Technologies d’édition du génome

Épidermolyse bulleuse dystrophique

L’épidermolyse bulleuse dystrophique (EBD) est un type d’EB dont la prévalence est d’une personne affectée sur 500 000.30 L’EBD est causée par une mutation dans le gène codant pour le collagène VII, soit le COL7A1.31 La maladie entraîne la formation de cloques causées par un problème au niveau du collagène servant à l’ancrage des fibrilles à la sub-lamina densa. Leur fonction en est alors altérée ou provoque littéralement leur absence.32; 33 La sévérité de la maladie dépend de la localisation et de la nature de la mutation dans le gène affecté.33 L’EBD comprend deux sous-types, soit les formes dominantes (EBDD) et récessives (EBDR), qui diffèrent par leur mode de transmission.28; 32; 34 Dans certains cas, on retrouve une composante systémique de la maladie, de même que l’affectation des muqueuses.35 À l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement curatif pour traiter définitivement la maladie, mais divers essais impliquant des technologies d’édition du génome ont été réalisés avec succès sur ce types d’EB.36; 37 Également, des conseils pour aider les patients atteints de la maladie impliquent le port de vêtements adaptés et des conseils à donner aux professionnels de la santé qui pourraient notamment traiter les patients.35; 38-40

Épidermolyse bulleuse jonctionnelle

L’épidermolyse bulleuse jonctionnelle (EBJ) est un autre type d’EB pour laquelle la prévalence est d’un individu atteint pour 350 000 personnes.30 L’EBJ entraîne également la formation de cloques, cette fois-ci causées par un problème au niveau de la lamina lucida de la membrane basale de la peau.28 La maladie est causée par une mutation dans le gène LAMA3, LAMB3, LAMC2, COL17A, ITGB4 ou ITGA6.28; 41-43 Une mutation dans l’un d’entre eux entraîne l’absence ou la réduction de la production de la protéine.28 Ce phénomène est généralement causé par un codon de terminaison présent prématurément, ce qui peut entraîner la formation d’une protéine tronquée.44 La maladie se divise en plusieurs sous-types : l’EBJ-généralisée sévère (auparavant Herlitz), l’EBJ-généralisée intermédiaire (auparavant non-Herlitz) et l’EBJ-localisée.28; 43 Ces formes se distinguent entre elles par les gènes sur lequel se situe la mutation causant le phénotype de la maladie. Par exemple, les patients atteints de la forme généralisée sévère auront davantage des mutations dans les gènes liés à la laminine que ceux atteints de la forme généralisée intermédiaire pour laquelle la mutation responsable sera située dans d’autres gènes comme COL17A1.43 Pour soulager quelque peu les patients, des mesures comme le choix des fibres constituant les vêtements peuvent être mises en place puisque certaines pourraient notamment éviter d’aggraver les blessures.

Syndrome de Kindler

Le syndrome de Kindler (SK) fait partie du regroupement des épidermolyses bulleuses puisqu’il entraîne la formation de cloques à divers niveaux de la peau pendant l’enfance, soit au niveau des kératinocytes basaux, de la lamina lucida ou de la lamina densa.45; 46 Des anormalités dans la pigmentation, de même qu’une atrophie de la peau, sont d’autres symptômes de la maladie qu’il est possible d’observer.46 La maladie est causée par une mutation dans le gène codant pour la kindlin-1 (FERMT1), une protéine permettant la connexion du cytosquelette d’actine des kératinocytes basaux à la matrice extracellulaire.32 La kindlin-1 joue également un rôle dans l’adhésion cellulaire.32 Les symptômes sont généralisés et les personnes atteintes ont davantage de risques de développer des carcinomes à cellules squameuses.28 Un traitement curatif n’est pas disponible. Toutefois, un regroupement d’experts en maladies dermatologiques ont conçu un guide comprenant des manières de soulager quelque peu les malades, de par le port de vêtements ou de bandages adaptés à leur condition.

Épidermolyse bulleuse simplex

L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) est une maladie rare de la peau dont la prévalence est d’un patient atteint pour 35 000 à un sur 150 000 au niveau mondial.47 La maladie se transmet généralement de façon autosomique dominante, bien que, dans certains cas, la transmission soit récessive.48-50 Les formes récessives comprennent, entre autres, l’EBS avec pigmentation mouchetée (EBS-PM), l’EBS avec dystrophie musculaire (EBS-DM) et l’EBS avec atrésie pylorique (EBS-AP).32 Dans la majeure partie des cas, la maladie est causée par une mutation dans le gène KRT5 ou KRT14 codant respectivement pour les kératines (K) 5 et 14.28 Ces deux kératines, exprimées par les kératinocytes basaux de l’épiderme, se lient normalement entre elles pour former les hétérodimères de kératines permettant de maintenir le cytosquelette des kératinocytes de la couche basale.28 Une mutation entraîne des malformations au niveau des kératines occasionnant un clivage intra-épidermique, provoquant une fragilité extrême de la peau.51 Un léger frottement, comme le frottement des vêtements sur le corps, peut entraîner la formation des cloques caractéristiques de la maladie. De l’infection et de l’inflammation figurent aussi parmi les symptômes visibles. D’autres gènes comme PLEC, EXPH5 et KLHL24 peuvent également être la cause de la maladie, mais sont responsables de sous-types plus rares d’EBS.28; 52-55 Les gènes pouvant être associés à l’épidermolyse bulleuse simplex sont présentés dans le Tableau 2.
Plusieurs formes de la maladie existent et leur sévérité se distingue par plusieurs facteurs, dont la localisation de la mutation dans le gène causant l’EBS, la localisation des cloques sur le corps du patient et le degré de clivage de la peau.17; 19 Fine et ses collaborateurs ont fait la plus récente classification des sous-types d’EBS.28 Ces trois formes d’EBS sont les formes localisée, généralisée intermédiaire et généralisée sévère.28 Les différentes mutations reponsables de l’épidermolyse bulleuse simplex sont présentées dans la Figure 5 et sont issues de la Human Intermediate Filament Database.

