Soutenance mémoire
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Amyloses Locales
Ce sont les amyloses dont le peptide amyloïde ne provient pas de la circulation sanguine mais de l’organe lui-même. Ces amyloses sont issues d’une dérégulation de la production du peptide amyloïdogénique correspondant.
Nous présenterons ici 3 cas d’amyloses locales : i) le diabète sucré de type 2, une amylose n’impliquant pas le système nerveux central ; ii) la maladie de Parkinson dont le dépôt amyloïde est intracellulaire et iii) la maladie d’Alzheimer, dont les dépôts amyloïdes sont extracellulaires.
i) Dans le cas du diabète sucré de type 2 dit non-insulinodépendant, on retrouve des dépôts d’agrégats d’amyline au sein des ilots de Langerhans du pancréas qui produisent l’insuline (Fig. 2).[2] L’amyline dont le rôle est de réguler le métabolisme énergétique [3] est naturellement co-secrétée avec l’insuline dans un ratio 1:10-100 (amyline/insuline).[4, 5] Dans le diabète de type 2, l’insuline et l’amyline seront secrétées en grande quantité. Le dépôt d’amyline entraîne la destruction de ces ilots par interaction avec les membranes des cellules.[6] Cela induit la diminution de production d’insuline, aggravant ainsi le diabète.
ii) Dans le cas de la maladie de Parkinson, il y a présence de corps de Lewy au sein des neurones à l’extrémité présynaptique (Fig. 3).[8] Ces corps sont composés principalement de la protéine α-synucléine (α-syn) composée de 140 acides aminés. Dans les conditions physiologiques normales, cette protéine est sous forme tétramérique.[9] Dans la maladie de Parkinson, l’α-syn s’agrège pour former les corps de Lewy. Ces agrégats α-syn s’accumulent au sein de la susbstantia nigra et se propageront dans les neurones voisins.[10, 11] La substantia nigra est composée de neurones dopaminergiques contrôlant le putamen, structure du cerveau responsable de l’apprentissage et de la régulation des capacités motrices du corps. À terme, l’accumulation de corps de Lewy cause la destruction des neurones dopaminergiques qui ne peuvent plus stimuler le putamen, provoquant les effets débilitants de la neuropathie : c’est le syndrome moteur.
iii) Dans le cas de la maladie d’Alzheimer, des plaques amyloïdes sont retrouvées dans le cerveau des malades (Fig.4). Celles-ci sont composées du peptide amyloïde-β (Aβ) dont les propriétés feront l’objet d’une partie ultérieure (cf. §III). Ces plaques amyloïdes se déposent à proximité des neurones autour de la zone de l’hippocampe : la zone du cerveau responsable de la mémoire et de l’orientation spatiale ; puis ensuite dans le cortex cérébral [12] responsable des processus cognitifs. Ce dépôt empêche une transmission neuronale correcte. Les neurones, n’étant plus excités, finissent par être détruits,[13] provoquant la perte de mémoire et des facultés cognitives : c’est le syndrome intellectuel.
Cette première partie nous a permis de voir quelques exemples de différents types d’amyloses existantes. L’équipe de recherche dans laquelle cette thèse a été effectuée travaille principalement sur la maladie d’Alzheimer. Elle est présentée dans la deuxième partie de ce chapitre.
La maladie d’Alzheimer
Généralités
Découverte par Aloïs Alzheimer en 1906, les symptômes décrits ont été reportés dans l’article « Über eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde » [14] (« À propos d’une maladie particulière du cortex cérébral ») dont une traduction a été écrite en 1995 par Stelzmann et al.[15] Alzheimer décrivait ici une patiente de 51 ans de l’asile qui présentait une perte de la mémoire, des hallucinations auditives et des délires. Elle souffrait également de paranoïa, de désorientation et de déficience cognitive. Lors de l’autopsie, un cerveau atrophié avec des signes de dégénérescence est observé. Des coupes de cerveau ont montré la présence de fibrilles dans les neurones mais également de petits foyers en forme de grains de millet dispersés dans le cortex. Ces deux marqueurs biologiques sont les enchevêtrements neurofibrillaires et les plaques séniles dont les caractéristiques seront décrites au §II.3.b.
