IBTS-77-RP-1000
Description de la molécule d’ADN
Structure chimique
L’ADN est un macromolécules biologiques support de l’information génétique. La particularité de cette molécule est qu’elle a en première approximation toujours la même structure indépendamment de l’information qu’elle contient. On présente dans cette partie la constitution chimique de l’ADN. L’ADN est un polymère. L’unité de base qui le compose est appelée nucléotide. Ce monomère peut se décomposer en trois sous structure :
Une base : Adénine, Guanine, Cytosine et Thymine
Le sucre : pentose
Un groupement phosphate : –PO3-
Les paires de base sont au nombre de quatre : Adénine (notée A), Guanine (G), Cytosine (C) et Thymine (T). On distingue les paires de base en deux catégories suivant qu’elles dérivent de la purine (A et G) ou de la pyrimidine (T et C). Ces bases peuvent s’apparier spécifiquement par des liaisons hydrogènes. A s’associe avec T, et G avec C. La liaison A-T (deux liaisons hydrogène) est moins forte que la liaison G-C (trois liaisons hydrogène). On notera que les points de fixation des bases sont excentrés par rapport aux paires de base. Les paires de base forment ainsi un angle entes elles. On peut assembler les nucléotides pour former un polymère. L’assemblage se fait par l’intermédiaire des ponts phosphates . Le polymère est orienté. On distingue les extrémités de la chaîne en fonction des carbones du sucre. L’extrémité 3’ correspond au coté qui se termine par le carbone C3’ du sucre. L’autre extrémité sera alors notée 5’.
L’ADN est formé par l’assemblage de deux de ces chaînes poly nucléotidiques. Ces chaînes sont antiparallèles (c’est à dire que les deux brins sont orientés en sens opposés). La molécule ressemble schématiquement à une échelle dont les montants sont le squelette phosphate et les barreaux les paires de base.
La longueur de l’ADN peut varier de quelques paires de base (quelques nm), à plusieurs millions (de l’ordre du mm). Il n’y a pas de limite a priori à leur assemblage. Par exemple le chromosome de la mouche mesure plus d’un centimètre de long pour 2nm de diamètre.
La molécule d’ADN de part les interactions complexes de tous ces constituants va adopter une géométrie particulière.
Structure spatiale
Les paires de base de l’ADN sont plutôt hydrophobes par comparaison aux groupements phosphates. Ces derniers sont chargés et solubilisent la molécule dans son milieu aqueux.
La molécule sous l’effet des interactions hydrophobes entre les paires de base va avoir tendance à former une hélice pour avoir un meilleur empilement des paires de base. C’est la forme en double hélice droite (comme un tire-bouchon) proposé par Watson et Crick en 1953 [Watson 1953 ].
Comme on l’a fait remarquer précédemment, les points d’attache des bases au pentose ne sont pas symétriques par rapport à l’axe de la molécule. On a donc dans le plan des paires de base plus d’espace d’un coté que de l’autre . Cela donne respectivement le grand et le petit sillon de la molécule d’ADN.
Vu la complexité de cette molécule, on pourrait s’attendre à trouver toute sorte d’arrangements spatiaux. En fait il n’en n’est rien, l’ADN occupe quelques formes bien déterminées. Les écarts que l’on peut observer à ces formes idéales sont assez minimes [Allemand 1998]. Nous décrivons ci-après quelques formes les plus rencontrées. Pour une vue complète on reporte le lecteur à l’article de Leslie [Leslie 1980].
Les formes les plus rencontrées et les plus étudiées sont les formes : A, B et Z. Des études plus récentes ont mis en évidence les formes appelées H, P et S,…
On peut distinguer les formes A, B et Z par trois critères géométriques principaux :
1 : Le sucre peut adopter deux conformations. Un des atomes de carbone du cycle se trouve hors du plan formé par les autres atomes.
2 : Chacun des atomes de la chaîne comprenant le groupement phosphate impose un angle à la liaison avec les atomes voisins.
