Soutenance mémoire
Traitement de l’allergie aux protéines du lait de vache
Etude de la fonction de reproduction:
Pour vérifier les conséquences de la consommation de lait de soja sur la fertilité des souris mâles, un test de fertilité est réalisé. Par la suite, Le dosage sérique de l’hormone de la testostérone, la mobilité, la morphologie ainsi que le comptage des spermatozoïdes sont étudiés dans le testicule et l’épididyme et enfin un examen histologique des testicules et des vésicules séminales est effectué les groupes expérimentaux comparées aux groupe témoin.
Test de fertilité
Au bout de 8 semaines d’expérimentations, et pendant une semaine, les animaux sont soumis à un test de fertilité, après une période d’accouplement d’une semaine, les mâles sont séparés des femelles. Le pouvoir fertilisant de chaque mâle testé est évalué en fonction de la portée qu’il a engendrée, et sur les souris issues du test de fertilité ont détermine le poids et la taille des petits au 7ème, 14ème et 28ème jour après leur naissance.
Prélèvements des organes
Après le test de fertilité, les souris expérimentales testées sont sacrifiés par dislocation cervicale. Après l’ouverture les testicules apparaissent sous forme de deux glandes ovoïdes de couleur blanchâtres, recouvertes d’une membrane mince d’albuginée. Les testicules sont retenus au fond du scrotum par un ligament qui est aussi fixé sur la queue de l’épididyme. Les vésicules séminales sont aussi prélevées . Les organes prélevés sont ensuite pesés pour la détermination du poids relatif. Le testicule gauche et la vésicule séminale sont fixés dans une solution de formol à 10%. Ces échantillons sont destinés à l’étude histologique. Le testicule droit et l’épididyme droit sont conservés pour le comptage des spermatozoïdes.
Comptage des spermatozoïdes dans le testicule
Le testicule est prélevé, pesé et finement coupé avec des ciseaux, puis homogénéisé pendant 1 minute dans 10ml de NaCl 9 ‰ contenant 5µl de triton X-100 (Merck, Allemagne). Le nombre de spermatozoïdes est déterminé en utilisant une cellule de Mallassez sur 5 grands carreaux, observés au microscope optique au grossissement 40 (Farag et al. ; 2007).
Comptage des spermatozoïdes dans l’épididyme
L’épididyme est prélevé, pesé, coupé, puis homogénéisé pendant 1 minute dans un pilulier contenant 10 ml de sérum physiologique ajoutant 5µl de triton X-100 (Merck, Allemagne). Le comptage s’effectue sur 5 grands carreaux de la cellule de Mallassez, observé au microscope optique au grossissement 40 (Farag et al., 2007).
Mobilité des spermatozoïdes
Après prélèvement des organes, l’épididyme placé dans une boîte de Pétri contenant 4 ml de sérum physiologique (0,9% de chlorure de sodium) est haché avec un scalpel puis incubé dans l’étuve à 37°C pendant 15 min. 20µl d’échantillon prélevé sont déposés sur la cellule de Mallassez (Yang et al., 2007). La mobilité des spermatozoïdes est déterminée après 10 observations microscopiques au grossissement 40. Nous avons évalué le pourcentage de mobilité en comptant les spermatozoïdes immobiles sur le fond de la lame par rapport aux spermatozoïdes mobiles évoluant à côté.
Dosage de la testostérone
Le dosage de l’hormone de testostérone est effectué par la technique immunoenzymatique par compétition à une détection finale en fluorescence (Enzyme Linked Fluorescent Assay ) (ELFA) au niveau de l’hôpital Benzardjab à Ain Témouchent . Le cône à usage unique sert à la fois de phase solide et de système de pipetage. Les autres réactifs de la réaction immunologique sont prêts à l’emploi et pré-répartis dans la cartouche. Toutes les étapes du test sont réalisées automatiquement dans l’instrument. Elles sont constituées d’une succession de cycles d’aspiration/refoulement du milieu réactionnel. L’échantillon est prélevé, puis transféré dans le puits contenant le conjugué qui est un dérivé de la testostérone marqué à la phosphatase alcaline. Il se produit une compétition entre la testostérone présente dans l’échantillon et le dérivé testostérone du conjugué vis-à-vis des sites de l’anticorps spécifique anti-testostérone fixé sur le cône. Des étapes de lavage éliminent les composés non fixés.