La maladie d’Alzheimer (MA) représente plus de 50 % des formes de démence. Elle possède 2 formes : l’une dite sporadique, la plus répandue, touchant majoritairement les personnes âgées à partir de 70 ans, l’autre d’origine génétique beaucoup plus rare qui touche les individus dès l’âge de 40 ans, parfois même plus précocément. Les principales études statistiques sur la démence indiquent environ 46,8 millions de cas à travers le monde en 2015, dont une incidence de 9,9 millions de nouveaux cas par an, selon le World Alzheimer Report 2015 (Fig. 5). La démence est directement corrélée avec l’âge : elle touche moins de 10 % des 65-80 ans, ce taux dépassant les 30 % au-delà de 90 ans.[16]
Selon World Alzheimer Report 2016,[17] le coût estimé de la démence à travers le monde s’élève à 818 milliards de dollars (U.S.) et devrait d’atteindre les mille milliards en 2018. Ce coût colossal s’explique par le fait que cette maladie n’est actuellement pas curable, seuls les symptômes peuvent être traités, et ce avec une efficacité modérée. La prise en charge des malades de démences se fait au travers de structures adaptées et de personnels de soin pour pallier à la perte d’autonomie des patients. Il existe aussi un coût financier non négligeable pour l’entourage du malade.
Concernant la France d’après la fondation France Alzheimer, on compte environ 850 000 personnes touchées par la MA en 2012 avec environ 250 000 nouveaux cas diagnostiqués par an. Plus de 2 millions de cas sont attendus d’ici 2040.
De plus, la difficulté à diagnostiquer les cas de démences rend la prise en charge du patient difficile.
Signes cliniques
Selon l’ouvrage Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,[18] la MA présente les signes cliniques suivants : (i) une perte progressive de la mémoire, d’abord sur le court puis le long terme. Ceci est dû au fait que les lésions sont localisées en premier lieu dans l’hippocampe qui est la partie du cerveau responsable de la mémoire. (ii) Cette zone est également impliquée dans la navigation spatiale, le patient souffrira donc de désorientation. (iii) Le changement d’humeur ou de comportement, avec des signes de confusion, des difficultés pour parler ou avaler viennent également s’ajouter à la liste des symptômes.
Cette accumulation de symptômes handicapants et la détérioration progressive de l’ensemble des processus cognitifs interfèrent dans l’exécution de tâches quotidiennes mais elle impacte également l’environnement social et professionnel du patient. Ces signes cliniques représentent une première approche au diagnostic de la MA, mais sont peu spécifiques comparés à d’autres démences. La découverte de marqueurs biologiques permet un diagnostic plus précis.[19]
Histopathologie
Anatomie du cerveau
L’autopsie du cerveau révèle des différences de tailles entre le cerveau d’un patient sain et d’un patient atteint de la MA (Fig. 6). En effet, à cause de la dégradation des neurones, le cerveau malade présente une atrophie généralement symétrique et se propageant dans toutes les directions. On a ainsi une réduction globale de la taille du cerveau. En plus de cette réduction, on note une profondeur accrue des sillions du cerveau.[20]
Le rétrécissement du cortex impacte directement le mécanisme de pensée, et celui de l’hippocampe qui entraîne la perte de facultés de mémoire et de navigation spatiale. Les chercheurs se sont donc intéressés aux causes de la dégradation des neurones.
Enchevêtrement neurofibrillaires et plaques séniles
Les enchevêtrements neurofibrillaires (Fig. 7A) et les plaques séniles (Fig. 7B) ont été décrits pour la première fois dans l’article d’Alzheimer. [14, 15] Ils sont les marqueurs histo-pathologiques témoignant des altérations de l’activité neuronale. Ils sont intracellulaires pour les enchevêtrements fibrillaires et extracellulaires pour les plaques séniles. La composition des enchevêtrements a été découverte en 1986 par Grundke-Ibal et al.,[22] et correspond à la protéine Tau hyperphosphorylée. Cette protéine est normalement impliquée dans le mécanisme de stabilisation des microtubules du cytosquelette du neurone. L’hyperphosphorylation de Tau est également retrouvée dans d’autres maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson atypique ou encore la maladie de Pick.