Épidermolyse bulleuse simplex localisée

La forme localisée (EBS-loc), autrefois appelée Weber-Cockayne, est la forme d’EBS la moins sévère.28 Les cloques sont présentes sur la paume des mains et la plante des pieds. Les premiers symptômes apparaissent généralement tôt à l’enfance, au moment auquel l’enfant commence à marcher et par le fait même, à se traîner sur le sol, engendrant un trauma mécanique important.28 Les cloques ainsi formées ne créent pas de cicatrices visibles après le processus de cicatrisation, comparativement aux autres sous-types d’EBS.18; 26 Les mutations causant l’EBS-loc se situent plus fréquemment dans le domaine 2B de la protéine mutée, soit davantage dans le corps de la protéine.17; 57 Toutefois, en 2009, il a été démontré qu’une mutation dans le domaine A1 de la kératine 5 pouvait causer la maladie,58 alors que des mutations dans le domaine L12 ont été détectées par une autre équipe de cherche plusieurs années auparavant.

Épidermolyse bulleuse simplex généralisée intermédiaire

La forme généralisée-intermédiaire (EBS-gen), appelée auparavant Koebner, est la forme intermédiaire des EBS. Cette forme provoque l’apparition de cloques à différents endroits sur le corps.60 Les cloques sont plus localisée que dans les cas les plus sévères.26 Les premiers symptômes de l’EBS-gen apparaissent dès la naissance de l’enfant ou très tôt dans l’enfance.28; 57 Les mutations causales se trouvent habituellement dans le corps du gène portion centrale). Des études immunochimiques ont permis d’observer les agrégats de tonofilaments dans les kératinocytes basaux qui sont des caractéristiques particulières à ce sous-type d’EBS.

Épidermolyse bulleuse simplex généralisée sévère

La forme généralisée sévère (EBS-gen sev), autrefois connue sous le nom d’EBS Dowling-Meara, est la forme d’EBS la plus sévère.28 La présence de cloques est généralisée, et donc située partout sur tout le corps.26 Les cloques apparaissent dès la naissance de l’enfant, affectant grandement sa qualité de vie et peuvent mener à son décès en très bas âge dans les formes les plus extrêmes.26; 61 Le kératoderme palmoplantaire ainsi qu’une dystrophie des ongles peuvent également être observés chez les enfants atteints.
Généralement, les mutations causant la maladie se situent autour de l’initiation de l’hélice alpha et des motifs de terminaisons en périphérie des domaines A1 et 2B.

Autres phénotypes associés à l’EBS

L’EBS peut être associée à différents phénotypes des formes dominantes de la maladie. La première est l’épidermolyse bulleuse simplex avec pigmentation mouchetée (EBS-PM), une forme autosomale dominante. Parmi les symptômes se trouve la présence de cloques, comme c’est le cas pour les autres sous-types de la maladie. Les cloques peuvent se retrouver, dépendamment des personnes, à un endroit précis sur le corps ou réparti de façon aléatoire. Leur répartition est similaire à la forme localisée ou à la forme généralisée.62 L’apparition des cloques se produit à la naissance.28 Comme le nom de la maladie l’indique, la peau du patient présente une pigmentation mouchetée, c’est-à-dire que des taches brunes sont présentes sur la peau du tronc et des membres.28; 63 Les mutations causant l’EBS-PM se situent généralement dans la partie centrale de la protéine, soit le domaine rod alpha hélicoïdal, portion généralement impliquée dans l’hétérodimérisation des kératines de type I et de type II lors de la formation des FIK.64; 65 Dans certains cas, la maladie est causée par une mutation dans le gène KRT5, plus particulièrement dans le domaine V1 de la tête de la protéine.65 D’autres mutations ont aussi été trouvées dans le domaine V2 de la queue de la kératine 5.
L’EBS avec dystrophie musculaire (EBS-DM) est un type d’EBS causé par une mutation autosomale récessive dans le gène PLEC codant pour la plectine.69 Cette forme d’EBS serait principalement causée par une mutation dans l’exon 31 du gène PLEC au niveau du rod domain.70 La plectine est une protéine impliquée dans la formation des hémidesmosomes puisqu’elle permet de sécuriser les FIK aux sites d’attachement.54; 71 La maladie entraîne l’apparition de cloques à différents endroits sur le corps dès la naissance, alors que la dystrophie musculaire apparait plus tardivement dans le développement de l’enfant, soit pendant l’enfance ou à l’âge adulte.28 Dans certains cas, l’EBS-DM peut s’accompagner d’alopécie, soit de la perte de cheveux.
L’EBS avec atrésie pylorique (EBS-AP) est un autre phénotype souvent associé à l’EBS.28 L’EBS-AP se transmet par une mutation récessive dans les gènes ITGA6 et ITGB4, mais également le gène PLEC.72; 73 Il a été démontré que contrairement à l’EBS-DM, la mutation causant l’EBS-AP se trouve à l’extérieur de l’exon 31 du gène PLEC.70; 73 Cette maladie entraîne la formation de cloques à divers endroits sur le corps, et ce, dès la naissance. Le patient présente parfois de l’anémie, un retard de croissance et des anomalies, notamment au niveau des tissus mous.

