Technique de mesure de l’activité phosphatase acide

Aspect général

L’Aloe vera, ou Aloe barbadensis Miller, est une petite plante grasse arbustive à aspect de rosettes larges à feuilles épaisses et juteuses. Cette plante arborescente d’environ 80 cm de haut, aux racines courtes et peu profondes, dont la tige très courte, robuste et ligneuse, porte un faisceau de feuilles charnues, de forme lancéolée à section triangulaire et aux extrémités pointues, qui sont disposées en rosette (les jeunes feuilles poussant au milieu et les plus vieilles étant à l’extérieur). La couleur de la plante est d’un vert clair tacheté de vert très clair, aux contours délicats, et elle est parfois parsemée de points roses pendant les périodes froides. Elle n’a pas de tronc, mais c’est un arbrisseau où 12 à 30 feuilles se ramifient dès la base.

Feuilles

Les feuilles charnues, lisses à cuticule épaisse, d’une très belle couleur verte lorsqu’elles sont indirectement au soleil, atteignent 80 cm de long et 10 cm dans leur plus grande largeur, avec des bords munis d’épines jaune clair (MORIN. E, 2008) [5]. La face supérieure de la feuille est plate ou légèrement concave, la face inférieure est fortement convexe (BENSEGUENI, 2001).

La phosphatase acide

La phosphatase acide (PA) est une enzyme de la famille des hydrolases, très abondante dans de nombreux tissus végétaux et animaux. Elle catalyse la déphosphorylation des esters phosphoriques organiques. Les phosphatases acides sont classées parmi les nombreux enzymes connus des végétaux chlorophylliens. Un certain nombre d’entre eux existent à la fois dans le cytoplasme et aussi dans les membranes squelettiques des cellules. Les phosphatases acides des végétaux sont aussi localisées dans les peroxysomes elles sont dites acides car leur fonction enzymatique n’est maintenue que pour des valeurs de pH inférieur à 7 elle est complètement inhibée en milieu basique. Pour la plupart, le pH optimal d’activité est situé entre 4-6 [4]. Par convention les PA sont classées selon plusieurs paramètres à savoir le poids moléculaire, le comportement vis-à-vis des différentes molécules (inhibiteurs ou activateurs) et la spécificité de substrats (Le Pihive., 2009).

Elles sont capables de catalyser l’hydrolyse de tout type de substrat phosphorylé : pNPP, AMP, ATP, Glucose-1-phosphate, Galactose-1-phosphate, Glucose-1,6-diphosphate, Glucose-6-phosphate, NADP, pyrophosphate, uridine-5’-phosphate glucose, uridine-5’-phosphate galactose, phytate de sodium, le phénylphosphate, le phénylphosphate-disodique et le fructose-1-phosphate, etc (Kouadio EJP et al., 2006).

La phosphatase acide semblent impliqués dans :

L’incorporation de phosphate inorganique et la solubilisation des macromolécules de phosphates organiques du sol.

Les mécanismes de régulation métaboliques

L’industrie des engrais pour la biodisponibilité du phosphate inorganique (Pi) qui est généralement sous forme organique dans les sols et des additifs alimentaires (Kouadio EJP et al., 2009).

Technique de mesure de l’activité phosphatase acide L’activité phosphatase acide est mesurée en incubant 200 μl de solution enzymatique (in vitro) ou bien 0.2 g du gel (in vivo) dans un milieu réactionnel, composé de 500 μl de tampon citrate pH 5, 500 μl de substrat 20 mM, ce milieu est incubé au bain-marie à 37 °C. La réaction est arrêtée par l’addition de 500 μl de solution NaOH 0.5 N. Pour les tubes témoin l’addition de l’enzyme se fait après l’arrêt de la réaction. La quantité du produit libéré est dosée selon le type du substrat :

Pour le phényl-phosphate disodique La quantité du phénol libérée est dosée en ajoutant dans tous les tubes, 1 ml du réactif (2+3) v/v, et 0,5 du réactif 4, on mélange puis on laisse la coloration se développer à l’obscurité pendant 10 minutes. On effectue ensuite la lecture de la DO à 510 nm en réglant le zéro par le tube témoin. Pour déterminer la concentration du phénol libéré on utilise une gamme étalon obtenue avec une solution du phénol de 2 mM, qui permet de convertir les valeurs de DO en concentration du phénol.

