Test moléculaire Genotype® MTBDRplus pour la détection de la résistance de Mycobacterium tuberculosis

Tuberculose et M. tuberculosis

              La tuberculose est une maladie infectieuse ayant comme agent étiologique, la bactérie Mycobacterium tuberculosis ou Bacille de Koch ou BK qui remonterait à plusieurs millions d’années (Daniel, 2006). M. tuberculosis aurait infecté les premiers Hominidés et co-évolué avec eux (Gutierrez et al., 2005). Son génome a été séquencé en 1998. Le complexe M. tuberculosis regroupe toutes les mycobactéries capables de provoquer la tuberculose : M. tuberculosis, M. africanum et M. canetti, M. bovis (responsable de la tuberculose chez les bovins), M. caprae (responsable de la tuberculose chez les chèvres), M. microti (responsable de la tuberculose chez les rongeurs), M. pinnipedii (responsable de la tuberculose chez les mammifères marins).

Histoire naturelle de l’infection tuberculeuse

               La tuberculose est une maladie qui se transmet généralement par voie aérienne et occasionnellement par voie orale ou digestive. Un individu sain se contamine par l’inhalation des gouttelettes chargées de bactéries en suspension dans l’air, émises par un malade atteint de tuberculose active lorsqu’il tousse, parle ou éternue. Le premier contact de l’organisme avec M. tuberculosis s’appelle « la primoinfection ». Après avoir traversé le tractus respiratoire, les bacilles atteignent les alvéoles pulmonaires où ils entrent en contact avec les macrophages alvéolaires qui, en général, les phagocytent, les dégradent et les éliminent. Parallèlement, d’autres cellules phagocytaires peuvent intervenir. Ces cellules recrutées vont, à leur tour, être infectées par M. tuberculosis, puis elles vont migrer, à la fois vers les organes lymphoïdes afin de permettre la mise en place d’une réponse immunitaire adaptative, mais aussi dans tout le corps, contribuant à la dissémination du bacille tuberculeux dans l’organisme (Krishnan et al., 2010). Au niveau de l’épithélium pulmonaire, une structure pluricellulaire constituée principalement de macrophages infectés et de cellules T et caractéristique de la tuberculose, le granulome, se forme (Peyron et al., 2008). Cette étape marque la fin de la phase de réplication rapide des bactéries chez l’hôte et l’évolution vers un état dit de « confinement » durant lequel la maladie ne peut se déclarer et l’hôte n’est pas contagieux. L’intervention des cellules du système immunitaire va provoquer la nécrose des macrophages infectés au centre du granulome, entraînant ainsi à la formation d’un centre nécrotique caractéristique, le caséum. Dans 90% des cas, les bactéries peuvent persister pendant plusieurs années dans ce granulome caséeux. On parle alors de « tuberculose latente » (Ulrichs and Kaufmann, 2006). Chez les 10% restants, la lésion précédemment formée se nécrose et les bacilles tuberculeux quiescents sont libérés (Smith, 2003). Les personnes infectées développent une « tuberculose active » et sont contagieux (Kaufmann, 2002). La tuberculose est une maladie typique des poumons (tuberculose pulmonaire). La tuberculose pulmonaire représente environ 85% des cas. Cependant, au moment de la circulation dans l’organisme, les bacilles tuberculeux peuvent infecter d’autres organes tels que les os, les reins, les ganglions, les méninges, l’intestin, la peau,… via les systèmes lymphatique et sanguin. Dans ce cas, ils créent de nouveaux foyers infectieux et provoquent « une tuberculose extra-pulmonaire » (Hopewell, 2005). La forme extra-pulmonaire est plus fréquemment observée chez les patients séropositifs (VIH positifs) ou ceux dont le système immunitaire ne peut plus contrôler l’infection (Golden, 2005).

Description des résultats issus de différentes étapes de la manipulation

               Cinquante souches ont été analysées avec le test Genotype® MTBDRplus dont 25 souches sont des souches sensibles à la RIF et à l’INH et 25 MDR, d’après le test de sensibilité sur milieu LJ réalisé au laboratoire des mycobactéries de l’IPM. La présente étude comporte différentes parties dont le dépôt des échantillons sur les 4 systèmes de stockage, la coloration des lames microscopiques, l’observation microscopique des lames, l’extraction d’ADN à partir des 4 systèmes de stockage, la PCR et l’hybridation reverse. Par faute de temps pour l’habilitation pour le travail en laboratoire P3, notre part de manipulation a commencé sur la partie coloration des lames microscopiques. Les résultats lors de ces différentes étapes sont comme suit :
 L’observation microscopique a montré que parmi les 50 lames, 33 ont présenté plus de 10 BAAR par champs, donc, notées 3+ tandis que 16 ont été notées 2+ et une lame notée 3+ (tableau 15).
 L’extraction de l’ADN à partir des échantillons déposés sur les 4 systèmes de stockage a été réalisée.
 Les ADN ont été amplifiés par PCR, et les amplicons hybridés avec les bandelettes du test Genotype® MTBDRplus. L’interprétation des résultats s’est déroulée comme décrit dans le paragraphe III.2.7.2.2 de la partie « matériels et méthodes ». Quelques exemples de profils de bandelette après l’étape d’hybridation sont illustrés sur la figure 11 et le résumé des résultats issus des 15 suspensions bactériennes et 50 crachats « spiked » sur les 4 systèmes de stockage sera donné dans la partie annexe.