Essais thérapeutiques

Actuellement, il n’existe aucun traitement curatif pour soulager définitivement les patients atteints d’EBS.74; 75 Pour soulager leurs symptômes, les patients peuvent apposer des bandages sur les régions du corps affectées, utiliser régulièrement des antidouleurs ainsi que des antibiotiques et privilégier le port de vêtements qui évitent le frottement et réalisés dans des matériaux n’entraînant pas de douleur excessive.35; 47; 74 Avec les années, plusieurs groupes de recherches en sont venus à établir des lignes directrices pour le soulagement de la douleur des patients.35; 39 Diverses équipes de chercheurs ont fait des tentatives avec certains médicaments tels que des antibiotiques puissants,74 ou encore en produisant la protéine défectueuse,76 mais aucun de ces traitements n’a obtenu de résultats concluants. Jean-Christophe Chamcheu et son équipe ont réalisé plusieurs projets de recherche impliquant des protéines chaperonnes comme le triméthylamine N-oxyde.77 Ils ont également vérifié si les protéines chaperonnes peuvent protéger les kératinocytes contre le stress causé pas une exposition prolongée à la chaleur.77 En 2017, l’équipe de Aushev publiait une étude portant sur l’utilisation d’une technologie d’édition du génome sur des kératinocytes de patients atteints de l’EBS.
La Pre Catherine Laprise a développé un programme de recherche sur l’EBS et construit une biobanque constituée de tissus de patients qui sont atteints d’EBS et de témoins sans EBS pairés pour l’âge et le sexe avec les patients. Au total, ce sont des échantillons biologiques provenant de 23 personnes qui sont disponibles, dont 11 individus témoins appariés à 12 individus atteints de la maladie et dont le diagnostic est confirmé par un dermatologue ou un pédiatre spécialisé en dermatologie. Pour chacun de ces patients, différents types cellulaires issus de biopsies cutanées sont disponibles. Ainsi, des biopsies cutanées sont conservées dans l’azote liquide et des lignées de fibroblastes et des kératinocytes primaires et immortalisés sont également disponibles pour ces individus. Des échantillons de sang permettent aussi d’avoir accès à l’ADN et l’ARN de ces patients. Les formes généralisées et localisées sont présentes dans la biobanque,80 de même que la forme avec pigmentation mouchetée.62 Le Tableau 3 présente les informations relatives à chacun des patients pour lesquels la mutation causant la maladie a été identifiée, soit le sous-type d’EBS dont ils sont atteints, la localisation de la mutation dans le gène affecté, la mutation dans la protéine affectée, le gène affecté, l’exon et le domaine du gène où la mutation est présente.
L’équipe de la Pre Catherine Laprise a, jusqu’à présent, réalisé divers travaux de recherche ayant pour objectif de documenter les mutations provoquant l’EBS et de déterminer si certaines molécules peuvent avoir un effet thérapeutique pour les patients atteints de l’EBS. Ainsi, Bchetnia et al.80 a permis d’identifier les mutations connues responsables pour tous les patients par séquençage des gènes KTR5 et KTR14 en plus d’identifier deux nouvelles mutations responsables soit 1675C>T pour le patient EBS12 et 373C>A pour le patient EBS21. L’étude du patron d’expression génomique à partir d’une biopsie cutanée de chaque individu étudié a permis de découvrir que 28 gènes sont exprimés différemment chez les patients atteints d’EBS. Plus spécifiquement, les gènes affectés sont impliqués dans le métabolisme des acides gras (9 gènes), le processus de kératinisation (3 gènes), la croissance et la prolifération cellulaire (8 gènes), la réponse immunitaire (2 gènes), ainsi que dans diverses autres fonctions (8 gènes).78 La Figure 6 illustre les gènes qui sont différemment exprimés dans la peau de patients atteints d’EBS comparativement à ce que l’on observe dans la peau de témoins.
Un second projet de recherche, réalisé en 2013, a permis de comparer le patron d’expression d’un patient atteint d’EBS-MP (ayant la mutation P25L) et d’un témoin non atteint. 62 Ce projet a permis de démontrer que 52 gènes sont différemment exprimés entre le patient atteint d’EBS-MP et les témoins sans EB.62 Le projet de recherche a également permis de déterminer que le gène TYR est potentiellement impliqué dans la pathologie. Ce gène est connu pour être associé à l’albinisme puisqu’une mutation dans ce gène affecte la biosynthèse de la mélanine de la peau.84 Ceci suggère que la biosynthèse de la mélanine serait modulée dans le contexte de la pathologie EB.
La plus récente publication de l’équipe dirigée par la Pre Laprise avait pour objectif de trouver un traitement potentiel pour soulager les patients atteints de l’EBS à l’aide de molécules chapperones.85 Dans ce projet le triméthylamine-N-oxyde (TMAO) et le sodium-4-phenylbutyrate (4-PBA) ont été évalués pour leur potentiel thérapeutique. La mesure de l’efficacité de ces molécules était faite par comparaison des agrégats de kératine observés dans les cellules des malades avant et après traitement. Si un traitement est efficace, l’hypothèse étant que ces molécules apportent une activité stabilisatrice et permettent d’aider au repliement de la protéine, une réduction du nombre d’agrégats de kératine dans le cytoplasme devrait être observée.86; 87 Les résultats ont démontré que le TMAO pourrait prévenir la formation d’agrégats de kératine dans les cellules en procédant à la restauration des protéines qui sont mal repliées ou en entraînant la dégradation des protéines problématiques.