Les plaques séniles sont quant à elles composées du peptide amyloïde-β. Ce peptide contrairement à la protéine Tau est spécifique à la MA. Voilà pourquoi il a longtemps représenté un sujet d’étude majeur pour les chercheurs dans la compréhension de la maladie. Et il est proposé que l’apparition des plaques d’Aβ précède celle des enchevêtrements fibrillaires.[24]
L’amyloïde-β
Généralités
L’amyloide-β (Aβ) désigne un ensemble de peptides globalement hydrophobes composés de 39 à 43 acides aminés et comportant une partie N-terminale hydrophile, dont la séquence totale a été élucidée pour la première fois par Mori en 1992.[25] Les formes comprenant 40 et 42 acides aminés, nommés respectivement Aβ40 et Aβ42, sont les formes majoritaires du peptide dans le cerveau malade dont les séquences en acides aminés sont illustrées ci-dessous (Fig. 8).
Le peptide Aβ est produit à partir la protéine précurseur de l’amyloïde (amyloid precursor protein : APP) par coupure sélective par la β-sécrétase et la γ-sécrétase. L’APP est une protéine transmembranaire dont on a pu démontrer le rôle dans la formation de synapse,[26] la régulation de l’activité neuronale,[27] et supposer son activité dans l’export de Fer.[28]
L’APP comporte 2 voies de protéolyse : une dite non amyloïdogénique qui ne produit pas le peptide amyloïde-β et une dite amyloïdogénique produisant ce dernier.[29]
Dans la voie non amyloïdogénique (Fig.9A) l’APP est clivée par l’α-sécrétase pour donner 2 fragments, l’APPsα qui part dans le milieu extracellulaire et l’α-CTF qui reste dans la membrane. Ce dernier subit une coupure par la γ-sécrétase pour donner 2 nouveaux fragments : i) le fragment p3, aussi nommé peptide amyloïde-β 17-40/42, est extracellulaire et hydrophobe. Son rôle est encore mal connu puisqu’il a été démontré qu’il serait à la fois neuroprotecteur [30] et qu’il seraient également impliqué dans l’augmentation de la réponse inflammatoire dans la MA et dans la mort cellulaire de neuroblastome par apoptose.[31] ii) Le fragment AICD intracellulaire a un rôle supposé dans la transcription de certains gènes.[32]
Dans la voie amyloïdogénique (Fig. 9B) l’APP est clivée par la β-sécrétase pour donner elle aussi 2 fragments. Le fragment APPsβ extracellulaire et le fragment β-CTF restant dans la membrane. Ce dernier subit également une coupure par la γ-sécrétase pour donner le peptide Aβ d’un côté et le fragment AICD de l’autre.
Figure 9. Dessin réprésentant l’APP et ses différentes voies de clivages peptidiques. La voie A non amyloïdogéniques produisant le fragment p3. La voie B amyloïdogénique produisant l’Aβ. (O’Brien, 2011) [29]
Le peptide Aβ est produit en minorité en conditions physiologiques normales sans nécessairement conduire à la MA.[33] La régulation du peptide Aβ est permise par l’activité protéolytique des protéases dégradant l’Aβ (AβDPs).[34] C’est la dérégulation de la production du peptide Aβ qui serait à l’origine de la formation des plaques et des dégâts sur les neurones : c’est l’hypothèse de la cascade amyloïde qui sera traitée dans la partie suivante.
La cascade amyloïde
L’hypothèse de la cascade amyloïde, telle énoncée par John A. Hardy et Higgins en 1992, établirait l’origine des plaques amyloïdes β et des enchevêtrements neurofibrillaires.[35] En effet, l’accumulation du peptide Aβ, et la formation de plaques, impacterait l’homéostasie des ions calcium en augmentant leur concentration dans le milieu intracellulaire. Cette augmentation d’ions calcium en intracellulaire déclencherait une cascade de signaux qui mène à l’hyperphosphorylation de la protéine Tau. L’hyperphosphorylation de Tau aurait pour conséquence l’enchevêtrement neurofibrillaire au sein du neurone. Ainsi l’hypothèse de la cascade positionne la formation de la plaque amyloïde comme cause de la dégradation du neurone et de l’hyperphosphorylation de la protéine Tau.