3 : L’hélice est soit droite (comme un tire bouchon), soit gauche. L’arrangement spatial des atomes a été déterminé par diffraction X sur des fibres d’ADN. Ce sont les formes les mieux déterminées. Les formes P et S, sont beaucoup moins bien déterminées. On donne une représentation de la forme P obtenue par simulation [Strick 1996]. Cette forme est très contrainte puisque les paires de base sont orientées vers l’extérieur (vers le solvant). De plus, les groupements phosphates des deux chaînes se retrouvent côte à côte et ont tendance à se repousser électrostatiquement . Le pas de l’hélice et son allongement coïncide avec ceux obtenus par des expériences d’étirement de la molécule avec une torsion contrôlée de la molécule [Allemand 1998]. Ces données pourraient coïncider également avec des mesures de diffraction X obtenue récemment sur le génome de virus Pf1 [Liu 1994]. La forme S a été observée au cours d’expérience d’étirement de l’ADN à la limite de la rupture mécanique [Strick 1996] [Clausen-Schaumann 2000].
Dénaturation de l’ADN
La séparation des deux brins de l’ADN se nomme fusion de l’ADN. On peut séparer les bases de l’ADN de différentes manières. La méthode la moins agressive est de chauffer la solution. On peut suivre cette réaction de fusion de l’ADN en mesurant l’absorbance pour une longueur d’onde donnée. La longueur d’onde utilisée est en général de 260nm. En effet l’ADN simple brin et la double hélice n’ont pas la même absorption à cette fréquence. L’agitation thermique est responsable du désappariement. Comme la liaison G-C est plus « forte » que la liaison A-T, il faut chauffer d’autant plus qu’il y a une forte teneur en paire de base G-C dans la molécule.
La teneur en sel stabilise la double hélice en écrantant la répulsion électrostatique des groupements phosphates.
La dénaturation peut être provoquée en milieu très acide (pH<1) ou très basique (pH>11). Mais cette dénaturation n’est pas équivalente à la dénaturation thermique. Gani [Gani 1999] ont observé des différences de comportement des simples brins obtenues dans leurs expériences de dépôt. Dans ce cas, le milieu acide ou basique ionise les bases qui se repoussent électrostatiquement. Les extrémités de l’ADN sont plus sensibles aux conditions dénaturantes. Ainsi les extrémités de la molécule peuvent interagir d’une manière que ne peut pas faire le reste de la molécule. Cela explique pourquoi ce sont d’abord les extrémités de l’ADN qui se fixe en premier sur la surface. Nous reverrons cela plus loin dans la partie sur le dépôt d’ADN.
Etirement de l’ADN
L’ADN lorsqu’il est déposé sur une surface va subir un certain nombre de contraintes qui dépendent de la technique de dépôt utilisée. La forme que la molécule va finalement adopter dépend de la rigidité de la molécule, de l’intensité de l’interaction avec la surface, et de l’interaction de la molécule avec elle-même. Cependant si les forces qui s’exercent sur l’ADN sont importantes, la situation est assez simple puisque l’interaction de la molécule avec elle-même ou sa rigidité deviennent négligeables. C’est le cas par exemple d’une technique comme le peignage (qui sera expliqué en détail plus loin) qui sur étire généralement l’ADN.
L’étude de l’étirement de l’ADN montre que pour une force d’environ 70pN dans le cas du λ-ADN on a une transition de phase sur la molécule d’ADN [Clausen-Schaumann 2000][Strick 1996]. La transition de phase dont on parle correspond au passage à force constante de l’ADN de la forme B à la forme S.
Dans ce cas l’ADN peut être étiré de presque deux fois sa longueur. La force de 70pN peut être atteinte avec la technique de peignage. Ce point sera discuté plus loin. On peut constater sur la courbe de la figure I.08 qu’il y a une deuxième transition qui correspond à la fusion de l’ADN. En effet la courbe de retrait est similaire à celle d’une molécule simple brin. Les techniques de dépôt ne permettent pas généralement d’arriver à la force nécessaire (200 à 300pN) pour une telle transformation.
