Utilisation du kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K 20

METHODOLOGIE

Lieu d’étude 

L’étude s’est déroulée au Centre National de Transfusion Sanguine (CNTS) de Bamako, structure de référence pour les produits sanguins et apparentés.

Création et missions du CNTS

Le CNTS a été créé par l’ordonnance n° 0041/PRM du 20 septembre 2000.
Il existait déjà en août 1960 la banque de sang de l’hôpital du point G.
Le 16 décembre 1964, nous assistons à l’inauguration de la banque nationale de sang.
Le CNTS a pour missions de collecter, conditionner, analyser et conserver le sang et ses dérivés en vue de les distribuer aux établissements sanitaires publics et privés qui en expriment le besoin.
Il veille à la coordination et au contrôle de l’activité des banques de sang des hôpitaux nationaux et régionaux.
Il a pour rôle d’élaborer et de conduire une politique transfusionnelle du pays en veillant à l’application correcte des textes réglementaires en la matière.
Il est chargé de : sensibiliser, recruter et fidéliser les donneurs, effectuer des analyses biomédicales et des expertises médico-légales, réaliser des études et de recherches dans les domaines de sa compétence, participer à la formation universitaire des étudiants et stagiaires ainsi qu’à la formation continue des cadres. Situation géographique : le CNTS est situé en commune II du district de Bamako dans le quartier de Quinzambougou près du commissariat de police du 3ème arrondissement.

Organisation et fonctionnement du CNTS

L’organisation et les modalités de fonctionnement du CNTS sont fixées par le décret nO0587/PRM du 23 septembre 2000 qui abroge les dispositions du décret no0-38/PRM du 5 juin 1990.
Le bâtiment est divisé en trois parties, une partie pour l’administration, une partie pour le laboratoire et ses différentes sections, et une partie pour la collecte et la préparation.
Les activités menées par le CNTS sont :
􀂾 collecte (mobile ou en cabine fixe),
􀂾 sélection des donneurs,
􀂾 validation biologique des produits sanguins,
􀂾 fractionnement, conservation et distribution de ces produits sanguins,
􀂾 analyses biologiques des patients externes,
􀂾 encadrement des thèses d’étudiants en médecine et pharmacie,
􀂾 la formation pratique des étudiants et élèves des écoles de santé,
􀂾 ouvert 24H/24H.
Le CNTS est animé par un personnel constitué essentiellement de:
􀂾 un directeur spécialiste en immuno-hématologie et en transfusion sanguine, chargé de la coordination de toutes les activités du centre,
􀂾 trois médecins dont un adjoint au directeur du centre, et deux chargés de la collecte,
􀂾 un pharmacien responsable de l’assurance qualité,
􀂾 neuf techniciens supérieurs de santé affectés aux analyses biologiques,
􀂾 trois infirmiers,
􀂾 trois contractuels,
􀂾 un agent comptable,
􀂾 deux contrôleurs du trésor,
􀂾 une caissière,
􀂾 une standardiste,
􀂾 une cuisinière,
􀂾 un manoeuvre et un gardien.

Type d’étude et période d’étude

Il s’agit d’une étude descriptive qui s’est déroulée pendant la période de janvier à décembre 2004.

Population d’étude 

L’étude a concerné une population fréquentant le Centre National de Transfusion Sanguine de Bamako pour des analyses de l’électrophorèse de l’Hb.

Critères d’inclusion 

Ont été inclus dans notre étude : les patients venus au CNTS pour une analyse de l’électrophorèse de l’Hb, les patients ayant donné leur consentement éclairé pour participer à notre étude.
Critères de non inclusion : les patients venus au CNTS pour une analyse différente de l’électrophorèse de l’Hb, les donneurs de sang, les patients venus après notre période d’étude, les patients qui n’ont pas donné leur consentement éclairé.

