Transfert de gène in vivo:étude, régulation et application de l’électrotransfert

Introduction au transfert de gène 

Principe
Le transfert de gène consiste à introduire un matériel génétique (sous forme d’ADN ou d’ARN) dans une cellule cible pour conduire à un effet physiologique souhaité (comme par exemple corriger un gène défectueux, inhiber ou stimuler la synthèse d’une protéine). Le concept initial associé à la notion de transfert de gène était celui de la thérapie génique, c’est à dire la compensation de gènes dont l’altération est responsable de maladies. Puis cette notion a été étendue à l’utilisation du gène comme nouveau type de médicament. Dès lors elle a rapidement débouché sur des indications débordant largement le cas des maladies génétiques puisqu’un gène médicament peut, à priori, remplacer n’importe quel médicament protéique dont il commandera la synthèse et la délivrance même [1].

Les stratégies
De nombreuses stratégies moléculaires de transfert de gène peuvent être envisagées selon l’application souhaitée. Aujourd’hui, avec le décryptage de l’ensemble du génome humain, le champ d’applications du transfert de gène s’est fortement élargi. Le transfert d’un gène apparaît aujourd’hui comme une stratégie séduisante, non seulement pour le traitement de maladies monogéniques telles que la mucoviscidose ou la dystrophie musculaire de Duchenne, pour le traitement de maladies plus complexes ayant des composantes génétiques telles que le cancer, le diabète ou les maladies cardiovasculaires, mais également pour la vaccination ou même l’étude de fonctions de gènes.

Remplacer un gène déficient par l’ADN complémentaire correspondant fonctionnel : il s’agit alors de corriger un défaut de fonction en apportant la protéine manquante comme dans les maladies monogéniques, telles que la mucoviscidose (dérèglement de la protéine CFTR, Cystic Fibrosis Conductance Transmembrane Regulator, due à une mutation), les myopathies (mutation du gène de la dystrophine pour la myopathie de Duchenne, par exemple) ou les déficiences immunitaires (SCID, déficit en adénosine désaminase, par exemple).

Inhiber le fonctionnement d’un gène muté ou inactiver son produit protéique : dans certains cas l’apport d’un gène fonctionnel ne suffit pas. En effet lorsqu’ une mutation dans un gène entraîne un gain de fonction, les symptômes de la maladie sont liés à la synthèse d’une protéine anormale à effets délétères.

Corriger une mutation ponctuelle : lorsqu’il n’est pas possible d’ajouter un gène fonctionnel pour remplacer un gène défectueux, une approche alternative consiste à effectuer une correction du gène in situ. L’objectif de cette stratégie est de corriger des mutations ponctuelles dans la cellule en utilisant par exemple des oligonucléotides hybrides ARN-ADN (chiméraplastes) ou des oligonucléotides simples brins [2].

Corriger un épissage alternatif incorrect : en introduisant un acide nucléique «antisens» inhibant [3] ou stimulant [4] l’épissage défectueux d’un exon .

Introduire un gène conduisant à la mort d’une cellule malade : ceci peut être fait directement en introduisant un gène apoptotique par exemple ou indirectement en sensibilisant par exemple des cellules cancéreuses à des médicaments : on introduit dans les cellules cancéreuses un gène qui code une enzyme activant un médicament inactif administré au patient, ce médicament activé détruit alors les cellules cancéreuses [5].

Ajouter un gène au génome d’une cellule pour produire une protéine thérapeutique : les cellules cibles sont alors utilisées pour l’expression de protéines thérapeutiques pour des facteurs de croissance (maladies cardiovasculaires : VEGF), des facteurs de coagulation (facteurs VIII et IX sanguins pour l’hémophilie), des interleukines, l’érythropoïétine (pour la β-thalassémie ou l’anémie), des anticorps monoclonaux [6] ou comme source d’antigène pour la vaccination génétique et la production d’antisérums.

Stimuler une réponse immune au niveau des cellules cibles : il peut s’agir par exemple d’intégrer dans des cellules cancéreuses des gènes codant des protéines qui stimulent le système immunitaire (cytokines, molécules du CMH, antigènes tumoraux). Ce dernier détruit ainsi les cellules tumorales (immunothérapie). Cette stratégie peut être utilisée aussi dans le cas de maladies infectieuses en rendant des cellules cibles résistantes à un virus ou productrices de protéines antivirales.

Etudier la fonction d’un gène : au cours des dernières années, un nombre impressionnant de gènes ont été découverts grâce au séquençage et au décriptage progressif du génome de nombreuses espèces. Il s’agit donc maintenant de trouver les fonctions de ces gènes.

«Gene farming» : De nombreuses molécules pharmaceutiques sont des protéines complexes obtenues par culture de cellules génétiquement modifiées. Dans certains cas, le procédé de production est très coûteux et la fabrication de médicament par ce biais est dans la pratique impossible. Pour contourner ce problème, une stratégie consiste à faire produire ces protéines complexes par des animaux [7]. Aujourd’hui l’évolution de la thérapie génique repose essentiellement sur le développement de systèmes de transfert de gène : ils doivent être sûrs, efficaces et capables d’exercer leur fonction sur de nombreux types cellulaires.

