Technique de production de phages par inclusion de bactéries

Listériose : maladie infectieuse 

Domaines : phagorepérage et phagoprophylaxie alimentaire (phagoadditifs)

Le domaine du phagorepérage utilise des phages pour la détection de bactéries présentes sur des organismes vivants ou sur des surfaces inertes, dès lors qu’une contamination est suspectée. Il permet souvent de mieux comprendre et de compléter le suivi d’une épidémie ou d’une éclosion bactérienne. Ce domaine s’intègre dans un type de biocontrôle qualifié de phagodétection. La phagodétection classique, c’est-à-dire la lysotypie révélant la présence de bactéries par des zones de lyse sur un tapis bactérien, fait intervenir des phages naturels. Ce procédé est utilisé régulièrement dans différents laboratoires depuis plusieurs dizaines d’années. Tandis que la phagodétection adaptée, impliquant notamment le marquage bioluminescent en utilisant des phages transformés qui signalent la présence de bactéries par l’émission de lumière, en est à ses débuts. Les bio-agents employés en phagorepérage sont des phagodétecteurs (phages) naturels ou génétiquement modifiés (Fig. 1.31).La phagoprophylaxie est un domaine englobant les secteurs alimentaire, sanitaire et environnemental. Elle est reliée à une situation de contamination potentielle. Ce domaine s’intègre dans un type de biocontrôle qualifié de phagoprévention. La phagoprophylaxie représente en effet une voie biopréventive, profitable notamment pour la préservation des denrées comestibles. On constate que les tissus alimentaires ne sont pas affectés par la présence de bactériophages. À l’inverse, leur présence peut contribuer à protéger les fibres alimentaires en inhibant ou en éliminant les bactéries qui y prolifèrent. Comme nous l’avons vu précédemment, des formulations de phagoadditifs, assurant l’innocuité des aliments, sont en développement et certaines sont déjà autorisées. L’ensemble des études portant sur l’efficacité des listériaphages A511 et P100 sur la réduction des contaminations démontre que leur potentiel d’action dépend directement de la structure matricielle, de la concentration initiale en bactéries et de la dose de phages appliquée (Sulakvelidze, 2013). Les phages A511 et P100 répondent aux nombreux critères de base pour être de bons agents de biocontrôle. Ils sont strictement virulents, ils possèdent un large spectre d’action, ils ne peuvent se convertir en prophages et, ipso facto, ne peuvent effectuer de transduction spécialisée. Le phage P100 démontre un spectre un peu plus étendu que le phage A511 sur diverses souches de Listeria (Klumpp et al., 2008). Le phage A511 infecte 95 % des L. monocytogenes 1/2 and 4, sérotypes les plus incriminés dans les cas de listériose. Lors d’un biocontôle, chaque association matrice/bactérie/phage doit être évaluée avant de déterminer la dose de phages la plus efficace (Sillankorva et al., 2012). L’évaluation de la présence d’eau libre dans les aliments à traiter est nécessaire afin d’évaluer la diffusion des phages vers les cellules hôtes. En effet, les phages se dispersent moins bien sur des matrices alimentaires solides que dans les milieux aqueux (Sulakvelidze, 2013). L’application des phages aux différentes étapes de la chaîne de transformation des aliments conduit à un meilleur contrôle des pathogènes ciblés. On estime que de réduire d’un log la concentration d’un pathogène à l’étape de pré-abattage réduirait les risques d’intoxication de 45 % et qu’une réduction de deux log pourraient réduire de 75 % ces mêmes risques (Havelaar et al., 2007). Toutefois, deux écoles de pensée se confrontent sur l’utilisation des phages avec le vivant sans qu’il y ait eu préalablement la détection d’une infection. La question est de savoir si l’emploi des phages en prévention pour le bétail, par