Echantillonnage

L’échantillonnage a été de type exhaustif, par conséquent la taille de l’échantillon n’a pas été fixée à l’avance. Nous nous sommes intéressés à tous les patients arrivés pendant notre période d’étude.
Aspect éthique : les patients ont donné leur consentement éclairé (verbal). Pour les enfants, nous avons eu l’assentiment parental (verbal).
Nous avons gardé l’anonymat et les résultats ont été confidentiels. De même, les droits du patient ainsi que la dignité humaine ont été respectés.
A tout moment ils pouvaient demander à sortir de l’étude. Il n’y avait aucune pression sur eux.
Après adhésion volontaire de chaque patient, une fiche d’enquête a été remplie pour notre échantillonnage.

Paramètres étudiés

Pour chaque patient, nous avons retenu l’âge, le sexe, l’ethnie, le motif clinique ayant aboutit à la demande de l’électrophorèse de l’Hb et enfin le phénotype hémoglobinique.

Méthode

Nous avons pratiqué l’électrophorèse de l’Hb chez tous les patients en tampon alcalin. Pour cela nous avons utilisé le kit hydragel des laboratoires SEBIA.

Utilisation du kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20

Il permet la séparation des Hb normales (A et A2) et la détection des principales Hb anormales : S ou D et C ou E, par électrophorèse sur gel d’agarose. L’analyse est réalisée sur l’hemolysat des GR lavés.
Les Hb sont séparées en tampon alcalin (pH=8,5), fixées par la chaleur ou en milieu alcool/acide et colorées par une solution d’amidoschwarz.
Le gel est alors prêt pour l’identification des différentes Hb. L’analyse qualitative des Hb normales et anormales peut être réalisée.
La densitométrie donne une qualification relative précise de chaque zone individualisée dont les Hb présentant un intérêt particulier, tel que A2 pour le diagnostic des bêtas thalassémies.
Chaque gel d’agarose contenu dans le kit HYDRAGEL HB(E) K20 est prévu pour l’analyse de sept échantillons.

Principe du test

La structure spatiale de l’Hb dépend de la nature et de la séquence des a.a constituant les chaînes. Les liaisons qui se forment entre les différents a.a sont responsables de la forme de la molécule, de sa stabilité et de ses propriétés. Placées dans un champ électrique, les Hb se déplacent en fonction de leur charge, de la taille de la molécule, de la force ionique, du pH du tampon et de la nature du support. Les variants de l’Hb sont dus à des mutations de certains a.a entraînant des charges de surface différentes et donc des mobilités différentes en électrophorèse.

Gels d’agarose

Ils sont prêts à l’emploi. Chaque gel contient :
􀂾 agarose (8g/dl),
􀂾 tampon alcalin (pH=8,5),
􀂾 composant sans danger aux concentrations utilisées,
􀂾 accessoires pour des performances optimales.
Ces gels sont utilisés comme supports pour l’électrophorèse de l’Hb.
La conservation se fait à température ambiante (15° à 30°C) ou au réfrigérateur (2° à 8°C).

Tampon

Chaque flacon de tampon concentré doit être complété à un litre avec de l’eau distillée ou déminéralisée. Après dilution, la solution contient : tampon tris barbital pH= 9,2 ± 0,3 et azoture de sodium.
La solution est utilisée comme tampon pour l’électrophorèse. La conservation se fait à température ambiante ou au réfrigérateur.

Diluant colorant et colorant d’amidoschwarz

Le flacon d’amidoschwarz concentré doit être complété à 300ml avec 60ml de diluant colorant concentré et de l’eau distillée ou déminéralisée.
Après dilution la solution colorante contient : solution acide pH=2, amidoschwarz = 4g/dl, éthylène glycol= 6,7%, composante sans danger aux concentrations utilisées nécessaires pour des performances optimales. La conservation se fait à température ambiante ou au réfrigérateur pour éviter l’évaporation.
NB : Le colorant est destiné uniquement à la coloration de 10 gels. Après quoi, il doit être renouvelé.

