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Les protéases
P. aeruginosa secrète un certain nombre de protéases qui contribuent à sa virulence. La protéase alcaline (aprA), l’élastase A (lasA), l’élastase B (lasB) et la protéase IV sont les protéases les plus importantes connues dans la pathogénicité de P. aeruginosa [47].
La protéase AprA et l’élastase LasB présentent un certain nombre d’activités similaires comme la dégradation des éléments du système immunitaire tels que les composants du complément (C1q et C3), l’immunoglobuline A ainsi que l’interféron gamma et le facteur alpha de nécrose tumorale de l’hôte (TNF-α) [109].
Les élastases LasA et LasB sont responsables de la dégradation de l’élastine, un des composants majeurs de l’épithélium respiratoire, conduisant à la perméabilisation de l’épithélium facilitant l’action des autres facteurs de virulence tels que les LPS [1, 47, 110]. L’élastase LasA joue également un rôle important dans la maladie du poumon et de la cornée chez l’Homme [14, 72]. La protéase IV purifiée présente une activité protéase et peut digérer un certain nombre de protéines biologiquement importantes, notamment les immunoglobulines, les composants du complément, le fibrinogène et le plasminogène [28].
Les rhamnolipides
Les rhamnolipides sont des glycolipides extracellulaires issus de l’expression des gènes rhlA, rhlB et rhlC [102]. Ils jouent un rôle de biosurfactant de type amphiphile et peuvent émulsifier les phosphates membranaires. Ils participent également à la structuration du biofilm, notamment dans la croissance des microcolonies et le détachement des bactéries du biofilm [101].
Les phénazines
Il s’agit de pigments ayant des propriétés antibiotiques secrétés par P. aeruginosa dans son environnement pour contrôler les autres organismes compétiteurs. Les plus connues sont la pyocyanine qui est une molécule zwittérionique de couleur bleue facilement diffusable au travers de membranes biologiques, destinée à éliminer les microorganismes concurrents [24] et la pyoverdine qui est un sidérophore du fer jouant plusieurs rôles dans la virulence de P. aeruginosa notamment dans la formation de biofilm à travers des mécanismes impliquant des interactions complexes de sous-populations de la bactérie [129].
Mécanismes du quorum sensing, régulateur des facteurs de virulence
Généralités
Mise en évidence par les travaux de Tomasz sur la compétence chez Streptococcus pneumoniae [111] et Hasting chez les deux bactéries marines luminescentes Vibrio fischeri et Vibrio harveyi [65, 66], la communication cellulaire des type Q.S, procurant aux bactéries une meilleure résistance, survie ou adaptation à leur environnement, se définit comme un mécanisme de régulation de l’expression des gènes en réponse à l’augmentation de la densité cellulaire [93]. Ceci se traduit par la capacité des bactéries à percevoir leurs congénères à travers la production, la sécrétion puis la détection de molécules de signalisation propres à chaque espèce bactérienne. A cette notion de détection appelée « sensing », s’ajoute une notion de seuil ou « quorum » amenant les bactéries à percevoir les molécules de signalisation émises dans le milieu environnant, lorsque ces dernières atteignent une certaine concentration critique [62, 123]. Aussi, la mise en évidence de l’action simultanée de ces deux notions de « détection » et de « seuil » conduit l’ensemble d’une population bactérienne à modifier de manière coordonnée l’expression de gènes lui conférant ainsi de nouvelles propriétés.
Molécules du quorum sensing
Ce mécanisme repose sur la synthèse de petites molécules signal autoinductrices, comme les N-acyl-homosérines lactones (AHLs), qui diffusent de façon continue vers l’intérieur et l’extérieur des cellules bactériennes [23, 123, 124]. Le terme « auto-inductrice » est attribué à ces molécules signal car ces dernières induisent leur propre production [23, 62]. La concentration de ces AHLs augmente avec la concentration bactérienne dans une niche particulière [124]. Lorsque le seuil de concentration critique est atteint, ceci indique que la population bactérienne est prête pour la coordination de comportements particuliers [18, 62].