TECHNOLOGIES D’ÉDITION DU GÉNOME

Plusieurs projets de recherche ont donc été réalisés dans l’espoir de trouver un traitement pour soulager les patients atteints des diverses formes d’EBS. Malheureusement, aucun des résultats n’a permis la mise en place d’une thérapie curative. Pour cette raison, les chercheurs se sont tournés dans les dernières années vers les technologies d’édition du génome pour corriger les mutations responsables de la maladie. Il est maintenant possible de modifier l’ADN du patient dans certaines cellules par la réalisation d’expériences in vitro. Ainsi, la mutation d’intérêt peut être remplacée par un fragment d’ADN sain ou le gène ciblé peut être inactivé. Souvent, la façon de procéder dépend de la maladie, de son mode de transmission et de la mutation elle-même. Avec les années, plusieurs technologies ont fait leur apparition dans le monde scientifique.
Les technologies d’édition du génome sont des technologies qui ont beaucoup évolué avec le temps, telles que présentées dans la Figure 7. En effet, elles ont commencé par l’utilisation des méganucléases qui consistaient en une seule enzyme capable de couper l’ADN.88 En 1994, les nucléases en doigts de zinc ont fait leur apparition.89; 90 Toutefois, l’utilisation de cette technique impliquait beaucoup d’investissements de temps et d’argent. Il faut attendre jusqu’en 2009, pour qu’une équipe de chercheurs parvienne à concevoir une nouvelle technique pour éditer le génome, soit les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) (de l’anglais Transcription activator-like effector nucleases). Cette technologie offrait maintenant une méthode moins coûteuse et moins longue à utiliser, mais la technique est complexe puisque deux longues séquences spécifiques à l’endroit désiré dans le génome sont nécessaires à sa mise en oeuvre.91 Il faut attendre jusqu’en 2013 pour qu’une révolution se produise dans le monde de l’édition génomique par l’apparition de la technologie utilisant une nucléase Cas9 associée à de courtes séquences palindromiques groupées et régulièrement espacées (CRISPR/Cas9) (de l’anglais Clustered regularly interspaced short palindromic repeat).92 Cette technologie moins complexe, mais plus spécifique, offre dorénavant aux chercheurs une option plus intéressante. Précisément, la méthode CRISPR/Cas9 permet de modifier le génome de façon ciblée, simple et rapide. Cette technique permet de neutraliser des séquences d’ADN ou de les remplacer puisque les séquences CRISPR sont présentes dans la grande majorité des vivants. De plus, depuis son apparition, plusieurs équipes travaillent entre autres sur de nouvelles variantes de CRISPR/Cas9 permettant l’édition des bases, de sorte à élargir la gamme de possibilités de cette technologie.

Fonctionnement général des technologies d’édition du génome

Les technologies d’édition du génome sont des méthodes prometteuses pour l’édition de mutations causant diverses maladies. Ces technologies, bien que toutes différentes les unes des autres, constituent une révolution en permettant de travailler directement dans le génome des individus. Elles fonctionnent toutes selon un principe fondamental similaire. Le mécanisme qu’elles utilisent implique l’induction de coupures double brin (CDB) d’ADN (de l’anglais double stranded break : DSB) qui se produisent à des endroits bien précis dans le génome, ciblant ainsi des régions de l’ADN en particulier.30 Suite à la CDB, la cellule enclenche automatiquement le processus de réparation de l’ADN et la répare sans se soucier de l’ordre des nucléotides, induisant ainsi de nouvelles mutations pouvant être des insertions et des délétions (indels) ajoutées lors de la recombinaison dite non-homologue (RNH) (de l’anglais non-homologous end-joining : NHEJ). Pour contrer ce mécanisme, l’insertion d’un fragment d’ADN donneur exempt de mutation dans la séquence permet de procéder à de la recombinaison homologue (RH) (de l’anglais homology directed repair : HDR) 95, permettant alors de corriger la mutation causant le phénotype de la maladie 30. La Figure 8 explique ce phénomène puisqu’il est possible de voir visuellement ce dont il est question. Donc à la suite de la coupure, on assiste soit à l’ajout de nouvelles mutations si la réparation se fait directementpar la cellule, soit à la correction de la mutation causant la maladie si un ADN donneur a été inséré à l’intérieur de la cellule.

Méganucléases

Historique

Les méganucléases, aussi appelées endonucléases naturelles ou « homing meganucleases », sont des endonucléases capables d’initier de la RH à un endroit précis dans le génome.Les premières méganucléases, découvertes par Kostriken et al. 97 et Jacquier et Dujon,98 sont dérivées des éléments génétiques permettant la mobilité d’éléments microbiens (levures et bactéries). Elles proviennent des phages, des bactéries, des archéobactéries et de nombreux eucaryotes. Les protéines HO et I-SceI seraient à l’origine des méganucléases et on croyait initialement qu’elles permettaient la reconnaissance de grandes cibles, soit des séquences de plus de 12 paires de bases.88; 101 À l’état naturel, elles sont des nucléases efficaces, non seulement dans le génome humain, mais également chez les plantes et les insectes.102; 103 Les méganucléases regroupent 4 grandes familles qui se distinguent en fonction de leur séquence et la structure du motif qu’elles reconnaissent.104 La famille la plus étudiée est celle des protéines LAGLIDADG.