Les cellules cibles 

Les seules cellules traitées sont les cellules somatiques et selon l’indication souhaitée le transfert de gène peut se faire par deux approches conceptuellement différentes : «ex vivo» et «in vivo». Un traitement ex vivo implique un prélèvement des cellules du patient, leur modification par transfert de gène puis leur réinjection chez le patient. Un traitement in vivo implique une injection directement au patient. L’administration se fait soit par voie locale (injection directe dans le tissu à traiter ou instillation pulmonaire) soit par voie systémique (injection intraveineuse). L’administration locale présente l’avantage de concentrer l’ADN thérapeutique dans le tissu cible (muscle, tumeur, poumon, peau par exemple) et d’éviter ainsi une trop grande perte d’ADN. L’administration systémique est moins utilisée car elle pose un problème de ciblage cellulaire évident ; elle peut entraîner des phénomènes de toxicité au niveau des organes non ciblés ; enfin, l’ADN véhiculé peut être rapidement dégradé dans la circulation, s’il n’est pas protégé [8]. Les organes tels que le foie, les poumons ou les reins sont des cibles privilégiées lors d’injections systémiques du vecteur [8].

Les barrières au transfert de gène 

L’acide nucléique doit franchir de nombreuses barrières biologiques (extracellulaires et intracellulaires) pour atteindre le noyau des cellules cibles. Brièvement, l’acide nucléique doit passer la peau, première barrière biologique, puis être véhiculé jusqu’au tissu cible, passer la barrière vasculaire et les tissus conjonctifs pour enfin arriver aux cellules cibles et là passer la membrane plasmique délimitant la cellule, traverser le cytosol (en évitant les nucléases) et enfin franchir l’enveloppe nucléaire. C’est donc un parcours semé d’embûches. Pour y parvenir il est donc indispensable de disposer de moyens permettant de surmonter ces multiples barrières, et ce n’est à l’heure actuelle que grâce au développement de tels moyens que de réelles réussites en thérapie génique verront le jour. Dans ce but, différentes techniques ont été mises au point pour permettre ce transfert de gène. La maladie à traiter, la nature du gène à transférer, son mode d’action, la durée d’expression recherchée, les cellules ou tissus cibles sont autant de paramètres qui en déterminent le choix. Le vecteur idéal au transfert de gène (figure 2) devra avoir les critères suivants : (1) spécifique vis-à-vis des cellules cibles, (2) sans dissémination du gène dans tout l’organisme, (3) résistant aux dégradations métaboliques et/ou aux attaques par le système immunitaire, (4) sûr, c’est-àdire avoir le moins d’effets secondaires, et (5) capable d’exprimer de manière régulable le gène d’intérêt thérapeutique aussi longtemps que nécessaire [9]. Les méthodes de transfert de gène sont en général divisées en deux : (a) le transfert par des vecteurs biologiques viraux, (b) le transfert par des approches chimiques ou physiques qualifiées de non virales.

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Table des matières

Introduction
1 Introduction au transfert de gène
1.1 Principe
1.2 Les stratégies
1.3 Les cellules cibles
1.4 Les barrières au transfert de gène
1.5 Les vecteurs viraux
1.6 Les vecteurs non viraux
2 Electrotransfert
2.1 Historique
2.2 Mécanisme de l’électrotransfert à l’échelle de la cellule
2.3 Mécanisme de l’électrotransfert in vivo
2.4 Réalisation pratique
2.5 Tissus cibles
3 Applications thérapeutiques de l’électrotransfert
3.1 Sécrétion ectopique de protéines
3.2 Maladies musculaires
3.3 Production d’anticorps par immunisation génétique
3.4 Cancers
3.5 Electrotransfert comme un outil
4 Régulation temporelle de l’expression des gènes
4.1 Une large étendue d’applications
4.2 Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
4.3 Régulation par neutralisation du gène ou de son ARN messager
4.4 Régulation par un contrôle de l’initiation de la transcription
5 Description du projet de thèse
Matériel et Méthodes
1 Vecteurs plasmidiques
1.1 Plasmides courants
1.2 Plasmides pour la construction du système de régulation
1.3 Plasmides utilisés pour l’imagerie
1.4 Plasmides pour l’obtention d’antiserum
1.5 Purification des plasmides
2 Microbiologie
2.1 Génotypes et caractéristiques des souches d’E. coli
2.2 Milieux de culture
2.3 Préparation de bactéries compétentes
2.4 Transformation de bactéries compétentes par choc thermique
2.5 Transformation de bactéries compétentes par électroporation
3 Biologie moléculaire
3.1 Electrophorèse analytique et préparative des acides nucléiques
3.2 Extraction d’ADN
3.3 Extraction d’ARN
3.4 Traitement à la DNAse des ARN
3.5 Quantification de l’ARN et de l’ADN
3.6 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
3.7 RT-PCR
3.8 PCR en temps réel
3.9 Traitement au bisulfite
3.10 PCR nichée après traitement au bisulfite
3.11 RAIC PCR (Repeat-Anchored Integration Capture)
3.12 Séquençage
4 Biologie cellulaire
4.1 Culture cellulaire
4.2 Transfection in vitro
5 Biochimie
5.1 Dosages biochimiques
5.2 Dosages ELISA (Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay)
5.3 Immunofluorescence
5.4 Western-Blot
6 Expérimentation animale
6.1 Animaux
6.2 Anesthésie
6.3 Transfert de gènes in vivo dans le muscle squelettique de souris
6.4 Transfert de gènes in vivo en intradermique chez la souris
6.5 Transfert de gènes in vivo dans le muscle chez le lapin
6.6 Prélèvements
6.7 Histologie
6.8 Test de neutralisation
7 Imagerie du petit animal
7.1 Préparation de l’animal
7.2 Caméra CCD
8 Statistiques
Résultats
Conclusion

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