Mécanismes chez P. aeruginosa
Le mécanisme du Q.S chez P. aeruginosa est constitué d’un réseau très large et complexe influençant, positivement et négativement, la transcription d’environ 5 à 10 % du génome de P. aeruginosa [119, 120].
La transcription de la plupart des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez P. aeruginosa est sous le contrôle de trois systèmes du Q.S à savoir le système las, le système rhl, qui emploient tous deux des molécules signal appartenant à la famille des N-acyl-homosérinelactones (AHLs), et le système PQS qui utilise des molécules de la classe des 2-alkyl-4-quinolones (AQ) comme molécules signal [19, 40, 70, 71, 124]. Toutefois, en amont de ces trois systèmes existent d’autres régulateurs pouvant influencer l’ensemble du mécanisme. La figure 4, schématise ce mécanisme du Q.S chez P. aeruginosa.
Le système las
Le système las représente le premier système à avoir été décrit. Ce système comprend le gène lasR et le gène lasI [34, 71]. Le gène lasR code pour la protéine régulatrice LasR, qui appartient à la famille du régulateur transcriptionnel de type LuxR [106] tandis que le gène lasI code pour une enzyme synthase LasI, nécessaire à la synthèse de la N-(3- oxododécanoyl)-L-homosérine lactone (ou 3-oxo-C12-HSL) [27, 104]. Dans le système las, le complexe LasR/3-oxo-C12-HSL se forme lorsqu’un seuil critique de concentration en 3-oxo-C12-HSL est atteint dans l’environnement ou évolue la bactérie. Il en résulte une activation de l’expression du gène lasI, d’où l’installation d’une boucle de rétroaction positive du complexe LasR/3-oxo-C12-HSL [104, 124]. Parallèlement, ce complexe active l’expression des gènes de virulence et augmente la production des facteurs de virulence tels que les protéases (élastase LasB, protéase LasA, protéase alcaline Apr et exotoxine A) [43]. De même, le système las influence positivement les gênes rhlI et rhlR du système rhl. Cette relation hiérarchique entre las et rhl est dépendante de la croissance bactérienne [55, 120]. Notons que P. aeruginosa est capable de produire d’autres AHLs tels que 3-oxo-C6-HSL, 3-oxo-C8-HSL, 3-oxo-C10-HSL et 3-oxo-C14-HSL mais en très faible quantité et à faible capacité d’activation de son Q.S [10, 35, 68, 125].
En terme de virulence, la 3-oxo-C12-HSL présente chez l’hôte une activité immuno-modulatrice [89, 108]. La 3-oxo-C12-HSL joue un rôle dans l’infection en inhibant la prolifération lymphocytaire, en réduisant la production de TNF-α induite par le lipopolysaccharides de P. aeruginosa et en stimulant la vasodilatation. De plus, il a été démontré in vivo et in vitro que la 3-oxo-C12-HSL accélère l’apoptose des macrophages et des polynucléaires neutrophiles [107]. En conséquence, la 3-oxo-C12-HSL n’exerce pas uniquement un rôle de régulation de la virulence dépendant du Q.S mais agit aussi directement sur les défenses de l’hôte pour augmenter les chances de survie des bactéries.
Le système rhl
Le système rhl comprend le gène rhlR, codant pour la protéine régulatrice RhlR, et le gène rhlI, codant pour la synthase RhlI nécessaire à la synthèse de la N-butanoyl-L-homosérine lactone (C4-HSL) [27, 104]. Comme évoqué précédemment, l’expression des gènes rhlR et rhlI est régulée positivement par le complexe LasR/3- oxo-C12-HSL mettant le système las en premier dans la hiérarchie du mécanisme du Q.S chez P. aeruginosa [19, 120, 124]. Par ailleurs, l’expression de rhlR induit à la fois l’expression de rhlI et la production de la protéine régulatrice RhlR. Lorsque la concentration en C4-HSL atteint un seuil critique, une molécule de C4-HSL se lie a deux protéines RhlR et le complexe (RhlR)2/C4-HSL active la transcription de plusieurs gènes, notamment l’opéron rhlAB nécessaire à la production de rhaminolipides, l’opéron phzABCDEFG nécessaire à la production de pyocyanine, les gènes lasA et lasB nécessaires à la production de l’élastase, le gène aprA nécessaire à la production de protéases ainsi que gènes des lectines cytotoxiques et l’acide cyanhydrique [5, 11, 97, 119, 126].