Toutes ces contraintes sur l’ADN ont pour conséquence de le dégrader. Toutes les techniques de dépôt ne sont pas aussi brutales. Si la force d’interaction avec le substrat n’est pas trop importante l’ADN peut adopter une configuration d’équilibre [Riveti 1996]. Dans ce cas des structures propres à l’ADN peuvent apparaître.
Condensation de l’ADN
L’ADN dans certaines conditions peut occuper un volume très petit en comparaison de sa forme étendue. La condensation peut être intramoléculaire (la molécule se recroqueville sur elle-même), ou bien intermoléculaire (entre les molécules). Pour des concentrations en ADN très faible, la condensation intramoléculaire est favorisée.
Les conditions de condensation requièrent la présence de cations et/ou la dégradation du solvant. La valence du cation intervient de manière cruciale. En solution aqueuse, des cations de valence au moins trois (spermidine3+, cobalt hexamine Co(NH3)63+, spermine4+, … des polypeptides cationiques tel la polylysine, ou des protéines comme les histones H1 et H5,…) sont requis pour provoquer la condensation. Les cations de valence deux (métaux, Mg2+, Li2+, …, putrescine2+,…) sont à la limite de provoquer la condensation. Il suffit de dégrader légèrement la qualité du solvant (mélange eau/alcool) pour la provoquer. On sait que l’éthanol est couramment utilisé en laboratoire pour précipiter l’ADN. Les cations monovalents peuvent provoquer la condensation de solution concentrée d’ADN. Dans ce cas, c’est plus la dégradation de l’environnement de l’ADN que la présence du sel qui joue un rôle majeur. A ce titre, l’ajout d’un autre polymère tel le polyéthylène glycol : PEG en présence de sels provoque sa condensation [Laemmli 1975]. On parle alors de psi-DNA (acronyme de polymer and salt induced DNA). Ce mécanisme marche aussi avec des polymères anioniques tel le poly-aspartate ou le poly-glutamate. Là encore c’est la dégradation de l’environnement de l’ADN qui entraîne la formation d’une phase condensée [Bloomfield 1996]. La propriété de condensation est remarquable quand on pense que dans le noyau de la cellule du génome la condensation est un processus qui consomme énormément d’énergie (environ ½ ATP hydrolysé par paire de base). Le fait de réaliser le même genre de processus en laboratoire en ajoutant uniquement une petite quantité d’ions dans la solution est assez surprenant.
La condensation joue certainement un rôle in vivo. De manière générale, le matériel génétique est fortement condensé dans le noyau des cellules. Le niveau de compaction de l’ADN dans certaines cellules peut être très important. C’est le cas par exemple des têtes de spermatozoïde, ou de certains virus. La distance entre les molécules d’ADN est de l’ordre du nanomètre, soit juste la place pour quelques couches d’hydratation [Schellmann 1984]. La condensation ne nécessite pas forcément l’ajout de sels dans la solution. L’ADN peut condenser à forte concentration. La présence de trop de sels peut au contraire la perturber par la formation de cristaux. Ainsi à partir de 35g/L l’ADN commence par former un gel [Fried 1984], puis une phase cristal liquide cholestérique pour 150g/L [Strzelecka 1987]. Une phase cristal liquide hexagonale colonnaire plus dense peut également se former [Livolant 1989] . La formation d’une phase cristal liquide par des polymères semi – rigides à partir d’une certaine concentration a été d’abord décrit par Onsager [Onsager 1949] et développé par Flory [Flory 1956] et d’autres. Cette phase a été observée in vivo dans des bactéries [Reich 1994]. La formation de structure cristalline est obtenue pour des molécules d’ADN de toute taille.
