et/ou de cholestérol.La plupart des liposomes utilisés comme vecteurs de médicaments sont des liposomes conventionnels.Ils sont caractérisés par un temps de circulation sanguine relativement court.En effet¸après administration in vivo(par voie parentérale le plus souvent), on observe une captation rapide de ces liposomes par les cellules phagocytaires(macrophages) du système réticulo-endothélial. Ils s’accumulent alors dans le foie et la rate principalement.La capture naturelle des liposomes par les macrophages permet leur utilisation pour cibler et délivrer des agents antimicrobiens à un certain nombre de microorganismes infectieux. Plusieurs vaccins sont élaborés¸et même commercialisés¸à partir de ces liposomes conventionnels[50].
Liposomes furtifs
L’élimination rapide des liposomes conventionnels de la circulation sanguine, par les macrophages du foie et de la rate, a sérieusement compromis leur application pour un grand nombre de traitements concernant l’affection d’autres tissus [38]. A la fin des années 26, la découverte de liposomes dits furtifs, a élargi les potentialités thérapeutiques des liposomes, grâce à l’amélioration de leurs temps de circulation dans l’organisme.
Le principe de ces liposomes est de réduire les interactions avec les protéines plasmatiques et d’échapper à la phagocytose par les cellules du système réticulo-endothélial, en modifiant leur membrane [39]. Pour cela,la création d’une barrière stérique tout autour de la bicouche lipidique est réalisée avec des résidus sialiques (gangliosides ou sphingomyéline) ou grâce à des polymères hydrophiles (polyéthylène glycols ou PEG) couplés de façon covalente aux phospholipides membranaires[1]. Les liposomes ainsi obtenus se caractérisent par une grande stabilité en milieu biologique (fuite limitée du contenu) et conduisent à des résultats pharmacocinétiques ou pharmacologiques prometteurs.
Immunoliposomes
Ce sont des liposomes qui portent à leur surface des anticorps ou des fragments d’anticorps spécifiques d’une cible antigénique et pouvant contenir différents composés à activité biologique. Grâce à ce système de vectorisation et de protection des molécules encapsulées, il est possible de fixer spécifiquement ces liposomes à la surface des cellules cibles (tumorales par exemple) et d’y relarguer leur contenu[39].
Plusieurs études ont été réalisées ou les immunoliposomes sont également rendus furtifs afin de prolonger leur demi-vie dans l’organisme et de favoriser leur passage vers les tissus ciblés.
Liposomes cationiques
Les liposomes cationiques sont utilisés dans une nouvelle technique de transfection cellulaire appelée lipofection. Du fait de leur nature lipidique et de leurs propriétés d’encapsulation de grosses molécules, les liposomes cationiques sont des candidats potentiels au transfert de gènes et font l’objet, depuis une vingtaine d’année, d’études intensives comme véhicule d’ADN. Ces liposomes sont composés d’un lipide cationique synthétique, le DOTMA (Dioleyloxypropyl-trimethylammonium). Les liposomes cationiques et l’ADN interagissent spontanément par interaction de charges pour former un complexe de grande taille (environ 500nm) chargé positivement. Certains auteurs ont proposé comme mécanisme d’action probable de la transfection, une fusion des lipides DOTMA / DOPE avec la membrane plasmique cellulaire et/ou les vésicules intracellulaires suivie de la libération de l’ADN dans le cytoplasme[55].
Composition des liposomes
Les liposomes sont constitués en général de un ou plusieurs types de phospholipides. Le cholestérol entre souvent dans la composition des liposomes.