L’autoinducteur PQS
Chez P. aeruginosa, ce système utilise un auto-inducteur appartenant à la classe des 2-alkyl-4-quinolone (AQ), la 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone appelé également PQS d’où le nom de système PQS [22]. Les molécules PQS sont produites à la fin de la phase exponentielle de croissance de la souche sauvage de P. aeruginosa. La synthèse de PQS est sous le contrôle de deux opérons : pqsABCDE et phnAB. L’expression de ces deux opérons est régulée positivement par le facteur transcriptionnel associe à la virulence PqsR connu sous l’ancien nom de MvfR [21].
L’opéron phnAB permet la synthèse de l’anthranilate via l’anthranilate synthase. L’action des protéines PqsA, B, C et D sur l’anthranilate génère la molécule 4-hydroxy-2-heptylquinoline (HHQ). Cette dernière est transformée en PQS suite à une oxydation par PqsH dont l’expression est contrôlée par LasR [22]. D’une part, PqsR forme un complexe avec HHQ et se lie au promoteur de psqA entrainant une augmentation majeure de PQS. D’autre part, le PQS forme également un complexe avec PqsR et se lie aux promoteurs de pqsA, rhlR et phnA, régulant positivement leur expression. Le PQS agit donc comme un co-inducteur de PqsR [118].
Le système PQS intervient comme une voie de liaison entre les deux systèmes précédents, surtout lors des situations de stress [59]. La synthèse et la bioactivité de PQS dépendent respectivement des systèmes las et rhl [71]. En effet, la transcription des gènes nécessaire à la synthèse de PQS est régulée positivement par LasR et négativement par le système rhl [25] puisque le complexe (RhlR) 2/C4-HSL régule négativement la transcription de PqsA et PqsR. Toutefois, ce troisième système peut contrôler l’activation du système rhl indépendamment du système las [24, 100]. L’opéron pqsABCDE contient également un gène qui code pour une protéine PqsE qui n’est pas requise pour la biosynthèse de PQS mais qui est un effecteur majeur de virulence du système PQS en augmentant le niveau de production de plusieurs facteurs de virulence tels que pyocyanine, lectine, rhaminolipides et acides cyanhydriques. Additionnellement, le PqsE seul suffit à réguler les gènes de virulence via le système rhl et la protéine RhlR [30]. Ainsi, une mutation du gène pqsA ou pqsE réduit significativement la virulence de P. aeruginosa dans un modèle infectieux sur plantes et animaux [21, 82].
La modulation du mécanisme de Q.S et de la formation du biofilm chez les bactéries pathogènes constituent une stratégie d’approche innovante de plus en plus explorée dans la lutte contre les infections bactériennes [54, 6].
Etudes des caractères culturaux
Toutes les boites de Pétri ayant des types colonies uniques sont observées, après 24 h d’incubation, à l’oeil nu ou à l’aide de loupe binoculaire pour dégager les 7 caractéristiques macroscopiques :
la taille de la colonie
la chromogenèse
la forme du relief
l’aspect de la surface
l’allure du contour
la consistance
la transparence.
Etudes des caractères morpho-structuraux
Toujours à partir de souche jeune de 24 h, un prélèvement de chaque souche pure est monté entre lame et lamelle, avec de l’eau distillée stérile comme liquide de montage. Les préparations, sans colorations, ni réactifs, sont alors observées au microscope optique et les caractères microscopiques suivantes sont notés :
la morphologie cellulaire
le mode de groupement
la mobilité de chaque cellule.
Etudes des caractères membranaires : coloration Gram
Après un prélèvement de colonie isolée de 24 h et son étalement sur une lame porte-objet propre et dégraissée, une fixation à température douce sur une plaque chauffante est exécutée. Puis, une coloration du frottis par une solution d’oxalate de cristal violet en une durée de 1 min est effectuée.