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Table des matières
Introduction générale
Chapitre I : Introduction
I. Introduction
II. Description de la molécule d’ADN
II.1. Structure chimique
II.2. Structure spatiale
II.2.1. Forme A
II.2.2. Forme B
II.2.3. Forme Z
II.2.4. Triplex et quadruplex
II.3. Dénaturation de l’ADN
II.4. Etirement de l’ADN
III. ADN en solution
III.1. Condensation des contre-ions
III.2. Neutralisation de la charge
III.2.1. Paramètres pertinents du système
III.2.2. Solution à une composante
III.2.3. Solution à deux composantes
III.2.3.1. Effet de la valence des ions
III.2.3.2. Effets géométriques
III.2.4. Interaction spécifique des cations
III.3. Condensation de l’ADN
III.3.1. Présentation
III.3.2. Origine des structures ordonnées
III.3.3. Interaction entre molécules d’ADN
III.3.4. Conséquences
III.3.4.1. Pour le dépôt d’ADN
III.3.4.1.1 Structure avec beaucoup de brins
III.3.4.1.2. Structure intermédiaire
III.3.4.1.3. Structure avec peu de brins
III.3.4.2. Pour la conduction
IV. Méthodes de dépôt
IV.1. Introduction
IV.2. Traitement des surfaces
IV.3. Différentes techniques
IV.3.1. Greffage
IV.3.2. Peignage moléculaire
IV.3.3.Etirement par un flot
IV.3.4. Piège électrostatique
IV.4. Mesure des hauteurs à l’AFM
V. Mesures électriques
V.1. Introduction
V.2. Modèles de conduction
V.2.1. Transfert intramoléculaire
V.2.1.1. Vitesse de transfert
V.2.1.2. Super échange
V.2.1.3.Cas de l’ADN
V.2.1.4. Distance de saut variable
V.2.1.5. Saut de polaron
V.2.2. Transport à travers une molécule entre deux électrodes
V.2.2.1. Injection des charges
V.2.2.2. Approche de Bardeen
V.2.2.3. Approche de Landauer
V.3. Mesures électriques
V.3.1. ADN conducteur
V.3.2. ADN semi-conducteur
V.3.3. ADN isolant
V.3.4. Effet de la température
V.3.5. Effet de l’environnement
V.4. Conclusion des mesures électriques
VI. Conclusion Générale
Chapitre II : Techniques expérimentales
I. Introduction
II. Microscopie champ proche
II.1. Introduction
II.2. Microscope à effet tunnel
II.3. Microscopie à force atomique
II.3.1. Le mode contact
II.3.2. Le mode non contact
II.3.3. Le mode intermittent ou tapping
II.3.4. Microscopie optique champ proche
II.3.5. AFM et STM ?
II.3.6. Le renouveau du mode non contact
II.4. Description de l’appareil
II.4.1. Les pointes
II.5. Description des différents modes
II.5.1. Description de l’interaction pointe surface
II.5.1.1. Courbe d’approche retrait
II.5.1.2. Mode contact
II.5.1.3. Modes oscillants
II.5.1.3.1. Oscillateur harmonique
II.5.1.3.2. Cas de l’oscillation verticale
II.5.1.4. Mode oscillation latérale
II.5.2. Application à l’imagerie
II.5.2.1. Principe
II.5.2.2. Mode contact
II.5.2.3. Tapping mode
II.5.2.4. Tapping mode deflection
II.5.2.5. Mode non-contact
II.5.2.6. Mode oscillation latérale
II.5.2.7. Interprétation des images AFM
II.5.2.7.1. Effet de la dissipation
II.5.2.7.2. Cas de contraste d’élasticité
II.5.2.7.3. Effet de la couche d’eau
II.5.2.7.4. Convolution
II.5.2.8. Conclusion : AFM en pratique
II.5.3. Mesures électriques
II.5.1.1. Lift mode
II.5.1.2. EFM
II.5.1.3. Conducting AFM