La formation des plaques d’Aβ se fait au travers d’un processus d’agrégation (Fig. 10). Cette agrégation démarre avec les formes solubles et monomériques du peptide Aβ qui s’assemblent pour former des agrégats oligomériques. Ces oligomères servent de base pour former des fibres. Les peptides se replient sous forme de feuillet β pour donner des protofibrilles qui à leur tour s’assemblent pour former des fibrilles. Ces fibrilles s’aggrégent ensuite pour former les plaques qui se déposent sur les neurones, causant la déstabilisation des membranes cellulaires jusqu’à la neurodégénération.
Dix ans plus tard, une revue écrite par Hardy et Selkoe met à jour l’hypothèse de cascade amyloïde.[27] Plusieurs chercheurs ont démontré que la présence de la plaque amyloïde ne justifie pas la sévérité des symptômes. Il a été établi entre autre qu’en dépit d’une inhibition de la formation de fibrilles le peptide Aβ42 demeurait neurotoxique. Des intermédiaires oligomériques nommés ADDLs (pour Aβ-derived diffusible ligand) sont formés et causent des dégâts sur les cellules nerveuses en culture.[37] De même que les protofibrilles métastables peuvent également induire une neurotoxicité en altérant l’activité électrique des neurones provoquant ainsi leur destruction.[38] Ceci conditionne l’évolution de l’hypothèse qui suggère de considérer davantage les espèces oligomériques d’Aβ plutôt que les plaques comme espèces toxiques.[39]
D’autres hypothèses ont été énoncées concernant l’origine des molécules neurotoxiques. Certaines d’entre elles impliquent la production de peptides tronqués en N-terminal de la séquence peptidique d’Aβ. Un article récent de l’équipe de Belfort suggère la formation d’un peptide tronqué par perte des 2 premiers acides aminés (Asp et Ala) donnant lieu à la cyclisation de l’acide glutamique pour former un dérivé pyroglutamate d’Aβ présentant une stabilité, une abondance et une toxicité accrue par rapport aux peptides Aβ40 et Aβ42, en raison d’une mauvaise dégradation.[40]
Malgré la forte suspicion de la toxicité des espèces oligomèriques, la méconnaissance de leur structure et la difficulté à les isoler du fait de leur métastabilité rendent leur étude difficile. La plaque amyloïde reste dès lors un sujet d’étude majoritaire sur la MA, car elle offre un cadre d’étude plus reproductible et une démarche de rationalisation plus fiable.
Structure des fibres et site d’interaction
La plaque Aβ mais également les agrégats amyloïdes d’autres protéines partagent une structure commune. Les travaux de Sunde et Blake [41] par cristallographie par diffraction aux rayons X ont démontré l’existence d’une structure dite « cross-β-sheet » dans laquelle le peptide amyloïde se replie sur lui-même en feuillet β avec un espacement d’environ 10-11 Å. Les peptides amyloïdes s’additionnent les uns sur les autres formant l’axe fibrillaire, l’espace entre chaque feuillet β vaut 4,8 Å (Fig. 11).
Cet agencement particulier des fibres permet l’existence d’un sillon hydrophobe formé par les chaînes latérales des peptides (Fig. 11) où de nombreux ligands peuvent s’intercaler.[42] Ces ligands ont permis l’étude des fibres amyloïdes-β ainsi que du phénomène d’agrégation. La partie suivante exposera les différents outils qui ont permis de telles études.
Outils moléculaires utilisés dans l’étude des plaques d’agrégation.
Cette partie présentera les différentes molécules produites pour l’étude du peptide Aβ dans la MA. Une première partie sera consacrée aux structures des molécules « historiques » avec la technique qui lui est associée. Une seconde partie sera ensuite consacrée aux différentes améliorations apportées à ces structures ainsi qu’à leur utilisation in vitro et in vivo dans l’étude de la MA.
Les structures « historiques » et leurs techniques.
Biréfringence avec le Rouge Congo
La coloration histologique des tissus fut une des premières utilisées dans l’étude des plaques amyloïdes. L’une des molécules utilisée est le Rouge Congo (CR). Elle fut synthétisée à l’origine en 1883 par Paul Bottiger travaillant pour Bayer dans le but de trouver un colorant à textile sans utiliser de mordant (un produit fixant les colorants sur les textiles). Sa structure présente un motif dimérique constitué d’azobenzènes (Fig. 12). Des groupements sulfonates assurent à la molécule une bonne solubilité dans l’eau (25 g/L à 20 °C), bien que celle-ci présente une tendance à s’auto-assembler par interaction π-π conduisant à une suspension colloïdale.