La préparation est soumise à un mordançage pendant 1min dans une solution de Lugol stabilisé puis rincée abondement à l’eau.
Après mordançage, le frottis est décoloré à l’aide de l’alcool acétoné qui est un différenciateur lent, pendant 30 s. Cette étape est suivie d’un rinçage à l’eau.
Finalement, une recoloration par une solution de Safranine est entreprise pendant une durée de 1 min avant un lavage à l’eau. L’ensemble est alors laissé sécher sur une plaque chauffante pour une nette observation au microscopie optique.
Conservation de souches
Etape primordiale pour toute étude plus poussée des souches bactériennes isolées, purifiées et identifiées dans le futur, la conservation a pour objectif de les maintenir viables et à portée de main en un laps de temps plus ou moins important.
Plusieurs moyens sont disponibles actuellement et notre choix est porté sur la conservation à basse température.
Principes
Une réduction conséquente de la température ralentit et même stoppe les mécanismes biochimiques intercellulaires mais n’altère aucunement la viabilité. Les bactéries demeurent donc figées mais totalement préservées.
Conservation à court terme
Les souches pures isolées sont repiquées en stries d’épuisement serrées et parallèles dans des tubes à vis contenant de la gélose nutritive en pente.
Chaque tube est incubé durant une période de 24 h à une température de 37°C. Après développement de colonies isolées indemnes de contamination, les tubes sont placés au réfrigérateur à 4°C.
Conservation à moyen terme
Deux à trois colonies de souches, jeunes de 24 h, sont prélevées à l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée, puis introduites dans des cryotubes stériles renfermant 1ml d’un mélange glycérine/eau distillée stérile de 75/25 (v/v).
Les cryotubes étiquetés sont disposés dans des cryoboxes placés au congélateur droit à une température de -20°C.
Evaluation de l’activité LacZ
Les 100 μl de suspension sont diluées 4 fois dans un tampon de perméabilisation puis incubés à 37°C pendant une durée de 30 min.
Vingt (20) μl de chacune des dilutions sont aliquotés dans une autre plaque de 96 puits. Après incubation, 120 μl de substrat oNPG [Annexe III] [130] sont ajoutés dans chaque puits et de nouveau, une incubation à la même température est réalisée. Néanmoins, selon la rapidité de la réaction, la période d’incubation peut varier entre 5 à 60 min.
La réaction est interrompue grâce à l’addition de 150 μl à 1M d’une solution de Na2CO3 et une lecture de la D.O à 420 nm est alors opérée.
L’activité LacZ est calculée en utilisant la formule : 𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒕é 𝑳𝒂𝒄𝒁 (𝑼𝒏𝒊𝒕é 𝑴𝒊𝒍𝒍𝒆𝒓)=𝟏𝟎𝟎𝟎×𝑨𝟒𝟐𝟎𝑨𝟔𝟎𝟎×𝒗×𝒕×𝒅
A420 : Absorbance de l’ortho-nitrophénol
A600 : Densité bactérienne
v : volume de la suspension bactérienne en ml
t : temps d’incubation de la réaction en min
d : facteur de dilution
Réisolement des phytopathogènes
Des prélèvements de tiges et de feuilles des plantes dont le postulat est vérifié sont effectués. Après des étapes d’isolement sur milieu gélosé N.A additionné de cyclohexémide à 200 mg.l-1, une prépondérance de colonies macroscopiquement semblables respectivement aux bactéries Pc1.4, Pc5.2 et Pc9.2 est constaté.
SUIVI MICROBIOLOGIQUE DES RECETTES
Préparation des moyens de lutte
A la fin de la macération de 2 semaines, les bidons en plastique entrouverts laissent s’échapper une odeur particulièrement fétide. Elle est très marquée pour la préparation n°10 mais parait moindre pour la recette n°3. Une nappe microbienne blanche affleure sur la surface des moyens de lutte alors que des restes de broyats de plantes floculent légèrement au milieu.
Les matières organiques solubles sont quant à elles très visqueuses au fond des bidons.