Mode de fonctionnement dans l’édition du génome

Les méganucléases sont capables d’induire une CDB, comme démontré dans la Figure 9.99; 105 Elles sont en mesure de reconnaître des séquences pouvant être très larges, soit entre 12 et 45 paires de bases (pb).106; 107 L’utilisation de méganucléases comporte un grand désavantage par rapport aux autres techniques d’édition du génome, car elles nécessitent la présence d’un site de coupure pour la méganucléase dans l’endroit où l’on désire établir la coupure.100 C’est donc dire que l’utilisation de cette technologie est dépendante de la présence naturelle de site de coupure de méganucléases à l’intérieur de la séquence ciblée dans le génome.

Applications de la technologie

La première utilisation des méganucléases sur des chromosomes de cellules humaines a été réalisée en 1994.106 Le projet consistait induire une coupure double brin à l’aide d’une méganucléase faisant partie de la famille I-Sce provenant des levures. En 2011, l’équipe de Grosse a utilisé deux types de méganucléases, I-SceI, une méganucléase naturelle, et I-CreI (méganucléase redessinée) pour cliver le virus de l’herpès simplex de type 1, afin de le désactiver. Les chercheurs sont parvenus à démontrer que l’utilisation de cette technique permet d’inhiber les effets du virus à des niveaux faibles et modérés d’infection.108 En 2016, Izmiryan et son équipe ont quant à eux utilisé les méganucléases pour corriger une mutation dans le gène COL7A1 causant la EBDR.109 Les chercheurs ont utilisé quatre types de méganucléases différentes pour tenter de corriger deux mutations causant la maladie. Ils sont parvenus à démontrer qu’il était possible de corriger des mutations dans COL7A1, dont l’une des mutations est parmi celles le plus souvent rencontrées chez les patients.109 Ces applications ne sont que quelques exemples de toute la recherche réalisée à l’aide des méganucléases.

Nucléases en doigts de zinc

Historique

Les nucléases en doigts de zinc (de l’anglais zinc finger nuclease : ZFN) ont fait leur apparition après les méganucléases.89 Elles ont été étudiées pour la première fois par Pavletich et Pabo110 qui sont parvenus à démontrer que leur structure comprend des protéines en doigts de zinc (de l’anglais zinc finger protein : ZFP) constituées de nombreux domaines, soit entre trois et six.111 Ces ZFP sont à leur tour constituées de trois nucléotides complémentaires à un des brins de la séquence cible.112 Ensuite, de 1996 à 2003, la méthode a été développée pour permettre son utilisation dans l’édition du génome.89 La technologie a été modifiée pour permettre la CDB par l’ajout d’une endonucléase de restriction, la Fok1, originaire des Flavobacterium okeanokoites. Initialement, la Fok1 possède son propre domaine de reconnaissance de séquence, mais ce dernier est adapté pour l’édition du génome

Mode de fonctionnement dans l’édition du génome

Le mécanisme des ZFN comprend deux éléments principaux : des ZFP capables de cibler une séquence particulière dans le génome et une endonucléase de restriction Fok1 permettant la coupure double brin (présentés dans la Figure 10).112; 113; 116 Les ZFP sont présentes au nombre de 3 à 6 protéines, ce qui procure à chaque monomère une spécificité allant de 9 à 18 nucléotides puisque chaque ZFP reconnaît trois nucléotides. Également, pour que la CDB ait lieu, l’endonucléase Fok1 doit être présente sous forme de dimère pour augmenter sa spécificité. Pour cette raison, il faut créer deux monomères de ZFP pour cibler les deux brins composant l’ADN. Pour qu’elles exécutent leur travail convenablement, les endonucléases doivent être situées de cinq à sept pb des ZFP. 111 La CDB est provoquée par l’action de l’endonucléase Fok1 qui va couper chacun des brins d’ADN. La région pouvant être ciblée par des ZFP peut contenir de 18 à 36 pb.
Les ZFN peuvent être utilisées de deux façons. La première permet d’inactiver un gène en induisant une CDB dans la séquence d’ADN ciblée. Cela provoque alors de la RNH, induisant de nouvelles mutations, soit des indels, causées par le mécanisme de réparation présent naturellement dans les cellules. Ces dernières vont affecter la production de la protéine en produisant de multiples erreurs ou en empêchant carrément sa production.114 La seconde permet de corriger des mutations causant diverses maladies où la technologie est utilisée pour induire la CDB puis la répare avec la RH à l’aide d’un ADN donneur qui concorde avec la séquence ciblée.

Applications de la technologie

Les ZFN ont été utilisées dans différents projets de recherche au fil des ans. En 2011, une revue de littérature à propos de projets de recherche ayant utilisé cette technologie a été réalisée.116 L’article rapporte, entre autres, des projets impliquant des cellules souches, aussi appelées cellules souches pluripotentes humaines (CSPh).
Premièrement, l’équipe de Lombardo et al. 119 a ciblé le locus IL2RG à l’aide de ZFN. Certaines cellules modifiées génétiquement ont conservé leurs phénotypes et ont été en mesure de devenir des celllules progénitrices neurales.116 Ensuite, un projet ayant à l’étude le gène PIG-A dans des CSPh a été réalisé en 2009 par l’équipe de Zou et al. 120 Ces derniers sont parvenus à démontrer que les ZFN pouvaient être utilisées pour inactiver un gène, de sorte à l’empêcher d’exécuter sa fonction.120 En 2012, Höher et al. ont travaillé sur des kératinocytes souches pour vérifier si les cellules étaient en mesure de garder les modifications qui leur avait été apportées.121 Il s’avère qu’ils ont découvert qu’en augmentant la quantité de ZFN utilisée, la cytotoxicité augmente, causant la mort de cellules. Cependant, les cellules dont le gène eGFP a été inactivé conservent leur potentiel de pluripotence après la modification du génome. Les cellules sont donc toujours en mesure de croître et de se différencier, en plus d’exprimer des marqueurs caractéristiques de ce type de cellules.121 Les projets énumérés précédemment ne sont qu’une petite proportion de tout ce qui a été réalisé dans les dernières années. Évidemment, les chercheurs délaissent quelque peu les anciennes technologies d’édition du génome, au profit des nouveaux développements dans ce domaine.