Décolorants

Le flacon de décolorant concentré doit être dilué à 1/1000 avec de l’eau distillée ou déminéralisée. On prélève 1ml qui est complété à un litre avec de l’eau. Il est utilisé pour éliminer l’excès de colorant après coloration du gel. La conservation se fait à température ambiante ou au réfrigérateur.
Solution hémolysante : elle est prête à l’emploi, utilisée pour l’hémolyse des GR. La conservation se fait à température ambiante ou au réfrigérateur.
Applicateurs : d’usage unique, les applicateurs prédécoupés sont utilisés pour le dépôt des échantillons.
Papiers filtres : d’usage unique, ils sont utilisés pour l’absorption de l’excès de liquide à la surface du gel avant l’application des échantillons.

Analyse des échantillons

Prélèvement et conservation des échantillons : l’analyse se fait sur sang prélevé sur anticoagulant (EDTA). Après asepsie à l’alcool, on prélève dans un tube 4 à 5 cc de sang. Les tubes sont numérotés et conservés au réfrigérateur.
Préparation des échantillons : après élimination du plasma, les GR sont lavés deux fois par dix volumes d’eau physiologique. On hémolyse 10 micro-litres de GR par 130 micro- litres de solution hémolysante.

Technique

Migration : on pose le porte – applicateur HYDRAGEL K20 à plat sur la paillasse (figA.1) tout en relevant le chariot porte applicateurs.
On dépose 120 micro-litres d’eau distillée sur le plateau du porte applicateur dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié.
On fait sortir le gel de son emballage et on élimine rapidement l’excès de liquide en surface, en effleurant le gel avec un papier filtre. Le gel est ensuite placé (face orientée vers le haut) sur le plateau du porte applicateur contre la barrette. Il est préférable de donner une forme biconcave au gel (figA.2) en déroulant sur le plateau jusqu’au contact de la goutte d’eau qui doit se répartir sur toute la largeur du gel. La goutte d’eau doit s’étaler sur toute la surface du film.
Le chariot porte- applicateur est abaissé jusqu’en position intermédiaire, la manette située sur le coté du porte applicateur en position haute.
On pose un applicateur à plat sur la paillasse, numérotation (puits) vers le haut (figA.3).
On dépose 10 micro-litres d’échantillon hémolysé dans chaque puits. Le chargement de l’applicateur ne doit pas excéder 2 min. L’applicateur doit être utilisé immédiatement après le chargement.
On élimine la protection des dents de l’applicateur.
L’applicateur est placé en position n°4 sur le porte- applicateur. Les numérotations de l’applicateur sont toujours dirigées vers l’opérateur (figA.4).
Le chariot porte applicateur est alors abaissé jusqu’en butée, à l’aide de la manette du porte applicateur pour amener l’applicateur au contact du gel.
On ne doit surtout pas forcer la descente du chariot.
Après une minute d’application on tourne la manette du porte applicateur pour relever l’applicateur et il sera par la suite jeté.
Le gel est finalement placé dans la cuve d’électrophorèse selon la polarité indiquée sur le gel, bas du gel coté cathodique.
L’HYDRAGEL est positionné sur le portoir de la cuve K20. La face gel est orientée vers le bas et le gel plonge dans le tampon sur une distance de 1cm de chaque coté.
La cuve est ensuite branchée au générateur.
Après migration, on débranche la cuve et on fait sortir le gel.
Fixation : elle se fait à l’aide de la solution de fixation. Le gel est placé dans un portoir. Dans un bac rempli avec 150 ml de solution de fixation on immerge le gel pendant 15mn. Le gel est sorti et séché sous air chaud à 80° dans l’incubateur sécheur.

Coloration – décoloration

Le gel sec refroidi est immergé dans la solution colorante pendant 5mn. Le gel est décoloré par trois bains successifs de décolorant jusqu’à obtention d’un fond parfaitement clair.
Lecture : elle se fait au densitomètre intégrateur à 570 nm, cela permet de définir les concentrations relatives (pourcentages) de chaque fraction.