Les phospholipides
Etant les constituants majeurs de la membrane biologique, les glycérophospholipides sont généralement les phospholipides qui forment les liposomes. Les glycérophospholipides sont soit d’origine naturelle (lécithines de soja ou de jaune d’œuf) soit d’origine synthétique (phosphatidylcholine¸ phosphatidylsérine¸ phosphatidylglycérol, phosphatidyléthanolamine…). Ces derniers possédant deux chaînes hydrocarbonées généralement de 14 à 18 atomes de carbone [54]. Ils sont formés à partir du glycérol¸ pour lequel deux fonctions alcool ont étéestérifiés par des acides gras et constitue la zone hydrophobe (queue apolaire) de la molécule de phospholipide. La troisième fonction alcool porte un groupement polaire qui constitue la zone hydrophile (tête polaire) de la molécule de phospholipide. Ce sont donc des molécules amphiphiles.Des sphyngolipides comme les sphyngomyélines peuvent entrer aussi dans la composition des liposomes (figure 7).
Il existe une grande variété de phospholipides qui diffèrent entre eux par la longueur de la chaîne hydrocarbonée des acides gras, par la charge de leur tête polaire par le degré de saturation des chaînes lipidiques et par la position d’un acide gras sur C-1 [55].
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Table des matières
Introduction
Première partie : Généralités sur les liposomes
I. Historique
II. Les vecteurs lipidiques
II.1 Les lipides constituants des vecteurs lipidiques
II.2 Les liposomes
II.3 Vecteurs à base de lipides modifiés
II.3.1 Les bolasomes
II.3.2 Les bioconjugaisons lipidiques
II.3.3 Les nanosphères et les nanocapsules lipidiques
II.3.3.1 Les nanoémulsions
II.3.3.2 Les microémulsions
II.3.3.3 Les nanoparticules lipidiques solides
II.3.3.4 Vecteurs lipidiques nanostructurés
II.3.3.5 Les nanoparticules lipidiques de cœur amorphe
III. Les liposomes : développement, compositionet classification
III.1 . Développement des liposomes
III.2 . Classification des liposomes
III.2.1 Selon les critères morphologiques
III.2.2 Selon leur composition et leur application in vivo
III.2.2.1 Liposomes conventionnels
III.2.2.3 Immunoliposomes
III.2.2.4 Liposomes cationiques
III.3 Composition des liposomes
III.3.1 Les phospholipides
III.3.2 Les stéroïdes
IV. Méthodes de préparation des liposomes.
IV.1 Les méthodes de dispersion mécanique des phospholipides
IV.1.1 L’hydratation du film lipidique
IV.1.2 La sonication
IV.1.3 L’extrusion
IV.1.4 Presse de french (French pressure cell)
IV.1.5 La microfluidisation
IV.2 Méthodes basées sur l’élimination du solvant organique
IV.2.1 Evaporation en phase inverse
IV.2.2 Injection d’une solution éthanolique de phospholipides /infusion d’éther
IV.3 Méthodes basées sur l’utilisation de détergents : Dispersion demicelles mixtes
IV.4 Méthodes utilisant des liposomes pré-formés
IV.4.1 Congélation-décongélation («Freeze-thaw method»)
IV.4.2 Lyophilisation – réhydratation («Freezedrying method»)
Deuxième partie : Utilisations des liposomes en thérapeutique et en diagnostique
I.1 Utilisations en cancérologie
I.1.1 Utilisations dans le traitement des cancers du sein
I.1.2 Utilisation dans le traitement des cancers du pancréas
I.1.3 Utilisations dans le traitement de la leucémie
I.1.4 Utilisation dans le traitement d’autre types de cancers
I.1.4.1 Les immunoliposomes
I.1.4.2 Les magnetoliposomes
I.1.4.3 Les liposomes pégylés
I.2 Utilisations des liposomes en infectiologie
I.2.1 Utilisations des liposomes dans les affections fongiques
I.2.2 Utilisations des liposomes en virologie et en bacteriologie
I.3 Utilisations des liposomes en thérapie génique
I.4 Utilisations des liposomes en médecine vétérinaire
I.5 Utilisations des liposomes en cosmétologie
I.6 Utilisations des formes liposomales commerciales
II. Utilisations des liposomes en diagnostic
II.1 En infectiologie et dans les inflammations
II.2 En cancérologie
II.3 En échographie
Conclusion
References
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