Croissance pondérale:
Effet du lait de soja sur la croissance pondérale :
Dans cette partie de notre travail, nous avons évalué les conséquences de la consommation du lait de soja par les souris sur l’évolution de leur poids corporel . Juste après le sevrage, le poids des souris des différents groupes est comparable sans différence significative. Ensuite l’évolution de ce poids corporel s’effectue normalement chez tous les animaux durant la période d’expérimentation, il n’ya toujours pas différence significative entre les poids atteints par les souris. Lorsqu’on compare également le gain de poids, c’est-à-dire la différence du poids entre le temps t0 et t 30, on n’observe également aucune différence significative. Ces résultats indiquent donc clairement que le lait de soja n’influe pas sur la croissance pondérale des souris ayant reçu ce produit.
Poids relatif des organes sexuels
Le poids relatif des organes sexuels est déterminé selon la relation suivante : Poids relatif d’un organe = (poids de l’organe/poids de souris) x100. Cette méthode de calcul nous renseigne sur l’évolution du poids de l’organe par rapport à celle du poids de l’organisme entier. Nos résultats montrent que les poids relatifs du testicule, de l’épididyme, et des vésicules séminales chez les mâles, ne changent pas chez les groupes ayant ingéré du lait de soja par rapport aux témoins .
Teneur en cholestérol total:
Les teneurs en cholestérol total sont représentées dans la figure 29. Les concentrations en cholestérol total sont similaires chez les groupes traités au lait de soja comparés aux témoins. En revanche, celles des souris du groupe traité au lait de soja sont significativement diminuée par rapport aux témoins et les valeurs sont respectivement (3,44 ± 0,17), (4,03 ± 0,2) et (4,24 ± 0,53) vs (5 ,35 ± 0,37 mmol/l) chez les groupes expérimentaux comparés aux témoins. (p<0,05).
Teneur en urée
Les teneurs en urée sont représentées dans la figure 30. Les concentrations en urée sont significativement augmentées chez les souris traitées au lait de soja par rapport aux témoins. Les valeurs de l’urée chez les souris sont respectivement (11,77 ± 1,13) vs (4,71 ± 0,64 mmol/1). (p<0,001).
Teneur en créatinine
Les teneurs en créatinine sont représentées dans la figure 31. Nos résultats indiquent une augmentation significative des valeurs en créatinine chez les souris ayant ingéré de lait de soja comparés aux témoins. Les valeurs sont (19,54 ± 3,45) et (15,88 ± 2,1) vs (6,75 ± 1,04 µmol/1) (p<0,001) respectivement.
Teneur en acide urique
Les teneurs en acide urique sont représentées dans la figure 32. Les concentrations en acide urique sont augmentées chez tous les groupes expérimentaux comparés aux témoins. Cette augmentation est très marquée, comparée aux témoins (p<0,01) (49,01 ± 1,59) vs (45,15 ± 1,34) mg/1 respectivement.
Teneur en transaminases TGO
Les teneurs en TGO sont représentées dans la figure 33. Les souris traitées au lait de soja présentent des valeurs faibles en TGO par rapport aux témoins. Les valeurs en TGO chez les souris traitées au lait de soja sont respectivement (316,35 ± 14,19) U/l vs (474,82±16,72) comparés aux témoins (p<0,05).
Effet de la consommation de lait de soja sur la fonction de reproduction :
L’intérêt dans cette partie du travail est d’évaluer l’effet de la consommation de lait de soja sur le potentiel reproducteur chez les souris mâles. A cet effet, différents paramètres sensibles ont été évalués (test de fertilité, mobilité, morphologie, comptage des spermatozoïdes et dosage de l’hormone testostérone).