Résultats : interprétation des hémoglobinopathies

L’évaluation qualitative est visuelle. Après observation, on détermine la présence ou non d’Hb anormales.
L’évaluation quantitative est faite par le densitomètre intégrateur qui donne le pourcentage des différentes fractions d’Hb.
Hémoglobine S : sa mobilité est diminuée. Dans la technique HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, en tampon alcalin, l’Hb S migre en position médiane entre les fractions A et A2.
Hémoglobine C : sa mobilité est très réduite. Les Hb C et E se trouvent parfaitement superposées à la fraction A2. Quand cette fraction est supérieure à 15%, la présence d’Hb C et E peut alors être suspectée.
Hémoglobine E : elle migre exactement comme l’Hb C. En tampon acide, elle ne se sépare pas des Hb A et A2., ce qui permet de la différencier de l’Hb C.
Hémoglobine D : elle migre exactement comme l’Hb S. En tampon acide, elle ne se sépare pas des Hb A et A2., ce qui permet de la différencier de l’Hb S.

Analyse et traitement des données 

Les textes ont été saisis à l’aide du logiciel de traitement de texte Word sous système d’exploitation Windows Xp version Edition familiale.
Les données ont été saisies à l’aide du logiciel Excel version 97, et analysées sur Epi info version 6.04 FR.

Commentaires et discussions 

Approche méthodologique 

Nous avons pratiqué l’électrophorèse de l’Hb en tampon alcalin en utilisant le kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) des laboratoires SEBIA.
Nous n’avons pas effectué chez nos patients de test d’Emmel qui permet de différencier les Hb S et D en ce sens que l’Hb D ne présente pas de falciformation. Aussi nous n’avons pas fait de numération globulaire et de bilan martial. Ces paramètres permettent de mieux apprécier l’anémie et aident à mieux interpréter l’électrophorèse de l’Hb. Enfin nos résultats n’ont pas été confirmés par l’électrophorèse à pH acide. qui aide à interpréter l’électrophorèse de l’Hb et permet de différencier l’Hb S de D et l’Hb C de E.
Nous avons bien voulu mettre en exergue ces insuffisances car le diagnostic des hémoglobinopathies fait appel à tous ces quatre paramètres.

Paramètres sociodémographiques

Pour chacun de nos 616 patients, nous avons retenu l’âge, le sexe, l’ethnie, le signe clinique ainsi que le profil électrophorétique.
La moyenne d’âge de nos patients était de 20,6 ±11,6 avec comme extrêmes 2 mois et 60 ans (tableau I). La jeunesse de notre population a été frappante car 60,4% avaient moins de 24 ans.
L’âge relativement jeune pourrait s’expliquer par la précocité des manifestations cliniques de certaines maladies de l’Hb comme la drépanocytose.
Un résultat similaire a été observé par Haidara A [17] qui trouvait que 50% de sa population avaient moins de 30 ans et souffraient de drépanocytose tandis que Coulibaly T [8] trouvait que 42,2% de sa population avaient moins de 31 ans et souffraient par contre de l’hémoglobinose C.
L’analyse du tableau II nous indiquait que le sexe féminin était relativement plus concerné avec un taux de 55,5%, le sexe ratio étant de 1, 2. Coulibaly T [8] a trouvé 57,2% du sexe masculin avec un sexe ratio de 1,33 en faveur du sexe masculin.
Logiquement, on ne s’attend pas à une disproportion de répartition entre les deux sexes compte tenu du mode de transmission génétique des anomalies de l’Hb : mode autosomique récessif [29,1]. Ici l’on observe une légère prépondérance du sexe féminin que nous expliquons par le biais de l’échantillonnage et le mode de recrutement.
L’ethnie « bambara» avait majoritairement les hémoglobines pathologiques avec une fréquence de 36,4% suivie de celle des peulhs (19%) et les soninké (13,8%).
Les mêmes résultats ont été observés par Coulibaly T [8] qui trouvait les bambara majoritaires avec 37,1%, suivis des peulhs (20%) et les soninkés (11,4%) pendant que Haidara A [17] a trouvé les bambara (37,1%), les peulhs (18,98%) et les soninkés (11,20%).
Cette répartition est comparable à celle de l’ensemble de la population de Bamako, les bambaras étant largement majoritaires [26]. En Afrique, la ceinture sicklemique de Lehmann est la zone la plus touchée par la drépanocytose avec une fréquence de 10 à 30% [29,14].
Toutefois, nous n’avons pas rencontré dans la littérature une ethnie spécifiquement touchée dans cette zone. Dans le bassin méditerranéen, ce sont les thalassémies qui y sont principalement rencontrées.
L’analyse du tableau IV nous indiquait que 14,8% des patients ont été examinés pour un bilan prénatal. Cette remarque nous prouve qu’actuellement la demande de l’électrophorèse de l’Hb entre dans la routine du bilan prénatal. Cela permettra de mieux prévenir les anémies hémolytiques néonatales et le déroulement des grossesses à risque liées aux anomalies de l’Hb. Aussi, 12,1% se plaignaient de douleurs ostéoarticulaires. Une remarque impressionnante a été que 9% de nos patients se sont faits consulter pour bilan prénuptial. Ceci permettra le conseil génétique prénuptial. Il n’y a pas de législation actuelle en matière du bilan prénuptial et en matière du conseil génétique dans notre pays. Les douleurs articulaires, abdominales et les crises pseudo rhumatismales représentaient respectivement 10,1%, 8,9% et 7,6%. Il s’agit là de signes classiques de la drépanocytose.