Transcription activator-like effector nucleases

Historique

La technologie des nucléases activatrices de type activateur de transcription (de l’anglais Transcription activator-like effector nucleases : TALENs) a été découverte à l’origine dans les bactéries de la famille des Xanthomonas.122 Ces bactéries sont reconnues pour infecter des plantes de l’industrie alimentaire. Elles sécrètent des protéines activatrices de transcription (de l’anglais transcriptor activalor-like effectors : TALE) dans le cytoplasme de leurs cellules par l’intermédiaire du système de sécrétion de type III.123 Ces protéines sont responsables de la pathogénicité de la bactérie.124 Elles se composent de 33 à 35 acides aminés similaires entre eux et la dernière répétition comprend fréquemment 20 acides aminés.114 La partie N-terminale des TALE permet l’émission d’un signal responsable de la sécrétion et la translocation bactérienne et est appelée répétition zéro (R0).125 Le domaine central de chaque TALE comprend entre 13 et 28 répétitions.124 Les paires 12 et 13 contiennent des répétitions variables de di-résidus (RVD) capables de se lier aux bases azotées selon un certain arrangement où l’adénine (A) correspond à la séquence NI, la cytosine (C) à HD, la guanine (G) à NN et la thymine (T) à NG.95; 114. Une ou deux parties C-terminales sont également contenues dans les TALEs et contiennent des signaux de localisation nucléaire et un domaine d’activation acide (AD).125 La structure des TALEs est présentée dans la Figure 11.
Les TALE se lient à un endroit précis dans le génome en fixant les RVD au nucléotide correspondant dans l’ADN génomique.126 En 2010, des projets de recherches ont été menés pour déterminer si l’application de cette technologie dans l’édition du génome était possible.89 Leurs recherches ont permis de déterminer que le domaine C-terminal des TALEs doit être retiré et remplacé par une enzyme capable d’induire une coupure dans l’ADN.126 Cette enzyme, originaire de Flavobacterium okeanokoites, appelées Fok1 permet d’induire la coupure double brin de l’ADN.

Mode de fonctionnement dans l’édition du génome

La technologie TALEN utilisée dans l’édition du génome diffère du mécanisme découvert chez les Xanthomonas. En effet, l’utilisation de TALEN implique la présence de plusieurs éléments importants dont la combinaison permet de cibler une séquence entre 30 et 40 pb, excluant les séquences d’espacement de 12-21 pb.91 Le premier élément requis est la présence de deux séquences répétitives totalisant de 33 à 35 nucléotides dictant les interactions entre l’ADN et les protéines.36 Ces séquences répétitives sont constituées de séquences complémentaires aux bases azotées présentes dans la séquence de l’ADN, permettant aux TALE de se fixer à l’ADN nucléotide par nucléotide.114 Le deuxième élément nécessaire est une endonucléase de restriction Fok1, présente en deux copies, permettant de cliver le double brin d’ADN. Elles doivent être présentes en dimères pour exécuter leur fonction.114 Cette méthode utilise donc la capacité des TALE à cibler un endroit précis dans le génome et la capacité de Fok1 à induire de la DSB. La cellule cherchera alors à réparer elle-même la CDB par RNH, mais l’ajout d’une séquence d’ADN donneur permet de réparer la coupure avec une séquence prédéterminée par le scientifique. La Figure 12 illustre les TALEN utilisées dans l’édition du génome.
Cette méthode peut être utilisée pour inactiver un gène en allant couper plusieurs morceaux du gène en question. La réparation de la coupure par RNH affectera la production de la protéine, l’empêchant d’exercer sa fonction normale dans la cellule. L’ajout de petites mutations dans le génome peut également affecter l’expression de la protéine. Bien que fort utile, cette technique comporte quelques limites. Elle peut effectivement entraîner des « hors-cibles » (de l’anglais off-target), c’est-à-dire des mutations à des endroits différents de la cible initiale.96 Aussi, lorsque l’on désire utiliser cette technologie, il est préférable de privilégier la création de plus d’une paire de TALE pour une même région puisque l’efficacité varie entre elles. Cela est d’autant plus vrai lorsque les endroits ciblés sont méthylés.