Numération de la flore aérobie totale
Deux boîtes de Pétri par dilution sont ensemencées pour cette étude. Après 24h d’incubation à 25°C, un nombre important de colonies superposées se sont développées à la surface du milieu N.A.
Aucun décompte n’a été possible dans les boites ayant les dilutions allant de 10-1 à 10-6 Une nappe importante de bactéries s’est dévéloppée sur la surface de chaque gélose empêchant de distinguer la moindre colonie en croissance. Néanmoins, la dilution 10-7 offre un développement assez isolé de divers types de colonies pouvant être dénombrés. Ainsi, deux décomptes par boîte sont effectués pour les recettes à 7 et 15 jours de macération.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : REVUE DE LA LITTERATURE
1. La pomme de terre
1.1.Historique
1.2.Position systématique
1.3.Botanique
1.3.1. Appareil aérien
1.3.2. Appareil souterrain
1.4.Cycle végétatif
1.4.1. Dormance
1.4.2. Germination
1.4.3. Croissance
1.4.4. Tubérisation
1.4.5. Floraison et fructification
1.4.6. Déclin
1.4.7. Repos végétatif
1.5.Valeurs biologique
1.6.Epidémiologie
1.6.1. Pourriture annulaire bactérienne
1.6.2. Jambe noire
1.6.3. Pourriture brune
1.6.4. Pourriture molle bactérienne
1.6.5. Gale commune
2. Pseudomonas aeruginosa, un modèle bactérien
2.1.Caractéristiques
2.2.Position systématique
2.3.Identification
2.4.Les facteurs de virulence de Pseudomonas aeruginosa
2.4.1. Les facteurs de virulence associés à la bactérie.
2.4.1.1. Le biofilm
2.4.1.2. Les lipopolisaccharides et exopolysaccharides
2.4.2. Les facteurs de virulence extracellulaires
2.4.2.1. Les protéases
2.4.2.2. Les rhaminolipides
2.4.2.3. Les phénazines
2.5.1. Généralités
2.5.2. Molécules du quorum sensing
2.5.3. Mécanismes chez P. aeruginosa
2.5.3.1. Le système las
2.5.3.2. Le système rhl
2.5.3.3. L’autoinducteur PQS
DEUXIEME PARTIE : METHODOLOGIE
1. Recherche de bactérie responsable de maladies de la pomme de terre
1.1. Extraction d’endophytes de la pomme de terre
1.1.1. Etapes préliminaires
1.1.2. Isolement des endophytes
1.1.3. Purification des souches bactériennes
1.2. Identification préliminaire.
1.2.1. Etudes des caractères culturaux
1.2.2. Etudes des caractères morpho-structuraux
1.2.3. Etudes des caractères membranaires : Coloration Gram.
1.3.Conservation de souches
1.3.1. Principes
1.3.2. Conservation à court terme
1.3.3. Conservation à moyen terme
1.4.Postulats de Koch
1.4.1. Principe
1.4.2. Conditionnement des semences
1.4.3. Préparation des inocula
1.4.4. Postulat in vivo
1.4.4.1. Inoculation des plantes saines
1.4.4.2. Observations
1.4.4.3. Ré-isolement de microorganismes bactériens
1.4.5. Postulat in vitro
1.4.5.1. Prélèvement et désinfection en surface
1.4.5.2. Conditionnement, inoculation et incubation
1.4.5.3. Observations
2. Suivis microbiologique des recettes
2.1.Préparation des moyens de lutte antimicrobiens
2.1.1. Collecte des explants
2.1.2. Préparation des moyens de lutte
2.1.2.1. Ady gasy n°1
2.1.2.2. Ady gasy n°2
2.1.2.3. Ady gasy n°3
2.1.2.4. Ady gasy n°4
2.1.2.5. Ady gasy n°5
2.1.2.6. Ady gasy n°6
2.1.2.7. Ady gasy n°7
2.1.2.8. Ady gasy n°8
2.1.2.9. Ady gasy n°9
2.1.2.10. Ady gasy n°10
2.2.Numération de la flore aérobie totale
2.2.1. Prélèvements
2.2.2. Dilutions
2.2.3. Ensemencement
2.2.4. Lecture des résultats
2.3.Isolement, purification et identification de la flore bactérienne des recettes