II.5.1.3.1. Présentation
II.5.1.3.2. Problèmes du contact électrique
II.5.1.3.3. Caractéristiques courant – tension
II.5.1.3.3.1. Protocole
II.5.1.3.4. Imagerie en courant
III. Mesures électriques sur des électrodes fixes
IV. Préparation des surfaces
IV.1. Dépôt de molécules
IV.1.1. Principe du greffage
IV.1.1. Nettoyage du substrat
IV.1.2. Greffage de la molécule
IV.1.3. Silane amine
IV.1. Dépôt de polymères
IV.1. SiH[111]
IV.1. Pentacène
V. Caractérisation des surfaces
V.1. Caractérisation avec les énergies de surface
V.1.1. Equation de Young – Dupré
V.1.2. Equation d’Owens-Wendt
V.1.3. Mise en œuvre
V.2. Caractérisation à l’AFM
VI. Manipulation et observation de l’ADN
VI.1. Solutions d’ADN
VI.2. ADN fluorescent
VI.3. Observation au microscope
VII. Réalisation d’électrodes
VII.1. Lithographie électronique
VII.2. Lithographie optique
VIII. Conclusion
Chapitre III : Dépôt d’ADN
I. Introduction
II. Surface à contraste chimique
II.1. Problématique
II.2. Objectif
II.3. Obtention de contraste chimique
II.3.1. Test de greffage pleine plaque
II.3.2. Surface à contraste chimique
II.3.2.1. Protocole
II.3.2.2. Masque utilisé
II.3.2.3. Résultats
II.3.2.4. Conclusion
III. Dépôt d’ADN
III.1. Présentation
III.2. Méthode de la goutte
III.2.1. Variante du peignage moléculaire
III.2.2. Caractérisation de l’ADN déposé
III.2.2.1. Orientation des brins d’ADN
III.2.2.2. ADN entremêlé
III.2.2.3. Densité en fonction du pH
III.2.2.3.1. Protocole
III.2.2.3.2. Résultats
III.2.2.3.3. Interprétation
III.2.2.4. Longueur de l’ADN
III.2.2.4.1. Protocole
III.2.2.4.2. Résultats
III.2.2.5. Densité en fonction du temps d’incubation
III.2.2.5.1. Protocole
III.2.2.5.2. Résultats
III.2.2.5.3. Interprétation
III.2.3. Conclusion
III.3. Deuxième méthode : Séchage d’un goutte
III.3.1. Présentation
III.3.2. Conclusion
III.4. Discussion
III.4.1. Point de fixation de l’ADN sur la surface
III.4.2. Structure de l’ADN sur la surface
III.5. Mesure de la hauteur de l’ADN
III.5.1. Protocole
III.5.2. résultats
III.5.3. Interprétation
IV. Conclusion
Chapitre IV : Mesures électriques
I. Introduction
II. Mesures sur des électrodes
III. AFM – Conducteur
III.1. Introduction
III.2. Problème de la métallisation
III.2.1. Configuration de la jonction électrode/ADN
III.2.2. ADN posé sur l’électrode
III.3. Mesure en imagerie de courant
III.3.1. Deux mesures directes avec du pentacène
III.2.3.1. Sur SiO2
III.2.3.2. Sur une surface terminée amine
III.3.2. Conclusion
III.4. Caractéristique courant – tension
III.4.1. Introduction
III.4.2. Caractéristiques principales des mesures de courant
III.4.2.1. Asymétrie
III.4.2.2. Dépendance vis-à-vis du sens de variation de la tension
III.4.2.3. Reproductibilité des mesures
III.4.2.4. Mesure en fonction du temps
III.4.3. Interprétation des résultats
III.5. Mesure en fonction de la distance et de la taille du système
III.5.1. Modèle tunnel
III.5.2. Modèle ohmique
III.5.3. Hopping
III.5.4. Conclusion sur les différents modèles
IV. EFM
V. Fibres d’ADN
VI. Conclusion
Conclusion générale
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