Résultats et discussion

L’extrait ou les morceaux du gel des feuilles d’Aloe vera sont incubés en présence d’un ester phosphorique dans des conditions de pH et de température. On dose le produit libéré dans le milieu réactionnel par méthodes colorimétriques. Pour tester la présence de l’activité enzymatique dans le gel des feuilles, on a étudié la spécificité de la phosphatase acide de deux substrats différents le pNPP et le phényl-phosphate disodique. Le tableau 2 montre la présence d’une activité phosphatase acide dans le gel des feuilles d’Aloe vera. La PA peut hydrolyser deux substrats, et l’activité sur le pNPP est 5 fois plus élevée que sur le Phényl-phosphate disodique. Ces résultats montrent que le pNPP est le substrat le plus hydrolysé par la phosphatase acide par rapport au phényl phosphate disodique. Pour tester l’activité enzymatique dans le gel des feuilles jeunes et adultes, on a comparé deux méthodes de dosage; la première en utilisant l’extrait enzymatique (in vitro) et la deuxième; des morceaux du gel (in vivo).

Le substrat employé est le phényl-phosphate disodique. Le tableau 3 montre que la PA est active dans les feuilles jeunes et adultes. La méthode in vivo donne les meilleurs résultats avec une activité 2 fois plus élevé que celle obtenue avec la méthode in vitro. L’activité PA paraît plus élevée dans les feuilles jeunes, pour cela on a opté pour l’étude de l’effet de l’âge ainsi que la variation de l’activité PA dans les différentes parties de la feuille. Pour cela on a utilisé la méthode in vivo dans les expériences qui suivent. Afin de différencier l’activité phosphatase acide d’une partie à une autre, une étude s’est réalisée sur les trois parties de la feuille ; partie basale, médiane et apicale. Les valeurs figurant sur le tableau représentent la moyenne de trois répétitions. Le tableau 4 indique que l’activité PA au niveau de la partie basale est de 12,41μM/min; 9,5 μM/min au niveau de la partie médiane et 21,04 μM/min dans la partie apicale, de ce fait nous relevons que l’activité PA est maximale dans la partie apicale.

Ceci peut être expliqué par le fait qu’au niveau de la partie apicale se situe le méristème où ont lieu les divisions cellulaires, il se caractérise par la présence des cellules jeunes dont le métabolisme est actif et donc une activité enzymatique plus importante. Dans l’optique de montrer l’effet de l’âge des feuilles sur l’activité PA, une expérience sur cinq feuilles d’âge différents numérotées de 1 à 5 du haut vers le bas a été réalisée. Les résultats représentent la moyenne des activités PA de trois prélèvements de la partie basale de chaque feuille.

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Table des matières

Partie I : Revue bibliographique
I. Aloe vera
1. Généralités
2. Répartition géographique
3. Description botanique
3.1. Aspect général
3.2.Feuille
3.3. Coupe transversale
3.4. Caractéristiques du gel
4. Composition chimique
5. Vertus thérapeutiques
6. Effet secondaire
II. La phosphatase acide
Partie II. Matériel et méthodes
I. Matériels
1. Matériel biologique
2. Réactifs
II. Méthode
1. Prélèvement du gel
a. Méthode in vitro
b. Méthode in vivo
2. Technique de mesure de l’activité phosphatase acide
3. Variation de l’activité phosphatase acide in vivo dans différentes parties d’une feuille d’Aloe vera
4. Cinétique enzymatique en fonction du temps d’incubation
5. Détermination des paramètres cinétique de la phosphatase acide
6. Effet de la concentration d’enzyme
7. Variation de l’activité phosphatase acide en fonction de l’âge des feuilles
8. Caractéristiques physico-chimiques de la phosphatase acide
a. Effet de pH
b. Effet de température
Partie III. Résultats et discussion
1. Test enzymatique et spécificité du substrat
2. Comparaison de la méthode in vivo et in vitro
3. Variation de l’activité phosphatase acide in vivo dans différentes parties d’une feuille d’Aloe vera
4. Variation de l’activité phosphatase acide en fonction de l’âge des feuilles
5. Cinétique enzymatique en fonction du temps d’incubation
6. Détermination des paramètres cinétiques de la phosphatase acide
7. Effet de la concentration d’enzyme
8. Caractéristiques physico-chimiques de la phosphatase acide
a. Effet de pH
b. Effet de température
Conclusion
Référence bibliographique

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