2.3.1. Isolement
2.3.2. Purification
2.3.3. Identification préliminaire
2.3.4. Conservation
2.4.Culture fermentative des microorganismes bactériens
2.4.1. Principes
2.4.2. Rajeunissement des souches
2.4.3. Préparations des inocula
2.4.4. Mise en culture
2.4.5. Lecture
3. Extractions physico-chimiques
3.1.Principe
3.2.Extractions des métabolites secondaires
3.3.Extractions totales de produits de fermentation
4. Test d’activités antibactériennes
4.1.Etapes préliminaires
4.1.1. Rajeunissement des souches
4.1.2. Préparation des inocula
4.2.Test d’interaction bactérie-bactérie
4.2.1. Princip
4.2.2. Ensemencement
4.2.3. Dépôt des antagonistes et incubation
4.3.Test de diffusion sur gélose
4.3.1. Principe
4.3.2. Ensemencement
4.3.3. Méthode des disques
4.3.4. Méthode des puits
4.4.Test de de détermination de la CMI par microdilution
4.4.1. Principe
4.4.2. Test proprement dit
4.4.3. Incubation et lecture
5. Recherche d’activités anti-quorum sensing
5.1.Gènes d’intérêts
5.2.Matériels biologiques
5.3.Etude de la croissance de Pseudomonas aeruginosa
5.3.1. Principe
5.3.2. Rajeunissement
5.3.3. Préparation d’inoculum
5.3.4. Ensemencement
5.3.5. Lecture de la turbidité
5.4.Test d’activité LacZ (β-Galactosidase).
5.4.1. Principe
5.4.2. Conservation à long terme des souches
5.4.4. Préparation des souches pour le test
5.4.5. Culture
5.4.6. Mesure de la densité bactérienne
5.4.7. Evaluation de l’activité LacZ .
5.5.Quantification de la pyocyanine
5.5.1. Préculture
5.5.2. Préparation des suspensions de Pseudomonas pour le test
5.5.3. Culture
5.5.4. Quantification de la production de pyocyanine
6. Recherche d’activités anti-formation du biofilm
6.1.Principes
6.2.Matériels
6.3.Préculture
6.4.Préparation des souches pour le test
6.5.Culture
6.6.Révélation et mesure de l’importance du biofilm
TROISIEME PARTIE : RESULTATS
1. Recherche de bactéries responsables de maladies de la pomme de terre
1.1.Extraction d’endophytes de la pomme de terre
1.1.1. Isolement
1.1.2. Purification
1.2.Identifications préliminaires
1.3.Postulat de Koch
1.3.1. Postulat in vivo
1.3.2. Postulat in vitro
1.3.3. Réisolement des phytopathogènes
2. Suivi microbiologique des recettes
2.1.Préparation des moyens de lutte
2.2.Numération de la flore aérobie totale….
2.3.Isolement, purification et identification
2.4.Culture fermentative
3. Extractions physico-chimiques
4. Tests d’activités antibactériennes
4.1.Tests d’interaction bactérie-bactérie
4.2.Diffusion sur gélose
4.2.1. Méthode des disques
4.2.2. Méthode des puits
4.3.Test de détermination de la CMI par microdilution
5. Recherche d’activités anti-quorum sensing
5.1.Croissance de Pseudomonas aeruginosa
5.2.Test d’activité LacZ
5.2.1. Effet des extraits sur les gènes lasB et rhlA
5.2.2. Effet des extraits sur le gène aceA
5.2.3. Effet des extraits sur les gènes AHL-synthétase et régulateurs….
5.3.Quantification de la production de pyocyanine
6. Recherche d’activités anti-formation du biofilm
QUATRIEME PARTIE : DISCUSSIONS
1. Phytopathologie de la pomme de terre
2. Microbiologie des recettes
3. Extractions physico-chimiques
4. Activités antibactériennes
5. Activités quorum quenching
6. Activités anti-formation du biofilm
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
REFERENCES
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