Soutenance mémoire
TEST D’ISOLEMENT DEMOGRAPHIQUE DES DEUX SOUS‐ESPECES
Matériels et Méthodes
Présentation des marqueurs utilisés et génotypage
Populations étudiées
Les populations disponibles de la sous-espèce S. g. gregaria sont issues de campagnes d’échantillonnage menées par les correspondants locaux de chaque pays qui travaillent sur le suivi et la gestion du Criquet pèlerin. 549 individus de vingt-six populations (6 pays) ont été obtenus de cette manière et sont représentatifs de 4 années différentes (2009 à2012) (Fig. 9a et Tableau 2). Par ailleurs, six populations (186 individus) de S. g. flaviventris proviennent de l’échantillonnage d’Antoine Foucart et de Marie-Pierre Chapuis en 2011 en Afrique du Sud (Fig.9b et Tableau 2).
Quatre populations (ALDA, ALDT, ALDS et ALDZ) ne seront finalement pas étudiées car trop faiblement représentées en raison du mauvais état de conservation des tissus ne permettant pas une extraction ADN de qualité. Pour les analyses de biologie moléculaire, un morceau du fémur de la patte arrière de chaque individu a été utilisé. L’ADN des 549 individus a été extrait suivant le protocole d’extraction en colonne QIAGEN (Protocole Spin-Column pour tissus animaux du DNeasy Blood & Tissue Handbook).
Génotypage des allèles
Dans cette étude, nous utilisons 28 marqueurs microsatellites dinucléotidiques qui sont issus de deux banques de données de séquences différentes : 15 marqueurs « génomiques » dont 6 ont été décrits par d’autres équipes (Yassin et al. 2006; Kaatz et al. 2007) et 9 ont été développé au CIRAD par Laurence Blondin et MariePierre Chapuis. 13 marqueurs « transcriptomiques », développés par l’équipe du CIRAD et à partir des régions microsatellites formées de 8 à 12 motifs de séquences transcrites publiées par (Badisco et al. 2011).
Les caractéristiques (type de motif, longueur et range de taille) de ces marqueurs sont présentées en tableau 3 et en annexe 1.
Le protocole d’amplification ADN par PCR qui a été suivi est décrit en annexe 2. Afin de diminuer le nombre de PCRs, les 28 marqueurs microsatellites ont été amplifiés par la méthode de multiplexage QIAGEN (voir Protocole avec solution Q du QIAGEN Multiplex PCR Handbook). La figure 10 présente les 5 jeux de marqueurs génomiques et les 4 jeux de marqueurs transcriptomiques. Nous avons, en plus, « poolé » les produits PCR issus de 6 jeux de marqueurs deux à deux pour l’étape d’électrophorèse capillaire sur séquenceur. Nous avons alors génotypé en deux étapes : 14 populations avec 6 jeux de loci (28 marqueurs microsatellites) et 14 autres populations avec 5 jeux de loci (24 marqueurs). Nous avons considéré que 14 populations était un nombre suffisant pour représenter nos sous-espèces pour l’étude de divergence (6 populations de S. g. flaviventris et 8 populations de S. g. gregaria). Les autres populations seront utiles pour l’étude de la structuration spatiale au sein des sous-espèces.
Les produits PCR sont finalement dilués au 300ème dans une solution de formamide/marqueur de taille. Les amplicons sont alors séparés et détectés sur un séquenceur ABI130 (Applied Biosystems). Les résultats sont ensuite lus sur GeneMapper v4.1, qui permet d’observer facilement la longueur des allèles pour chaque individu.
Détermination du taux de mutation des marqueurs génomiques
Estimation du taux de mutation pour des individus d’élevage
Dans notre étude, pour s’intéresser aux mutations qui peuvent apparaître sur les marqueurs microsatellites, nous nous concentrons sur les mutations germinales. Ainsi, nous avons génotypé environ 2 000 descendants (larves de premier stade, Fig. 2) issus d’un élevage maintenu en laboratoire au CIRAD. Ceci nous permet d’avoir un suivi précis des parents de nos individus. L’élevage de ces criquets est proche des conditions naturelles (voir annexe 3) : 34°C avec une photopériode de 12h-12h, en boîtes individuelles, élevés à partir de populations naturelles mauritaniennes depuis 4 générations. Tous les parents ont ainsi subi le même traitement, ce qui devrait normalement limiter l’effet du stress sur le taux de mutation (Fonville et al. 2011).
