Soutenance mémoire
LA RESISTANCE BACTERIENNE
Techniques d’ensemencement d’un prélèvement
Après la récupération des prélèvements à partir des différents services du Complexe Universitaire Hassan II de Fès, on y ajoute 1ml du milieu bouillon cœur-cervelle (BHI) concentré puis on incube pendant 24 heures à 37°C. La culture du bouillon est ensemencée par la méthode de strie par épuisement tout en diminuant la charge bactérienne sur l’anse afin d’obtenir des colonies isolées. Les boites ensemencées sont incubées à 37°C.
▪ Nous avons réalisé plusieurs types et différentes techniques d’ensemencement
1. Ensemencement sur un milieu solide
Pour ce type d’ensemencement il existe des techniques d’ensemencement sur des boites et d’autres sur des tubes.
▪ Pour les techniques d’ensemencement sur des boites de pétri :
Ensemencement par épuisement
-C’est la technique des 4 quadrants qui consiste à disperser le microorganisme à la surface d’un milieu solide afin d’isoler des bactéries et d’obtenir des colonies séparées.Tout d’abord, l’échantillon est déposé sur le plus grand cadran, puis il est étalé. Ensuite la boîte est retournée afin d’étaler les bactéries sur un cadran plus petit. Finalement la boite est retournée une autre fois afin d’ensemencer le dernier petit cadran.Les stries doivent être serrées et l’anse de platine doit être flambée entre chaque cadran.C’est la technique utilisée pour l’ensemencement des milieux sélectifs (EMB et Chapman).
-Après l’ensemencement, il faut incuber les boites dans l’étuve à 37°C pendant 24h pour tous les milieux sauf le milieu Chapman qui nécessite une incubation de 48h.
Ensemencement en tapis
-C’est la technique utilisée pour la réalisation de l’antibiogramme.
▪ Pour les techniques d’ensemencement sur tubes : a. Pour un milieu incliné en pente :ensemencer toujours du bas en haut par des stries serrées. b. Pour un milieu en culot : ensemencement par piqure centrale. c. Pour un milieu en culot + pente : commencer par ensemencement de la pente par des stries serrées puis ensemencer le culot par piqure centrale. C’est la technique utilisée pour l’identification biochimique des Entérobactéries.
Ensemencement sur milieu liquide
On peut ensemencer un milieu liquide soit à partir d’un produit liquide (mettre quelques gouttes dans le milieu à ensemencer à l’aide d’une micropipette), soit à partir d’un produit solide (écraser la colonie prélevée à l’aide d’une anse de platine ou pipette de pasteur sur la paroi du tube, pour obtenir une suspension homogène).
❖ Remarque : les différentes techniques d’ensemencement citées au dessus doivent être effectuées dans des conditions aseptiques.
Milieux sélectifs
Milieu EMB
-Le milieu EMB (Eosine Bleu de Méthylène) est un milieu sélectif qui favorise la croissance d’Escherichia coli, des Entérobactéries ainsi que les bactéries intestinales à Gram négative. Le bleu de méthylène et l’éosine jaune sont deux colorants inhibiteurs partiels des bactéries Gram +. Ces colorants assurent la différenciation entre les germes ayant l’aptitude à fermenter ou non le lactose (lactose + ou lactose -). La lecture se fait après 24h à une température de 37°C. ✓ Les colonies violettes foncées désignent un PH acide. Dans ce cas, les bactéries fermentent le lactose en produisant des acides -> Lactose+. ✓ Les colonies grisâtres désignent quant à elles un PH neutre ou basique. Dans ce cas, les bactéries ne fermentent pas le lactose -> Lactose-. 2. Milieu Chapman -La gélose Chapman est un milieu sélectif des bactéries halophiles et plus particulièrement fermentant le mannitol. C’est un milieu semi synthétique, utilisé pour l’isolement des staphylococcus. La teneur en NaCl du milieu permet la sélection des bactéries halophiles et inhibe la grande majorité des autres bactéries. La lecture se fait après 48h à une température de 37 °C. La fermentation du mannitol est révélée grâce au virage de l’indicateur coloré de pH : Rouge de phénol qui permet une orientation vers certaines espèces. ✓ Absence de virage (le milieu reste rouge) : les colonies sont mannitol- car elles ne fermentent pas le mannitol. ✓ Virage du milieu au jaune : les colonies sont mannitol+ car elles fermentent le mannitol.
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Table des matières
Liste des abréviations
Liste des tableaux
Liste des figures
Cadre de stage :
– Présentation du lieu de stage
– Techniques maîtrisées durant ce stage
Applications pratiques
– Techniques d’antibiogrammes par la méthode de diffusion en milieu gélosé
INTRODUCTION
CHAPITRE 1: REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
I. LES ANTIBIOTIQUES
1. Définition et origine des antibiotiques
2. Classification des familles d’antibiotiques
3. Cibles et Modes d’actions des antibiotiques
II. LA RESISTANCE BACTERIENNE
1. Définition
2. Types de résistances
2.1. Résistance naturelle
2.2. Résistance acquise aux antibiotiques
a. Resistance par mutation chromosomique
b. Résistance extra-chromosomique ou plasmatique
III. L’ANTIBIOGRAMME
1. Définition
2. Techniques d’antibiogramme
a. CMI par la méthode de diffusion en milieu gélosé
b. CMIen milieu liquide ou microdilution
c. CMI par diffusion en gradient ou méthode ETEST®
3. Erreurs fréquentes et contrôle de qualité
4. Limites de l’antibiogramme
5. Staphylocoques et bêta-lactamines
6. Entérobactéries et bêta-lactamine
CHAPITRE 2 : MATERIEL ET METHODES
I. Techniques d’antibiogrammes par la méthode de diffusion en milieu gélosé
1. Milieu MH
2. Préparation de culture fraiche
3. Réalisation de l’inoculum
4. Ensemencement
5. Dépôt des disques
6. Lecture d’antibiogramme
II. Réalisation de l’antibiogramme pour les Entérobactéries et les Staphylocoques
1. Les Entérobactéries
2. Les Staphylocoques
CHAPITRE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION
I. Pour les Entérobactéries : Recherche des BLSE
II. Pour les Staphylocoques : Résistance à la méticilline
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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