Discussion

                   La présente étude a permis d’évaluer la détection rapide de la MDR-TB directement à partir d’ADN extrait de crachats conservés avec 4 systèmes de stockage : lames, FTAcard, Genocard et éthanol. Le test Genotype® MTBDRplus est une technique qui permet de détecter la résistance à la RIF et à l’INH et fournit un résultat après 6 à 8 heures. De plus, de nombreuses études ont déjà démontré que cette méthode constitue un outil efficace pour la détection de la MDR-TB. Les résultats du test lors de ces différentes études avaient une bonne concordance avec les résultats du test phénotypique mais ont été obtenus soit à partir de souches soit à partir des crachats (Hillemann et al., 2007; Lacoma et al., 2008; Miotto et al., 2008). D’autres études sur des méthodes moléculaires (PCR, séquençage…) utilisant des lames de microscopie, des FTAcard, des Genocard, et de l’éthanol ont été déjà réalisées (Guio et al., 2006, Miotto et al., 2008, Dubois et al., 2011, Rigouts et al., 2011 et Montenegro et al. 2003). Par contre, il s’agit ici de la première étude comparant les 4 systèmes de stockage. La sensibilité du test pour la détection de la résistance à partir des 15 souches et 15 crachats « spiked » était respectivement de 90% pour la RIF et 80% pour l’INH tandis que la spécificité était 100% pour les 2 antibiotiques. Les VPP étaient respectivement de 86,2% et 90,9% pour la RIF et l’INH tandis que les VPN étaient respectivement de 86,2% et de 82,6% (tableau 22). Les 4 systèmes de stockage présentaient les mêmes résultats. Pour détecter la résistance à partir des 50 crachats « spiked » à la RIF, la valeur de la sensibilité du test était de 80% pour le Genocard et de 84% pour les 3 autres systèmes de stockage tandis que la spécificité du test était comprise entre 96% et 100%. Les VP variaient entre 86,2% et 100% et les VN entre 81,5% et 86,2% selon le système de stockage utilisé. Pour la résistance à l’INH, le test Genotype® MTBDRplus exposait une sensibilité de 80% ou 84% et une spécificité de 88% ou 92% selon le système de stockage. Les VP variaient entre 86,4% et 90,9% et les VN entre 81,5% et 85,2% selon le système de stockage (tableaux 23, 24, 25, 26). Les valeurs obtenues sont comparables à celles d’autres études récentes réalisées à partir de crachats dans différents pays qui ont montré une sensibilité variant entre 85,7% et 95,5% et entre 75% et 100% dans la détection de la résistance à la RIF et l’INH respectivement et une spécificité variant entre 91,7% et 100% pour l’INH et de 100% pour la RIF (Marzouk et al., 2014, Jin J. et al., 2012, Anek-vorapong et al., 2010, Huyen et al., 2009, Causse M. et al., 2008). Bien que les meilleures valeurs en sensibilité et spécificité aient été observées avec le système FTAcard, aucune différence significative n’a été trouvée entre les 4 systèmes de stockage. En ce qui concerne la résistance à la RIF, la sensibilité du test n’atteignait pas le taux de 100% quel que soit le système de stockage utilisé. Cela peut être expliqué par le fait que les mutations conférant la résistance des souches à la RIF ne se trouvent pas forcément dans la RRDR de 81 paires de base du gène rpoB mais dans d’autres régions comme les codons 481, 490, 505, 534, 535, 553, 561, 571, 572, 633 et 672 (Herrera et al., 2003; Matsiota-Bernard et al., 1998; Pozzi et al., 1999) ; alors que le test utilisé ne détecte aucune mutation située en dehors de cette région. Parmi toutes les mutations génétiques conduisant à la résistance à la RIF, les mutations au niveau du codon 531 du gène rpoB ont été les plus fréquemment rencontrées (12/21). D’autres études ont montré des résultats similaires pour cette fréquence de mutations sur le codon 531 ou 533 (Akpaka et al., 2008). Une faible proportion en mutations a été détectée au niveau des codons 526, 513 et 516 (9/21). Les résultats ont montré que le test MTBDRplus a une faible sensibilité dans la détection de la résistance à l’INH. Cela pourrait être expliqué par le fait que les sondes utilisées pour détecter la résistance à l’INH dans le test Genotype® MTBDRplus sont spécifiques seulement de la mutation sur katG315 et des mutations au niveau du gène inhA sur les bases -16, -15 et -8. Or, 10 à 25% des souches résistantes à l’INH présentent des mutations en dehors de ces régions comme dans les gènes Ndh, KasA, AhpC (Hazbon et al., 2006; Seifert et al., 2015). Par conséquent, la faible sensibilité du test pour la détection de la résistance à l’INH (80% à 84% selon le système de stockage) pourrait être due au fait que certaines mutations conférant la résistance à l’INH ne se trouvent pas sur les gènes katG et inhA mais probablement sur ces autres régions. Cette faible sensibilité est en concordance avec l’étude réalisée par Miotto et al (2008) qui avait rapporté une sensibilité de 79% avec le système Genocard. Par contre, d’autres auteurs ont rapporté une sensibilité élevée (92%) pour la détection de la résistance à l’INH avec des souches de M. tuberculosis (J. Jin, 2012). Pour les mutations impliquées dans la résistance à l’INH, la majorité (13/22) se trouve au niveau du codon 315 du gène katG et le reste (9/22) soit sur les bases -15, -16 ou -8. Nos résultats sont similaires à ceux rapportés par Raveendran et al. En 2012 qui a trouvé que 86,5% des mutations conférant la résistance à l’INH se trouvaient sur le codon 315 du gène katG et le reste (4,5%) sur inhA. Leurs tests ont été faits à partir de 37 produits d’expectoration de patients TPM+ et à partir de 69 souches de M. tuberculosis obtenues après culture sur milieu liquide. La présence de certaines bandelettes ayant un profil avec l’hybridation à la fois de toutes les sondes sauvages et de quelques sondes mutées a été observée (par exemple, figure 11 n°5). Cela pourrait être expliqué par le fait que les mutations spontanées dans une population bactérienne apparaissent à des taux différents. Pour la résistance à l’INH, le taux de mutation spontanée est de 1.10-6 bacilles tandis que pour la RIF, il est de 108 bacilles. De ce fait, différentes souches de M. tuberculosis sensibles et résistantes peuvent être trouvées dans un même échantillon. Au cours de l’évaluation des 50 crachats « spiked », quelques profils ont montré que les 4 systèmes de stockage ne présentaient pas les mêmes résultats. Pour expliquer cette discordance, il faudrait d’une part, réaliser le test Genotype® MTBDRplus avec l’ADN extrait de souches et d’autre part, séquencer les gènes amplifiés. Ces analyses sont en cours.