Le génotypage des individus nous permet de repérer les mutations éventuelles en comparant leur génotype à celui de leurs parents. L’utilisation de 2 000 descendants donne ainsi accès à l’observation de 4 000 événements de méiose par marqueurs. Nous avons alors un seuil de détection des taux de mutations par marqueurs de 2,5.10-4 au maximum. Pour cette raison, il ne paraît pas possible d’estimer le taux de mutation des marqueurs « transcriptomiques » et des marqueurs qui sont courts (Lai et Sun 2003). Nous nous concentrons alors sur les 15 marqueurs « génomiques ». Cependant, trois marqueurs « transcriptomiques » sont génotypés en même temps grâce au multiplexage mais ne seront pas analysés dans le cadre de ce stage. Ceci correspondra alors à la lecture de 60 000 méioses parents-enfants, tous loci confondus.
L’extraction ADN des larves, en très grand nombre, a été faite à partir d’une patte arrière de chaque individu, directement en plaque d’extraction de 96 puits suivant un protocole proche de l’extraction en colonne QIAGEN (voir annexe 4). La concentration de l’extrait ADN de chaque individu est mesurée par Nanodrop afin de pouvoir ajuster les concentrations. Cependant, afin de diminuer le coût lié à la PCR et au génotypage de tant d’individus, nous avons optimisé la méthode en « poolant » plusieurs individus dans un même puits. Nous avons choisi de les « pooler » par 4 tout en ajustant les concentrations à plus de 1/8ème. Ce résultat provient d’une expérience préliminaire de « mutation artificielle » que nous avons menée préalablement (voir paragraphe suivant et IV.2.c.i).
Nous avons ensuite suivi le même protocole de génotypage que décrit précédemment en III.1.b pour les 15 marqueurs génomiques dont nous souhaitons estimer le taux de mutation. Deux lecteurs (Laurence Blondin et Christophe Plantamp) ont lu indépendamment les profils sur GeneMapper.
Développement d’un protocole d’amplification en pool
Le principe de cette expérience est d’identifier le nombre d’individus « frères » que nous pouvons « pooler » sans risquer de rater l’allèle mutant lorsqu’il est présent. Nous avons alors poolé des extraits ADN de larves dont le génotype est connu et simulé la présence d’un allèle mutant en choisissant un individu qui introduit un unique allèle « étranger » comparé aux autres allèles présents dans le mélange.
Nous avons, tout d’abord, testé 10 combinaisons différentes de 3, 4 et 5 individus poolés ensemble, que nous avons répétées deux fois et analysées pour trois marqueurs SgM86, SgM87 et SgM88. Les deux observations étaient répétables mais nous avons raté sur GeneMapper 9 mutations sur 38 cas pour 5 individus poolés dans un même puits, 5 sur 38 cas pour 4 individus et 3 sur 38 cas pour 3 individus. Vu cette tendance, nous nous sommes concentrés sur les pools de 4 individus par la suite. Nous avons alors testé les 10 combinaisons de 4 individus (répété 2 fois et lu 2 fois indépendamment) pour les 15 marqueurs dont nous souhaitons estimer le taux de mutation.
Nous avons ensuite analysé les résultats de ces 228 cas d’allèle « mutant » par un GLM. Nous avons cherché à expliquer quels facteurs influencent la lecture du pic « mutant », mesurée par l’aire du pic « mutant » relativement à l’aire totale. Les facteurs testés sont la distance (en paires de bases) à l’allèle plus long le plus proche, le nombre d’allèles plus courts, la concentration mesurée de l’allèle « mutant ». Les résultats de cette expérience servent à optimiser le protocole de génotypage pour l’étude d’estimation du taux de mutation afin de diminuer le nombre de PCRs.