La découverte de l’affinité du CR pour les fibres amyloïdes provient de sa capacité à colorer les plaques amyloïdes en rose-rouge sous lumière blanche mais surtout de posséder une biréfringence verte pomme (Fig. 13).
Cette biréfringence est due à l’orientation du CR se positionnant parallèlement à l’axe de la fibre amyloïde au niveau du sillon formé par les chaînes latérales (Fig. 11).[44] Le CR est encore utilisé de nos jours pour le diagnostic des maladies amyloïdes systémiques par coloration d’une biopsie de l’organe dans lequel on suspecte la présence de dépôts amyloïdes. Cependant il ne peut être utilisé pour le diagnostic de la MA puisque la biopsie cérébrale est hautement risquée pour le patient, en particulier au regard de l’information qu’elle peut apporter. Ceci a conduit les chercheurs à développer des sondes ayant une structure apparentée au CR pouvant être utilisées dans d’autres techniques moins invasives. L’utilisation du CR sera limitée aux applications in vitro ou ex vivo.
Les Thioflavines T et S et la fluorescence.
La fluorescence est un phénomène de luminescence d’un matériau ou d’une molécule en solution qui après avoir été excité par un photon va émettre un photon de plus faible énergie. Ce phénomène peut être expliqué à l’aide du diagramme de Jablonski (Fig. 14). En effet, l’absorption d’un photon d’énergie hνA par la molécule va porter celle-ci dans un état excité (S=1) depuis l’état fondamental (S=0). La molécule retourne ensuite à l’état fondamental rapidement en 10-12 s en émettant un photon d’énergie hνB (νB < νA). La fluorescence est à différencier de la phosphorescence où la molécule depuis l’état S=1 passe à l’état triplet T=1 de manière non-radiative. Puis la molécule retourne à l’état fondamental depuis l’état triplet en émettant un photon d’énergie hνC avec (νc < νB < νA) avec un temps beaucoup plus lent de l’ordre de 10-9 s.[45]
La fluorescence est une technique largement utilisée pour les études liées à la MA et l’hypothèse de la cascade amyloïde, en particulier celles faisant intervenir la Thioflavine T (ThT). La structure de la ThT présente un motif BzT dérivé en position 2 par une N,N-diméthylaniline et en 6 par un groupement méthyl. L’azote du cycle thiazole est méthylé donnant une charge positive permanente à la molécule (Fig.15), ceci lui permet d’être parfaitement soluble dans l’eau comparé aux BzT neutres. Une partie sera consacrée à cet aspect ultérieurement (cf. §V). Elle fut utilisée pour la détection des agrégats amyloïdes pour la première fois par Vassar et Culling en 1959.[46] La ThT est utilisée de nos jours en tant que standard dans l’étude de l’agrégation in vitro du peptide Aβ et la quantification des agrégats suite aux travaux de LeVine en 1999.[47] Il est à noter qu’il existe la Thioflavine S (Fig. 15) également utilisée dans certaines études ex vivo pour détecter les agrégats d’Aβ. [48, 49]
L’utilisation de la ThT dans l’étude de l’agrégation repose sur le principe suivant :
En solution, la ThT présente une longueur d’onde d’absorption (λabs) à 412 nm en UV-Vis. Lorsque celle-ci est liée aux fibres, sa λabs se décale vers le rouge, passant à 440 nm. En fluorescence, lorsque la molécule est liée aux agrégats amyloïdes, l’excitation est à λexc de 440 nm et l’émission λém à 482 nm. Par ailleurs, l’intensité de fluorescence de la ThT liée est supérieure de plusieurs ordres de grandeur à celle de la ThT libre (Fig. 16). L’effet bathochrome en absorption et l’exaltation de l’émission sont exploités pour étudier la cinétique à laquelle l’agrégation du peptide se fait. En effet, la ThT se lie aux feuillets β des agrégats. Ceux-ci seront très majoritairement présents au moment de la formation des protofibrilles c’est-à-dire en fin d’étape de nucléation. À partir de ce moment-là, l’élongation des fibrilles pour former les fibres se fera très rapidement, incorporant de plus en plus de ThT puisqu’il se formera de plus en plus de structures en feuillets β jusqu’à l’agrégation complète des fibres qui se traduira par un plateau (Fig. 16).[50]
Bien que véritable « gold standard » pour l’étude de l’agrégation des amyloïdes, la ThT souffre de quelques défauts. Elle ne peut être utilisée pour des applications in vivo en raison de : i) sa charge positive permanente lui assure une grande solubilité dans l’eau mais l’empêche de traverser la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) à l’instar du CR. ii) De plus, ses longueurs d’onde d’émission et d’excitation ne sont pas assez grandes pour permettre une pénétration efficace du rayonnement dans les tissus biologiques.
