Soutenance mémoire
Toxicologie d’urgence
Méthodes de recherche et de dosage
Les techniques utilisables peuvent être réparties en deux groupes
Méthodes de recherche
Elles sont bien adaptées au diagnostic toxicologique d’urgence, mais peuvent manquer de spécificité et/ou de sensibilité. On distingue les techniques de mise en évidence d’un groupe de molécules et celles adaptées à une molécule spécifique.
• Méthodes de mise en évidence d’un groupe de molécules :
La colorimétrie peut être caractéristique d’un groupement fonctionnel d’une structure chimique donnée (noyau polycyclique). C’est une méthode volontaire employée pour le liquide gastrique et les urines. Le seuil de positivité est variable (faux négatifs) et la spécificité mise en défaut si la fonction chimique se retrouve dans le milieu testé, indépendamment de l’existence du toxique (faux
positifs).
La spéctrophotométrie est utilisable pour de nombreux milieux biologiques, surtout après extraction grossière des molécules suspectes. Ces techniques sont en principe plus spécifiques que les précédentes. Les immunodosages sont proposés pour les médicaments et les stupéfiants. Adaptés à des automates, ils sont très pratiques dans le contexte de l’urgence ; ils utilisent un traceur enzymatique (EMIT) ou fluorimétrique (FIA). Les méthodes radio-immunologiques ne sont habituellement pas utilisées en urgence. Les anticorps sont préparés contre une molécule spécifique du groupe. De ce fait, lors de la recherche, le seuil de réponse peut être variable selon la molécule du groupe qui est recherchée : des concentrations thérapeutiques peuvent donner des résultats positifs si la molécule réagit bien avec les anticorps utilisés ; inversement, si la molécule ne réagit que faiblement, des concentrations toxiques peuvent donner des résultats négatifs. La notion de réactivité de groupe est donc importante lors de l’interprétation du résultat.
• Méthodes adaptées à une molécule donnée :
Ce sont la colorimétrie, la spectrométrie, la chromatographie en couche mince (CCM). Cette
dernière, d’utilisation plus ou moins facile, est adaptée à la recherche des toxiques après extraction
sommaire en milieu acide ou basique. L’utilisation lors de l’étape de révélation de diverses
réactions colorées permet l’identification du toxique.
d) Méthodes de dosage : On distingue deux grands groupes.
• Techniques adaptées à l’urgence :
Elles utilisent les principes de la colorimétrie, de la spectrophotométrie, de la fluorimétrie. Les immunodosages non radio-immunologiques, d’introduction plus récente, sont bien adaptés à l’urgence d’autant qu’ils sont disponibles sur des appareils automatisés. Il faut néanmoins en connaître les limites : possibilité de réactions croisées avec les métabolites, ayant ou non un potentiel toxique, taux surestimé dans le cas de composés réagissant avec l’anticorps utilisé (digoxinémie et substances endogènes « digoxin-like »).
• Techniques d’utilisation différée :
Leur plus grande difficulté de mise en œuvre n’en exclut pas l’intérêt, à titre rétrospectif ou lors du suivi d’une intoxication (toxicocinétique). Les techniques chromatographiques sont les plus courantes : chromatographie liquide haute performance (HPLC), chromatographie en phase gazeuse (CPG, parfois employée en urgence). Ces méthodes nécessitent un matériel particulier. L’évolution de l’informatisation et de l’électronique permettra sans doute à terme l’utilisation de l’HPLC comme technique de « semi-urgence ».
Enfin certaines méthodes nécessitent un matériel plus sophistiqué, telles que la spétrométrie
d’adsorption et d’émission atomique pour le dosage des métaux, la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase gazeuse (GC-MS), méthode de référence pour l’identification d’une molécule et la confirmation de la prise de stupéfiants ou de produits dopants.
Démarche analytique en toxicologie d’urgence
La stratégie analytique mise en place dépendra de l’équipement présent au sein du laboratoire.
Dépistage toxicologique
En l’absence de méthodes séparatives, la démarche consiste à utiliser dans un premier temps des
techniques qualitatives souvent peu spécifiques qui vont fournir en revanche des résultats présomptifs rapides et qui seront secondairement confirmés par des méthodes plus sophistiquées et plus spécifiques. Le principe du dépistage se définit comme une recherche rapide dans les milieux biologiques des toxiques les plus souvent impliqués dans l’épidémiologie locale. Il consiste ainsi à rechercher ou à exclure de manière systématique les toxiques par des méthodes analytiques simples et rapides. Ce type de dépistage tente de détecter une série de substances ciblées dans les trois milieux biologiques principaux : sang, urines et liquide gastrique et peut être envisagé en fonction des circonstances et de la présentation clinique (toxicomanie, ingestion médicamenteuse, …)
Screening toxicologique
Le progrès récent des méthodes séparatives se traduit par une utilisation plus aisée grâce à l’apport de l’informatique et à un coût d’investissement qui s’est considérablement réduit. Ce constat permet de comprendre et d’encourager le développement de ces techniques dans le cadre de l’urgence. En effet, ces méthodes essentiellement chromatographiques sont capables de détecter et d’identifier un nombre important de xénobiotiques avec une grande sélectivité. Elles font appel en général à la chromatographie sur couche mince, à la chromatographie liquide haute performance couplée à un détecteur de type barrettes de diodes ou balayage UV, automatique ou non, et à la chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse.