Hémoglobinopathies

Au cours de notre étude, nous avons retrouvé quatre types d’Hb : A, S, F, C. En plus de ces quatre types Kalidi avait trouvé au cours de son enquête menée à travers différentes régions du Mali autres les Hb J et K Woolwich.
Cette dernière ne doit plus être considérée comme spécifique de l’ethnie akan du Ghana et de la Côte d’Ivoire du moment qu’elle a été mise en évidence chez une autre ethnie malienne.
Le phénotype normal AA était plus fréquemment observé avec une fréquence de 60,7% suivi du trait drépanocytaire (21,3%). Les autres étaient : AC (7,6%), SS (4,9%), SC (4,5%).
Un ordre de fréquence similaire a été signalé en 1974 par Begat J.C [3] notamment : AA (75,6%), AS (12,8%), et AC (10,4%) avec n=320 tandis que Haidara. A [17] avait trouvé AA (75,6%), AS (13,2%), et AC (7,1%) avec n=1660. Baby M [2] avait trouvé une prévalence plus élevée de 15,77% d’Hb AC chez une ethnie spécifique : les dogons de Sangha, n=2612. Ce taux élevé d’Hb AC s’explique par le fait que l’étude de Baby a été menée dans une zone ciblée (pays dogon) où la fréquence d’Hb C est très élevée.
Au cours de notre étude, nous avons observé une proportion d’Hb anormale de 39,3% pendant que Haidara A [17] et Mounkoro M [23] ont trouvé respectivement 24,4%et 16,8%. Ces observations ne font que confirmer la présence des hémoglobinopathies dans notre pays.
Nous avons observé six cas d’homozygotes CC et 30 cas de drépanocytaires homozygotes pendant que Haidara A [17] trouvait six cas de CC et 18 cas de SS. Cependant Mounkoro M [23] a trouvé un seul cas de CC et de SS alors que Kalidi [20] trouvait en 1978 deux cas de CC et 0 cas de SS. Ceci démontre la rareté de l’Hb C homozygote. Nos observations faites dans une population majoritairement Bambara ont montré une prédominance de l’Hb S par rapport à l’Hb C. Les porteurs de l’Hb C majoritairement dogons préférant se traiter par la médecine traditionnelle minimise la prévalence de cette Hb C dans notre population d’étude.