Comptage des spermatozoïdes dans le testicule et l’épididyme
Les résultats obtenus révèlent une diminution importante et très significative du nombre des spermatozoïdes testiculaires et épididymaires chez les souris des groupes ayant ingéré du lait de soja. Nos résultats indiquent que les souris ayant ingéré du lait de soja des groupes 2 et 3 présentent une oligospermie (présence de spermatozoïdes en quantité anormalement faible) par rapport aux souris témoins. Le nombre des spermatozoïdes testiculaire passe de (8,9 ±1,72) x 106 spz/ml chez les témoins à (3,17 ±0,30) x 106 spz/ml et (3,63 ±0,36) x 106 spz/ml chez les souris des groupes 2 et 3, respectivement (figure 38) (p<0,01). De même, les résultats de la figure 39 montrent que le nombre des spermatozoïdes épididymaires a diminué très significativement chez les groupes 1, 2 et 3 ayant ingéré du lait de soja dont les valeurs sont respectivement (7,43±0,53) x 106 spz/ml, (6,5±0,41) x 106 spz/ml et (5,27±0,59) x 106 spz/ml spermatozoïdes comparé à la valeur des souris du groupe témoin (14,53±1,43) x 106 spz/ml (p< 0,01).
Effet de lait de soja sur la structure histologique du foie:
L’observation microscopique réalisée sur coloration topographique des coupes histologiques montre un parenchyme hépatique siège d’une lésion dystrophique diffuse chez tous les groupes expérimentaux. Cependant les hépatocytes sont gonflées comportant des vacuoles intra-cytoplasmiques, les noyaux sont hyper-chromatiques chez les animaux du 1er et 3 ème groupe. Ces hépatocytes sont séparés par des sinusoïdes dont la lumière est réduite ou virtuelle, parfois comblée d’hémorragie au niveau du 2ème groupe. On note au niveau des espaces porte un infiltrat inflammatoire nodulaire polymorphe fait de lymphocytes et de plasmocytes mêlées à des polynucléaires au niveau du 1er et 3éme groupe .
Effet de lait de soja sur la structure histologique des reins:
L’observation microscopique réalisée sur coloration topographique des coupes histologiques révèle que le parenchyme rénal comporte une lésion dystrophique chez tous les groupes expérimentaux ; les tubes proximaux et distaux sont tapissés d’un épithélium cylindrique simple dont le cytoplasme est vacuolaire, et la lumière est parfois réduite. Les glomérules de Malpighi sont atrophiques et collabés, l’espace de Bowman est réduit au niveau du 2ème et 3ème groupe. Le tissu conjonctif est discrètement inflammatoire fait de vaisseaux congestifs au niveau du 1er groupe.
La créatinine est strictement éliminée par les reins. Une faible partie de la créatinine produite par l’organisme est éliminée grâce au phénomène de sécrétion au niveau des tubules proximaux des reins. Son dosage est employé dans l’évaluation de la fonction rénale et plus particulièrement dans l’estimation du débit de filtration glomérulaire (Charriere et al., 2008). Cette estimation s’obtient, en pratique, par le calcul de la clearance de la créatinine.
Nos résultats ont montré que le lait de soja induit des altérations à différent degrés chez les souris ayant ingéré du lait de soja (dystrophie de l’épithélium glandulaire, hyperplasie glandulaire localisée, réduction de la taille des cellules glandulaires, accumulation du produit de sécrétion et atrophie du tissu conjonctif).