Applications de la technologie

Dans la littérature, on retrouve plusieurs études ayant utilisé cette technologie, notamment pour différentes formes d’épidermolyse bulleuse. À titre d’exemple, l’équipe de Osborn et al. a utilisé cette technologie pour l’EBDR.36. Ils ont démontré qu’il est possible d’induire une coupure double brin dans le gène COL7A1, car la mutation a été corrigée dans des fibroblastes reprogrammés en cellules souches pluripotentes induites (CSPi) (de l’anglais induced pluripotent stem cell : iPSC) montrant l’expression normale de ce gène.36 L’équipe de chercheurs est parvenue à démontrer que l’utilisation d’une technologie d’édition du génome peut être utilisée pour des maladies pouvant être causées par plusieurs mutations, où chaque patient peut posséder une mutation différente.36 Puis, Shinkuma et al. ont réalisé un projet de recherche ayant permis de comparer TALEN et CRISPR/Cas9 dans l’EBDD, causée par une mutation dans le gène COL7A1.127 Diverses paires de TALEN et un complexe CRISPR/Cas9 ont été évalués, pour conclure qu’il est possible d’éditer une séquence spécifique du génome. Ils ont également démontré que la différenciation de CSPi corrigées génétiquement en kératinocytes capables d’exprimer la protéine normale est possible.127 L’équipe de Aushev et al. ont utilisés cette même technologie dans l’EBS. 78 Avec TALEN, les chercheurs sont parvenus à inactiver l’allèle mutant dans des kératinocytes immortalisés de patients, de sorte à empêcher l’expression de l’allèle muté.78 Leur projet de recherche a permis de démontrer l’efficacité de cette technologie sur des maladies causées par des mutations dominantes-négatives.78 Les travaux de Shinkuma sont arrivés aux mêmes conclusions.
Par ailleurs, cette approche a également été utilisée dans le contexte d’autres maladies rares sans traitement curatif. Ainsi, dans la dystrophie musculaire de Duchenne, une maladie dégénérative entraînant la dégradation des muscles causée par la présence d’une mutation dans le gène codant pour la production de la dystrophine, Li et al. ont tenté trois approches différentes impliquant TALEN et CRISPR/Cas dans l’espoir de rétablir la production de dystrophine dans les CSPi des patients atteints.128 Précisément, les chercheurs ont tenté de (1) sauter un exon, (2) d’induire un décalage du cadre de lecture et (3) d’inactiver un exon.128 Ils ont conclu que l’inactivation d’un exon était la méthode la plus efficace à appliquer puisque cette approche permettait aux cellules ainsi corrigées de produire la protéine normale.
Ces quelques exemples d’applications de la technologie TALEN permettent d’illustrer le potentiel de cette approche. LaFountaine et al. ont réalisé une revue des maladies pour lesquelles cette technologie a été utilisée.114 Parmi celles-ci figurent notamment l’hémophilie A, la dystrophie musculaire, les infections par le virus de l’immunodéficience humaine, l’hépatite B et la malaria ainsi que divers cancers.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)

Historique

La découverte de CRISPR/Cas9 a révolutionné le monde de l’édition du génome. Les chercheurs ont dorénavant accès à une méthode peu coûteuse et facile permettant de modifier le génome du vivant dans le but de soulager des patients atteints de maladies monogéniques.129 Cette nouvelle méthode permet également de cibler plusieurs cibles à la fois.129 Le nom de la méthode CRISPR/Cas9 est un acronyme pour Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Bien que sa découverte initiale remonte à 1987,130 ce n’est toutefois qu’en 2010 que les chercheurs se sont davantage intéressés à cette technologie, lors de la découverte des CRISPR/Cas9 de type II.89 Effectivement, l’existence de plusieurs types de CRISPR/Cas9 se distinguant par le mécanisme permettant la reconnaissance d’une séquence d’ADN et la façon de procéder à la coupure dans l’ADN ont été démontrés.89 Elles ont également toutes une signature génétique différente et utilisent des mécanismes de clivage qui diffèrent également.131; 132 À la suite de ces découvertes, les premières utilisations de CRISPR/Cas9 sur des cellules humaines ont pu être réalisées en 2013.
La méthode CRISPR/Cas9 est originaire des bactéries, plus précisément de Streptococcus pyogenes. Les bactéries possèdent un mécanisme de défense, semblable au système immunitaire présent chez les mammifères, leur permettant de se défendre contre les envahisseurs pouvant être des virus, des plasmides ou encore d’autres agents envahissants.133; 134 Les bactéries parviennent à se protéger de ces envahisseurs en reconnaissant une portion de son génome gardée en mémoire dans une séquence présente à l’intérieur de la bactérie.
Ce système de défense implique une protéine Cas9, un ARN CRISPR (ARNcr) (de l’anglais CRISPR-RNA; crRNA) et un ARNcr transactivateur (ARNcrtra) (de l’anglais transactivator crRNA : tracrRNA).135; 136 Le mode de fonctionnement de cette immunité adaptative comprend trois grandes étapes : l’acquisition, l’expression et l’interférence.134 L’acquisition consiste à acquérir une partie de l’ADN étranger pour l’intégrer dans le CRISPR array pour le conserver en mémoire. Le CRISPR array est une séquence dans laquelle se trouvent tous les fragments d’ADN étranger accumulé avec le temps (séquences d’espacement), séparés par ce que l’on appelle des répétitions. Le locus CRISPR, situé près du CRISPR array, permet la production des protéines Cas1 et Cas2, pour la réalisation de l’acquisition.137 L’expression implique la transcription des séquences obtenues à partir des séquences conservées par le CRISPR en ARNcr. L’interférence, où le ARNcr permet de reconnaître l’ADN étranger se produit alors. Son couplage à une protéine de clivage (une protéine Cas) grâce à l’ajout d’un ARNcrtra, permet de procéder à une coupure dans l’ADN étranger, de sorte à initier le clivage de cet ADN. Cela entraîne la destruction de l’ADN étranger. Le processus est présenté dans la Figure 13.134; 137 Le système CRISPR/Cas9 utilisé pour l’édition du génome est diffèrent de l’immunité adaptative des bactéries puisque que l’on désire utiliser la capacité de ce mécanisme à cibler une séquence précise dans le génome et à procéder au clivage dans le double brin d’ADN.