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Table des matières
I. INTRODUCTION
1. CONTEXTE DE L’ETUDE
a. Biologie du Criquet pèlerin, une espèce ravageuse
b. Le polyphénisme de phase : un trait conditionnant la nuisibilité de l’espèce
c. Deux sous‐espèces décrites comme ayant des traits de phase différents
2. APPORT DE LA GENETIQUE DES POPULATIONS ET DEMARCHE SUIVIE LORS DE CE STAGE
a. Une approche comparative des mécanismes de la grégarisation
b. Etude de l’histoire évolutive et des processus neutres
c. Questions posées dans le cadre du stage et démarche
II. BIBLIOGRAPHIE ET HYPOTHESES
1. HYPOTHESES DEMOGRAPHIQUES POUR NOTRE ETUDE
a. Histoire paléoclimatique africaine
b. Etude de la structuration locale du Criquet pèlerin
3. SPECIFICITES DES MARQUEURS MICROSATELLITES UTILISES
a. Caractéristiques des marqueurs microsatellites des Orthoptères
b. Spécificités des marqueurs microsatellites dérivés de séquences transcrites
III. MATERIELS ET METHODES
1. PRESENTATION DES MARQUEURS UTILISES ET GENOTYPAGE
a. Populations étudiées
b. Génotypage des allèles
c. Détermination du taux de mutation des marqueurs génomiques
2. DESCRIPTION DE L’« ETAT » GENETIQUE DE L’ESPECE : SIGNATURES DE DESEQUILIBRE, DIVERSITE GENETIQUE ET STRUCTURE GENETIQUE
a. Conformité aux équilibres d’Hardy‐Weinberg et de liaison
b. Test de marqueurs sous sélection
c. Diversité au sein des populations et différentiation entre populations
d. Analyse d’excès d’hétérozygotie, signature de goulot d’étranglement
3. TEST D’ISOLEMENT DEMOGRAPHIQUE DES DEUX SOUS‐ESPECES
4. ESTIMATION DE L’HISTOIRE EVOLUTIVE NEUTRE DES SOUS‐ESPECES : TEMPS DE DIVERGENCE ET TAILLES EFFICACES
a. Présentation de l’analyse utilisée
b. Le modèle mutationnel : information « réaliste » des paramètres de nuisance
c. Le modèle populationnel : un modèle de divergence des deux sous‐espèces
d. Analyse de sensibilité du modèle à la variation de taille efficace des populations
IV. RESULTATS
1. DESCRIPTION DE LA VARIATION GENETIQUE DES POPULATIONS ET CONSTRUCTION DU JEU DE DONNEES POUR L’ETUDE DE LA DIVERGENCE
a. Conformité aux équilibres d’Hardy‐Weinberg et de liaison
b. Test de marqueurs sous sélection
c. Diversité génétique des populations
d. Structuration génétique entre populations
2. ESTIMATION DE L’HISTOIRE EVOLUTIVE NEUTRE DES SOUS‐ESPECES : TEMPS DE DIVERGENCE ET TAILLES EFFICACES
a. Comparaison des modèles démographiques
b. Estimation des valeurs de paramètres pour le modèle démographique retenu
c. Information des paramètres mutationnels : confirmation expérimentale des taux de mutation des marqueurs microsatellites utilisés
V. DISCUSSION
1. CONCLUSIONS SUR LA STRUCTURATION GENETIQUE
a. Absence de structuration au sein des sous‐espèces
b. Une différentiation entre sous‐espèces probablement sous‐estimée
2. CONCLUSIONS SUR LE MODELE ET LES PARAMETRES DEMOGRAPHIQUES
3. DEUX SOURCES DE BIAIS POTENTIELLES DANS NOS RESULTATS
a. La non prise en compte de la migration
b. Des résultats sensibles au modèle mutationnel
4. UNE ESTIMATION COHERENTE DU TAUX DE MUTATION DE NOS MARQUEURS
5. UNE MEILLEURE CONNAISSANCE DES PROCESSUS NEUTRES POUR CALIBRER LES ETUDES SUR LES TRAITS LIES A LA PHASE
6. PERSPECTIVES METHODOLOGIQUES POUR MIEUX INFORMER L’HISTOIRE EVOLUTIVE DES DEUX SOUS‐ESPECES DE S. G. GREGARIA
a. Intégrer dans l’analyse des marqueurs génétiques qui informent sur des temps anciens
b. Ajouter une population plus divergente dans l’analyse
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