Conclusion:
Les perturbateurs endocriniens présents dans l’environnement sont de plus en plus mis en cause pour expliquer les modifications de la fonction de reproduction mâle, y compris chez l’homme. Cependant, leurs mécanismes d’action sur la fonction de reproduction sont peu connus et le lieu de causalité chez homme n’est pas démontré. Parmi les études expérimentales rapportées, les conditions d’exposition sont le plus souvent très éloignées de la situation environnementale (doses élevées, courte période d’exposition …)
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Table des matières
Introduction
Rappels bibliographiques
L’allergie alimentaire
L’allergie aux protéines du lait de vache (APLV)
Traitement de l’allergie aux protéines du lait de vache
Lait de soja
Soja
Définition
Phyto-estrogènes
Définition
Consommation, biodisponibilité et métabolisme
Soja et utilisation dans la pratique courante
Soja et ostéoporose
Soja et ménopause
Soja et le risque de cancer
Cancer du sein
Cancer de l’intestin
Cancer de la prostate
Soja et système nerveux central
Soja et système cardiovasculaire
Soja et système neuroendocrinien et immunitaire
Toxicité alimentaire
Etudes toxicocinétiques
Toxicité aiguë
Toxicité a court terme
Toxicité à long terme
Etudes de l’activité sexuelle et fertilité
Etude tératogènique
Organes cibles
Le foie
Hépatites aigues
Hépatites cytolytiques
Hépatites cholestasiques
Hépatites chroniques (cirrhoses)
Stéatose
Atteinte toxique des canaux biliaires
Toxicité vasculaire hépatique
Tumeurs hépatiques
Le rein
Vulnérabilité du rein aux toxiques
Manifestation de l’action des toxiques sur le rein
Atteintes glomérulaires
Atteintes tubulaires
La fertilité chez la souris mâle
Anatomie de l’appareil reproducteur mâle
Appareil uro-génital
Testicule
Les tubes séminifères
Epididyme
Vésicules séminales
La Spermatogenèse chez la souris
Définition
Phases de la spermatogenèse
Stades de l’épithélium séminifère
Cellules germinales associées à la phase proliférative
Cellules germinales associées à la phase méiotique
Cellules germinales associées à la spermiogenèse
Initiation de la spermatogenèse
Spermatogenèse chez les autres espèces
Spermatozoïde
Structure
Morphologie des spermatozoïdes
Testostérone
Régulation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique
Matériels et méthodes
Animaux et conditions d’élevage
Produits et réactifs
Lait utilisé
Préparation du lait de soja
Etude de la toxicité du lait de soja
Test de toxicité par le lait de soja
Protocoleexpérimental
Suivi et observations des animaux
Test de fertilité
Obtention des échantillons
Prélèvement du sang
Prélèvement des organes
Analyses biologiques
Examen hématologique
Cellule de Malassez
Mise en hématimètre
Principe de comptage
Numération des leucocytes (globules blanc)
Dosages biochimiques sériques
Dosage de l’albumine
Dosage du cholestérol total
Dosage de l’urée
Dosage de la créatinine
Dosage de l’acide urique
Dosage des transaminases
Dosage de la glutamate-oxaloacetate transaminase TGP
Dosage de la glutamate-pyruvate transaminase TGO
Etude histologique
Traitement des fragments de tissus
Déshydratation
Clarification
Inclusion
Traitement des lames
Etalement des lames
Déparaffinage
Réhydratation
Coloration
Etude de la fonction de reproduction
Test de fertilité
Prélèvements des organes
Numération des spermatozoïdes
Comptage des spermatozoïdes dans le testicule
Comptage des spermatozoïdes dans l’épididyme
Mobilité des spermatozoïdes
Détermination des anomalies
Dosage de la testostérone
Analyses statistiques
Résultats
Croissance pondérale
Effet du lait de soja sur la croissance pondérale
Taux de mortalité et les transformations morphologiques et comportementales
Effet de la consommation de lait de soja sur le poids des organes
Poids absolu du foie et du rein
Poids relatif des organes sexuels
Effet de lait de soja sur les paramètres hématologiques
Nombre des globules rouges (GR)
Nombre de globules blancs (GB)
Nombre de plaquettes
Effet du lait de soja sur les paramètres biochimiques sériques
Teneur en albumine
Teneur en cholestérol total
Teneur en urée
Teneur en créatinine
Teneur en acide urique
Teneur en transaminases TGO
Teneur en transaminases TGP
Effet de la consommation de lait de soja sur la fonction de reproduction
Test de fertilité
Effet du lait de soja sur les paramètres sexuels chez les souris mâles (spermocytogramme)
Mobilité des spermatozoïdes
Comptage des spermatozoïdes dans le testicule et l’épididyme
Comptage des spermatozoïdes par gramme de testicule et d’épididyme
Morphologie des spermatozoïdes
Dosage hormonal
Effet de la consommation du lait de soja sur la structure histologique
Effet du lait de soja sur la structure des testicules
Effet du lait de soja sur la structure des vésicules séminales
Effet de lait de soja sur la structure histologique du foie
Effet de lait de soja sur la structure histologique des reins
Discussion
Conclusion
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