Mode de fonctionnement

La méthode CRISPR/Cas9 a beaucoup évolué avec le temps. Les multiples recherches menées à son sujet ont permis de non seulement utiliser la technologie pour l’édition du génome en coupant l’ADN, mais également en éditant une base azotée en particulier. Récemment, une technique pour l’édition de l’ARN a en outre fait son apparition dans le monde de l’édition génomique. L’ensemble de ces dernières techniques constituent des dérivés de la méthode originale.
La méthode la plus couramment utilisée est inspirée du mécanisme immunitaire des bactéries 129 et est présentée dans la Figure 14. L’édition du génome avec CRISPR/Cas9 pour réparer l’ADN par RH est la première version de CRISPR/Cas9 utilisée. Ce système est une version simplifiée du mécanisme bactérien et nécessite seulement deux éléments pour rendre possible la correction de l’ADN : la protéine Cas9 et un ARN guide simple brin (ARNgs) de 20 à 22 pb.117 Ce dernier est une combinaison de l’ARNcr et de l’ARNcrtra guidant la Cas9, lui permettant de cliver le double brin d’ADN 117. La protéine Cas9 reconnaît quant à elle une séquence de 3 pb dans le génome, le motif protoespaceur adjacent (de l’anglais protospacer adjacent motif : PAM) spécifique au type de Cas9 utilisé.89 Si le PAM est différent de la séquence d’ADN, la Cas9 cherche alors ailleurs dans l’ADN. Lorsque cette séquence est trouvée, l’ARNgs peut se fixer sur l’ADN complémentaire à cette séquence. Cette complémentarité doit être complète pour permettre à la protéine Cas9 d’induire la CDB.117 Ensuite, le complexe se sépare de l’ADN et peut alors aller chercher de nouveau le PAM dans la séquence d’ADN.139 La réparation à la suite de la CDB est ensuite réalisée par RNH ou par RH, dépendamment de l’objectif de la manipulation. Dans le cas où on désire corriger une mutation, on utilise un fragment d’ADN donneur double ou simple brin pour réparer la CDB par RH.140 Il est alors possible d’induire de nouvelles mutations ou de corriger une mutation par le biais de l’ajout d’un fragment d’ADN donneur. La méthode CRISPR/Cas9 est très spécifique et son utilisation relativement simple permet d’éditer plus d’une séquence à la fois, avec une efficacité élevée. Toutefois, l’utilisation de CRISPR/Cas9 peut mener à l’apparition de modifications « hors-cible », où des modifications sont faites sur l’ADN à d’autres endroits que sur la séquence ciblée.

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Table des matières

INTRODUCTION 
1. PEAU ET KÉRATINES
1.1. Fonctions de la peau
1.2. Structure de la peau
1.2.1. Épiderme
1.2.2. Derme
1.2.3. Hypoderme
1.3. Kératines
2. ÉPIDERMOLYSES BULLEUSES
2.1. Épidermolyse bulleuse dystrophique
2.2. Épidermolyse bulleuse jonctionnelle
2.3. Syndrome de Kindler
2.4. Épidermolyse bulleuse simplex
2.4.1. Épidermolyse bulleuse simplex localisée
2.4.2. Épidermolyse bulleuse simplex généralisée intermédiaire
2.4.3. Épidermolyse bulleuse simplex généralisée sévère
2.4.4. Autres phénotypes associés à l’EBS
2.5. Essais thérapeutiques
3. TECHNOLOGIES D’ÉDITION DU GÉNOME 
3.1. Fonctionnement général des technologies d’édition du génome
3.2. Méganucléases
3.2.1. Historique
3.2.2. Mode de fonctionnement dans l’édition du génome
3.2.3. Applications de la technologie
3.3. Nucléases en doigts de zinc
3.3.1. Historique
3.3.2. Mode de fonctionnement dans l’édition du génome
3.3.3. Applications de la technologie
3.4. Transcription activator-like effector nucleases
3.4.1. Historique
3.4.2. Mode de fonctionnement dans l’édition du génome
3.4.3. Applications de la technologie
3.5. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)
3.5.1. Historique
3.5.2. Mode de fonctionnement
3.5.3. Applications de la technologie de CRISPR/Cas9
4. OBJECTIFS DU PROJET DE RECHERCHE 
4.1. Contexte : Correction génétique avec CRISPR/Cas9
4.2. Objectifs et hypothèses
CHAPITRE I: CRISPR/Cas9-homologous recombination strategy for the correction of ,Epidermolysis Bullosa Simplex mutations 
Avant-propos
Résumé
Abstract
Introduction
Material and Methods
Results
Discussion
Figures
References
CHAPITRE II : DISCUSSION GÉNÉRALE
1. Retour sur les objectifs 
1.1. Choix de la méthode d’édition du génome
1.2. Présence de recombinaison non-homologue
1.3. Recombinaison homologue en présence d’un ADN donneur
1.4. Utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 dans les fibroblastes primaires
2. Perspectives 
3. Considérations éthiques
3.1. Bienfaits et risques de l’édition du génome
3.2. Législation en vigueur
3.3. Opinions dans le monde scientifique
CONCLUSION 
BIBLIOGRAPHIE

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