exemple, n’engendrerait pas à nouveau une surutilisation telle que celle constatée avec les antibiotiques dans ce secteur. Par ailleurs, en mode prévention, lorsqu’appliqués sur une surface de travail ou sur des emballages, les phages sont qualifés de phagoprotecteurs et peuvent offrir un avantage de sécurité alimentaire considérable. Différents prototypes de matériaux d’empaquetage sur lesquels on pulvérise des phages et destinés à recouvrir des produits prêts-à-manger sont présentement à l’étude. Il s’agit de membranes de cellulose chargées positivement; de papiers ou de pads imprégnés de phages; ou d’emballages bioactifs comprenant des phages encapsulés dans des billes d’alginate (Gouvêa et al., 2016; Lone et al., 2016). L’emploi des phages pour inhiber la croissance de pathogènes dans la nourriture (phagoadditifs) connaît des avancées et, depuis l’approbation de l’emploi des produits ListexTM P100 et ListShieldTM, il y a de cela plus de 10 ans, plusieurs aliments classés dans les différentes catégories du Guide alimentaire canadien peuvent avoir été soumis à une phagoprévention par ces produits qui contiennent des phages spécifiques à L. monocytogenes. Même si, actuellement, aucune donnée statistique ne fait état de cette situation, la liste des denrées traitées par des solutions de phages augmente en fonction des études produites et des homologations émises. Actuellement, on retrouve, dans le groupe des fruits et légumes, plusieurs aliments tranchés, dont les cantaloups, les pommes, les mélanges de légumes (chou et laitue) sur lesquels on peut pulvériser des solutions de listériaphages (Leverentz et al., 2003).
Dans plusieurs pays, dans la catégorie des viandes et substituts, la dinde, le poulet, les viandes rouges et le poisson peuvent être traités pour prévenir ou réduire les contaminations par L. monocytogenes (Soni & Nannapaneni, 2010a). Des analyses de contrôle des populations de cette bactérie sur des matrices alimentaires solides telles que des tranches de dinde, des saucisses à hot-dogs et du saumon fumé démontrent que les listériaphages peuvent affecter de façon significative les microorganismes avec une réduction de 5 log du décompte bactérien. Et selon les auteurs, les variations des conditions expérimentales, dont le nombre de jours d’entreposage et les températures, conduisent aussi à des résultats similaires. Des résultats confirment l’efficacité des phages A511 et P100 pour le contrôle de L. monocytogenes dans ces types d’aliments (Guenther et al., 2009). Des combinaisons de formulations de phages (ListexTM P100, 107 UFP/cm2) et d’additifs chimiques (lactate de potassium, 2,8 %) appliquées directement sur de la dinde cuite ont fait ressortir, lors d’une étude, une réduction importante (4 log UFC/cm2) du nombre de Listeria, en comparaison avec les échantillons de contrôle, sur une période de 28 jours d’entreposage (Chibeu et al., 2013). L’utilisation des phages contre d’autres pathogènes alimentaires, dont Campylobacter jejuni et Shigella, démontre aussi une bonne efficacité sur des produits carnés et de la volaille (Sulakvelidze, 2013). Des analyses traitant de l’effet des phages de Pseudomonas sur des pièces de viande contaminées ont confirmé qu’une diminution de 2 log du compte bactérien était possible suite à l’inoculation de phages (Greer, 1986). L’étude démontre que ces derniers peuvent proliférer plus rapidement que les bactéries en surface de la chair et offrir une certaine protection contre la croissance trop rapide de certains microorganismes dans les produits carnés. D’autres analyses utilisant des phagoadditifs sur des échantillons de boeuf contaminés aux E. coli démontrent que les phages peuvent se répliquer à faibles températures et qu’ils sont davantage efficaces lorsque utilisés à des M.O.I élevées (Liu et al., 2015).

Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie microbiologie

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Table des matières

INTRODUCTION 
CONTEXTUALISATION
1.1. Problématiques causées par la présence de bactéries du genre Listeria 
1.1.1. Solutions
1.1.2. But et hypothèses de l’étude
REVUE DE LA LITTÉRATURE
1.2. LISTERIA 
1.2.1. Listeria monocytogenes
1.2.2. Historique
1.2.3. Classification
1.2.4. Composition de la paroi cellulaire
1.2.5. Listeria dans l’environnement
1.2.6. Résistances aux contraintes environnementales et mécanismes
1.2.6.1. Résistance à l’ammonium quaternaire
1.2.6.2. Résistance aux antibiotiques
1.2.6.3. Résistance aux phages
1.2.6.4. Système CRISPR-Cas
1.2.6.5. Adhésion aux surfaces – formation de biofilms
1.2.6.6. Communications bactériennes (QS-DS-ES)
1.2.6.7. Traitements thermiques
1.2.6.8. pH et agents de conservation
1.3. Listériose : portrait de la situation mondiale, épidémiologie et recensement 
1.3.1. Listeria dans les aliments
1.3.1.1. Les produits laitiers
1.3.1.2. Les produits carnés
1.3.1.3. Les produits marins
1.3.1.4. Les produits végétaux : fruits et légumes
1.4. Listériose : maladie infectieuse 
1.5. Mécanismes de virulence
1.5.1. Sécrétion d’hémolysine
1.5.2. Invasion cellulaire : implication des gènes de virulence
1.6. Méthodes d’isolement, de détection et d’identification des Listeria 
1.6.1. Étalement sur gélose et techniques biochimiques
1.6.2. Lysotypage et phages à marqueur bioluminescent (phagodétection)
1.6.3. Sérotypage
1.6.4. PCR Polymerase Chain Reaction : technique moléculaire
1.6.5. MDA Molecular Detection Assay : détection moléculaire
1.6.6. Ribotypage
1.6.7. Sondes nucléiques
1.6.8. PFGE Pulsed-Field Gel Electrophoresis : électrophorèse en champ pulsé
1.6.9. MLST MultiLocus Sequence Typing : typage – séquençage multi-sites
1.6.10. MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
1.6.11. WGS Whole-Genome sequencing : Séquençage complet du génome
1.7. Bactériophages
1.7.1. Historique des bactériophages
1.7.2. Les listériaphages
1.7.3. Matrice de similitude, arbre phylogénétique et organigramme
1.7.4. Phages A511 et P100
1.7.5. Mécanisme d’infection du phage A511
1.7.6. Cycles : lytique et lysogénique
1.7.7. Résistances (physique, chimique) et stabilité des phages
1.8. Biocontrôle par les phages : propriétés caractéristiques et critères de sélection
1.8.1. Santé publique, innocuité et sécurité
1.8.2. Approbations gouvernementales et commercialisation des phages
1.8.3. Utilisations des bactériophages : classement par domaines
1.8.4. Domaines : phagorepérage et phagoprophylaxie alimentaire
1.8.5. Domaine : phagoassainissement – biofilms
1.8.6. Domaine : phagothérapie (phagobiotiques)
1.8.7. Isolement et observations des bactériophages
1.8.8. Conservation des bactériophages
1.9. Défenses des cellules hôtes contre les phages et formulations multiphages
1.10. Centre de référence pour virus bactériens Félix d’Hérelle 
1.11. Immobilisation cellulaire pour production de phages 
1.11.1. Techniques d’immobilisation
1.11.2. Adsorption
1.11.3. Polymérisation et agrégation
1.11.4. Inclusion
1.12. Alginate: polymère naturel avantageux pour une production de phages
1.12.1. Composition et propriétés ioniques
1.12.2. Technique de production de phages par inclusion de bactéries
BIOLOGICAL INACTIVATION OF ADHERING L. MONOCYTOGENES BY LISTERIAPHAGES AND A QUATERNARY AMMONIUM COMPOUND
2.1. Avant-propos : contribution des auteurs 
2.2. Résumé français
2.3. Abstract 
2.4. Introduction 
2.5. Materials and Methods
2.5.1. Bacteria, phages and media
2.5.2. Test surfaces
2.5.3. Disinfection procedure
2.5.4. Resistance of phages to QUATAL
2.5.5. Statistical analysis
2.6. Results and Discussion
2.6.1. Phage host range
2.6.2. Adherence of L. monocytogenes to surfaces
2.6.3. Disinfection by listeriaphage suspensions
2.6.4. Mixed disinfecting solutions
2.7. Acknowledgements
2.8. References
PRODUCTION OF BACTERIOPHAGES BY LISTERIA CELLS ENTRAPPED IN ORGANIC POLYMERS 
3.1. Avant-propos : contribution des auteurs
3.2. Résumé français 
3.3. Résumé allemand – Zusammenfassung 
3.4. Abstract 
3.5. Introduction
3.6. Materials and Methods 
3.6.1. Bacteria, phages and media
3.6.2. Alginate gels and cell immobilization by entrapment
3.6.3. Morphology of cells immobilized in beads
3.6.4. Phage adsorption
3.6.5. Biomass concentration
3.6.6. Phage production
3.6.6.1. Free cells
3.6.6.2. Immobilized cells used for single and successive phage propagations
3.6.6.3. Statistical analysis
3.7. Results and Discussion
3.7.1. Morphological observations
3.7.2. Phage adsorption
3.7.3. Biomass concentration
3.7.4. Phage production
3.7.4.1. Free cells
3.7.4.2. Immobilized cells used for single and successive phage propagations
3.8. Acknowledgments
3.9. Author contribution
3.10. Absence of conflicts of interest
3.11. References 
TESTS COMPLÉMENTAIRES
4.1. Hémolyse
4.2. Courbe de croissance
4.3. Congélation des listériaphages 
4.4. Activités lytiques des cinq premiers listériaphages répertoriés
4.5. Souches résistantes 
4.6. Influence du pH, de la température et de l’aération
4.7. Courbe d’amplification phagique – burst size (effectif viral) 
DISCUSSION GÉNÉRALE
5.1. Atteinte des objectifs : phagoassainissement
5.2. Atteinte des objectifs : phagoproduction par immobilisation
5.3. Capacités lytiques sous contraintes, résistance bactérienne et évolution
5.4. Nombre de phages libérés et fiches signalétiques
5.5. Retour sur la persistance de L. monocytogenes dans l’intestin : implication de l’adsorption des phages
5.6. Bilan final
5.7. Conclusion et perspectives
BIBLIOGRAPHIE GÉNÉRALE
ANNEXES

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