Après l’identification d’un toxique et chaque fois que cela sera nécessaire, la confirmation par une autre méthode sera quantitative afin de mieux documenter l’intoxication. Elle s’avère parfois nécessaire pour poser l’indication de traitements coûteux ou invasifs comme l’instauration :
– d’une hémodialyse (lithium, méthanol, éthylene glycol) ou d’une hémoper fusion (méprobamate,
phénobarbital, théophylline)
– d’un traitement antidotique (paracétamol, méthanol, éthylene gycol, digitaliques)
– d’une diurèse forcée ou alcaline (salicylés, méprobamate)
L’approche analytique en toxicologie ne peut se réduire à une seule technique même séparative. Il
est donc nécessaire de bâtir un algorithme suivant son équipement et la nature du prélèvement en
tenant compte des priorités préalablement établies avec les services cliniques.
Méthodes d’analyses utilisées au CAPM-LAB
Méthodes colorimétriques
Ces méthodes consistent à obtenir des réactions colorées développées par des composés contenus dans l’échantillon au contact de certains réactifs. Elles sont dédiées dans le laboratoire CAPM à la recherche rapide de médicaments dans les liquides biologiques notamment les urines :
– Salicylés : La recherche des salicylés se fait grâce à la réaction de Trinder (développement d’une coloration violette en présence d’ions ferriques (la fonction phenol réagit avec le chlorure de fer)) dans l’urine (après hydrolyse dans ce dernier pour transformer l’acide acétylsalicylique en acide salicylique).
– Phénothiazines : La réaction de Forrest (développement d’une coloration rose fugace par le trichlorure de fer en milieu perchlorique due à la présence des insecticides) est une des seules réactions utilisables pour la mise en évidence des phénothiazines.
-Recherche de l’imipramine par la réaction au nitrite de sodium : une réaction positive se traduit par une apparition d’un anneau bleu-vert en présence de bichromate/H2SO4/HNO3/HClO4).
Ces réactions colorimétriques sont rapides (résultat obtenu en moins d’une demie heure), ne sont pas chères, ne demandent pas beaucoup de technicité de la part du personnel, mais manquent de spécificité (risque de faux positifs) et de sensibilité (risque de faux négatifs).
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Table des matières
INTRODUCTION
PARTIE I : toxicologie d’urgence
I. GENERALITES
1. La toxicologie
1.1. Classification des toxiques
1.2. Dose-réponse
2. Conduite à tenir devant une intoxication aigue
3. Stratégies analytiques en toxicologie d’urgence
3.1 Diagnostic clinique des intoxications
3.1.1. Nature du toxique en cause
3.1.2. Circonstances de l’intoxication
3.1.3. Caractéristiques du patient
3.1.4. Délais et nature des symptômes
3.1.5. Dose toxique
3.2. Diagnostic biologique des intoxications
3.2.1. Milieux biologiques testés
3.2.2. Le prélèvement
3.2.3. Méthodes de recherche et de dosage
a) Méthodes de recherche
b) Méthodes de dosage
4. Démarche analytique en toxicologie d’urgence
4.1. Dépistage toxicologique
4.2. Screening toxicologique
5. Méthodes d’analyses utilisées au CAPM-LAB
5.1. Méthodes colorimétriques
5.2. Méthodes spectrométriques
5.3. Méthodes immunochimiques
5.4. Méthodes chromatographiques
• Chromatographie sur couche mince (CCM)
• Chromatographie liquide haute performance (CLHP)
• Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
II. Programme du travail
1. Appareillage
2. Technique du screening toxicologique
PARTIE II: MATERIELS ET METHODES
I. MATERIEL ET REACTIFS
1. Matériel technique
2. Matériel biologique
3. Réactifs
II. METHODES
1. Préparation des réactifs
2. Mode opératoire
2.1. Protocole d’extraction
2.2. Protocole d’alimentation de la bibliothèque spectrale CAPM
3. Conditions chromatographiques
4. Interprétation des chromatogrammes
RESULTATS
Résultats d’analyses de screening toxicologique par HPLC-BD
Résultats des injections des nouveaux standards effectuées dans le cadre du développement de
la bibliothèque toxicologique du centre antipoison du Maroc (CAPM-LAB)
CONCLUSION
• Screening toxicologique réalisé chez les 40 patients
• Alimentation de la bibliothèque spectrale CAPM- LAB
ANNEXES
BIBLIOGRAPHIE
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