Soutenance mémoire
Une cellule est un objet complexe qui ne peut pas être réduit à un simple « sac » de molécules réparties de façon homogène. Elle peut être vue au contraire comme un espace compartimenté, avec un cytosquelette (microfilaments d’actine, microtubules, filaments intermédiaires) qui contribue à l’agencement intracellulaire, des organelles (noyau, appareil de Golgi …), et enfin le cytosol, dans lequel sont diluées des macromolécules (ARN, protéines,…) . Du fait de la compartimentation de l’espace intracellulaire, la distribution de molécules est hétérogène dans la cellule. Des réactions chimiques localisées, et le transport de molécules (par diffusion ou par transport actif le long des microtubules), entretiennent cette hétérogénéité.
Cette hétérogénéité dans la répartition de protéines entretenue par le cytosquelette est bien illustrée dans le cas des cellules épithéliales. Ces cellules sont fortement polarisées, avec un pôle apical, tourné vers l’extérieur et un pôle basal. Cette polarité définit donc deux régions, avec des différences dans la structure du cytosquelette ou la distribution de protéines .
La polarité des cellules épithéliales vient d’une répartition différentielle des protéines. Par exemple les protéines PKC sont recrutées au niveau du cortex apical, alors que les protéines PAR se trouvent au niveau du cortex basal. La présence des protéines PKC à un endroit de la cellule exclut celle des protéines PAR, et inversement . La localisation de ces protéines a une influence sur l’organisation du cytosquelette, qui lui-même rétroagit sur la distribution de protéines . Ces cellules ont des morphologies très différentes, cependant elles se polarisent souvent à l’aide de mécanismes similaires à celui expliqué pour les cellules épithéliales, c’est-à-dire via l’activité localisée de protéines de signalisation . La localisation interne des protéines est donc très importante pour un grand nombre de fonctions cellulaires comme la migration ou la division.
Le cytosquelette est constitué de trois types de polymères : les microtubules, les microfilaments d’actine, et les filaments intermédiaires . Ils permettent le soutien mécanique de la cellule, et ils sont également à la base de plusieurs fonctions cellulaires telles que la division, la migration, ou encore la communication extra et intra cellulaire. Ils interagissent constamment avec d’autres éléments cellulaires (protéines, moteurs moléculaires, cortex cellulaire…) et sont extrêmement dynamiques grâce à une polymérisation/dépolymérisation permanente.
Les microtubules sont des tubes faits de 13 protofilaments. Ces protofilaments ont un diamètre interne de 14 nm et un diamètre externe de 25 nm. Ils s’assemblent à partir des dimères de tubuline (alternance de α-tubuline et de β-tubuline) .
À cause de l’asymétrie des dimères (α-tubuline, β-tubuline), les microtubules sont des filaments polaires. En effet, les monomères α et β portent tous les deux une molécule de GTP, cependant, la stabilité de cette molécule de GTP est différente pour les deux monomères. La molécule de GTP liée à la tubuline α est stable, alors que celle liée à la tubuline β peut être hydrolysée en GDP après polymérisation des dimères. Cela entraîne une différence dans le comportement dynamique des deux extrémités, qui est la base d’un modèle de polymérisation des microtubules, appelé modèle de la « coiffe de GTP ». L’extrémité β, appelée extrémité « + » va croître plus rapidement que l’extrémité α, appelée extrémité « – ». La polymérisation a donc lieu essentiellement à l’extrémité « + » .
Les microtubules subissent fréquemment des dépolymérisations soudaines appelées « catastrophes » : la tubuline liée au GDP est moins stable que celle liée au GTP. À l’extrémité « + », si la polymérisation est plus lente que l’hydrolyse, les microtubules dépolymérisent de manière rapide . Une molécule de GTP peut alors se lier à l’extrémité « + » et protéger le microtubule jusqu’à la prochaine catastrophe. Ce phénomène est appelé « sauvetage » . Ce modèle classique a été complété en 2008 par l’équipe de Frank Pérez . Ils ont observé, grâce à un anticorps reconnaissant la tubuline liée au GTP, que celle-ci n’est pas présente uniquement à l’extrémité « + » du polymère mais également à l’intérieur, sous forme « d’îlots » dans des zones polymérisées antérieurement. Ils ont ainsi proposé un nouveau modèle pour la dynamique des microtubules : quand le GTP à l’extrémité des microtubules s’hydrolyse, une catastrophe intervient, et donc une dépolymérisation jusqu’à atteindre l’îlot de GTP, où la polymérisation peut reprendre . Ce modèle pourrait expliquer la fréquence élevée de sauvetages des microtubules.
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Table des matières
Chapitre 1 Introduction générale
1. Le cytosquelette
1.1. Microtubule
1.2. Le réseau d’actine
2. Établissement d’une asymétrie dans la distribution de protéines.
2.1. Organisation du cytosquelette et lien avec les cascades de signalisation : importance de la localisation des protéines
2.2. Hétérogénéité dans la distribution de protéines induite par diffusion ou transport actif….
3. Méthodes permettant d’étudier les cascades de signalisation
4. Nanoparticules magnétiques
4.1. Utilisation des nanoparticules magnétiques en biologie
4.2. Activation magnétique de voie de signalisation
Organisation du manuscrit
Chapitre 2 Matériel et méthodes
1. Nanoparticules magnétiques
2. Expression et purification de protéines recombinantes
2.1. Transformation
2.2. Induction
2.3. Purification
3. Greffage de molécules sur les nanoparticules
3.1. Greffage du RanQ69L
3.2. Greffage du PEG-PLL fluorescent
3.3. Greffage de l’Epidermal Growth Factor
3.4. Greffage à la surface des nanoparticules de diamètre supérieur à 100 nm
3.5. Greffage a la surface des nanoparticules de diamètre inférieur à 100 nm
4. Dispositif de microscopie
5. Extrait cellulaire de Xénope
5.1. Le Xenopus laevis
5.2. Préparation des extraits cellulaires de Xénope
5.3. Polymérisation des microtubules et assemblage des asters
5.4. Polymérisation et observation des filaments d’actine
5.5. Encapsulation des extraits
Chapitre 3 Conclusion générale
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