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Table des matières

Glossaire
I INTRODUCTION 
II Généralités 
II.1 La tuberculose
II.1.1 Historique
II.1.2 Etiologie
II.1.3 Epidémiologie
II.1.4 Histoire naturelle de l’infection tuberculeuse
II.1.5 Diagnostic de la tuberculose
II.1.6 Prévention
II.1.7 Traitement de la tuberculose
II.2 La résistance de M. Tuberculosis 
II.2.1 Résistance de la souche de M. tuberculosis à un antibiotique
II.2.2 La tuberculose multirésistante
II.2.3 Méthodes de détection de la résistance
III Matériels et méthode
III.1 Matériels
III.1.1 Matériels biologiques
III.1.2 Matériels
III.1.3 Réactifs
III.2 Méthodes
III.2.1 Description de l’étude
III.2.2 Généralités sur le laboratoire P3
III.2.3 Dépôts sur les différents systèmes de stockage
III.2.4 Coloration des lames par la méthode de Ziehl-Neelsen à chaud
III.2.5 Lecture microscopique des lames
III.2.6 Extraction d’ADN
III.2.7 Test GenoType® MTBDRplus
III.3 Analyse des données
IV Résultats
IV.1 Description des résultats issus de différentes étapes de la manipulation
IV.2 Evaluation du test Genotype® MTBDRplus à partir de suspensions des 15 souches et 15 crachats « spiked » sur les 4 systèmes de conservation
IV.3 Evaluation du test Genotype® MTBDRplus avec 50 crachats « spiked » conservés avec les 4 systèmes
IV.3.1 A partir des lames
IV.3.2 A partir des FTAcard
IV.3.3 A partir des Genocard
IV.3.4 A partir de l’éthanol
IV.4 Comparaison des 4 systèmes avec les 50 crachats « spiked »
V Discussion 
VI Conclusion et perspectives
VII Références bibliographiques
VIII Annexe

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