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Table des matières

I. Introduction
Objectifs
1. Objectif général
2. Objectifs spécifiques
II. Généralités
A. Rappel sur l’hémoglobine
1. Définition
2. Structure
3. Fonctions de l’hémoglobine
3.1. Transport de l’oxygène
3.2. Transport du CO2
3.3. L’effet Bohr
4. Ontogenèse des chaînes de l’hémoglobine
5. Synthèse de l’ Hb
5.1. Synthèse de l’hème
5.2. Synthèse de la globine
6. Protection de l’Hb contre l’ O2
7. Les Hb normales
7.1. Chez l’embryon
7.2. Chez le foetus
7.3. De la naissance à six mois
7.4. A partir de six mois
B. Les hémoglobinopathies
1. Définition
2. Historique
3. Formules des hémoglobines anormales
4. Mécanisme génétique
5. Classification
5.1. La drépanocytose
5.1.1. Répartition
5.1.2. Pathogénie
5.1.3. Physiopathologie et génétique
5.1.4. Biologie
5.1.4.1. Forme homozygote
5.1.4.2. Forme hétérozygote
5.1.5. Clinique
5.1.5.1. Forme hétérozygote
5.1.5.2. Forme homozygote
5.1.6. Complications
5.1.7. Traitement
5.2. L’hémoglobinose C
5.2.1. Forme homozygote
5.2.2. Forme hétérozygote
5.3. L’hémoglobinose D
5.4. Lhémoglobinose E
5.5. L’hémoglobinose M
5.6. L‘hémoglobinose G
5.7. L’hémoglobinose J
5.8. L’hémoglobinose K Woolwich
5.9. L’hémoglobinose K Algérie
5.10. Les doubles hétérozygoties
5.10.1. L’hémoglobinose SC
5.10.2. Les thalasso drépanocytoses
5.10.2.1. La forme usuelle β+/ S
5.10.2.2. La forme usuelleβ 0/ S
5.11. Les Hb instables
5.12. Les Hb à affinité modifiée
5.12.1.Les Hb à affinité augmentée
5.12.2.Les Hb à affinité diminuée
5.13. Les thalassémies
5.13.1. Les syndromes α thalassémiques
5.13.1. 1.L’hydrops foetalis de Bart’s
5.13.1 2.Lhémoglobinose H
5.13.1.3.L’ α thalassémie de type 1
5.13.2. Les syndromes β thalassémiques
5.13.2.1. Les β thalassémies homozygotes
5.13.2.2. Les β thalassémies hétérozygotes
5.13.2.3. Les β thalassémies intermédiaires
III. Méthodologie
1. Lieu d’étude
1.1. Création et missions du CNTS
1.2. Organisation et fonctionnement du CNTS
2. Type d’étude
3. Population d’étude
4. Critères d’inclusion
5. Critères de non inclusion
6. Echantillon
7. Paramètres étudiés
8. Méthode
8.1. Utilisation du kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K 20
8.2. Principe du test
8.3. Réactifs fournis dans le kit
8.4. Analyse des échantillons
8.4.1. Prélèvement et conservation des échantillons
8.4.2. Préparation des échantillons
8.5. Technique
8.5.1. Migration
8.5.2. Fixation
8.5.3. Coloration – décoloration
8.5.4. Lecture
8.6. Résultats
9. Analyse et traitement des données
IV. Résultats
1. Résultats descriptifs
2. Résultats analytiques
V. Commentaires et discussions
1. Approche méthodique
2. Paramètres sociodémographiques
3. Hémoglobinopathies
VI. Conclusion et recommandations
VII. Annexes
1. Fiche signalétique
2. Références bibliographiques

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Comments (1)

  1. Mes salutations distinguées à vous et à votre équipe.
    Nous sommes une société de distribution de matériels médicaux et consommables médicaux au MALI Bamako
    Ce pendant nous sommes également à la recherche hydragel hémoglobine k20 et décoloration Destaining solution