Son utilisation in vitro présente aussi quelques biais. iii) L’exaltation de sa fluorescence sera dépendante de la nature même des fibres Aβ,[47] comme tout fluorophore elle souffre également d’un effet de filtre interne (IFE : inner filter effect) rendant difficile les mesures quantitatives,[51, 52] et enfin elle possède une affinité relativement limitée pour les fibres avec une constante de dissociation (Kd) de l’ordre du µM.[53]
Ces problèmes peuvent être résolus en agissant sur différents aspects : i) travailler avec des molécules neutres pour augmenter les chances de traverser la BHE, ii) utiliser des fluorophores pouvant émettre dans l’infra-rouge (IR) pour augmenter la pénétrabilité des rayonnements à travers les tissus biologiques. iii) travailler avec des molécules possédant un déplacement de Stokes (c’est-à-dire la différence entre la λabs et λém) suffisamment grande pour limiter l’IFE. Nous verrons dans la partie consacrée à la fluorescence les différentes molécules proposées par les chercheurs pour pallier les faiblesses de la ThT.
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Table des matières
Chapitre I : Rappels bibliographiques
Introduction
I Les maladies amyloïdes
I 1 Définition
I 2 Histologie/Description
I 2 a Amyloses Systémiques
I 2 b Amyloses Locales
II La maladie d’Alzheimer
II 1 Généralités
II 2 Signes cliniques
II 3 Histopathologie
II 3 a Anatomie du cerveau
II 3 b Enchevêtrements neurofibrillaires et plaques séniles
III L’amyloïde-β
III 1 Généralités
III 2 La cascade amyloïde
III 3 Structure des fibres et site d’interaction
IV Outils moléculaires utilisés dans l’étude des plaques d’agrégation
IV 1 Les structures « historiques » et leurs techniques
IV 1 a Biréfringence avec le Rouge Congo
IV 1 b Les Thioflavines T et S et la fluorescence
IV 1 c Les autres structures d’affinité pour l’Aβ
IV 1 d Conclusion sur les structures de bases
IV 2 Les techniques d’études in vitro/ex vivo
IV 2 a Fluorescence
IV 2 b Résonance Paramagnétique Électronique
IV 3 Études in vivo
IV 3 a Tomographie par Émission de Positons …
IV 3 b Tomographie par Emission Monophotonique
IV 3 c Imagerie par Résonnance Magnétique
IV 4 Conclusion sur les techniques
V Le motif Benzothiazole
VI Conclusion et projet de recherche
Bibliographie du Chapitre I
Chapitre II : Synthèse des dérivés 2-aryl-BzT et de la NMA
I Voies d’accès autour du motif benzothiazole
I 1 Rappels bibliographiques
I 1 a A partir d’aminothiophénol
I 1 b A partir de l’aniline
I 1 c A partir du noyau thiazole
I 1 d Choix de la voie utilisée
I 2 Couplages C-C entre les BzT et les dérivés aryles
I 2 a Couplage de Stille
1 2 b Couplage de Miyaura-Suzuki
1 2 c Couplage par activation de la liaison C-H
I 3 Voies de synthèse privilégiées pour la synthèse de la NMA
II Synthèse du fragment A
II 1 Formation du cycle benzothiazole
II 2 Synthèse du composé 3
II 3 Iodation du composé 3
II Synthèse autour du fragment B
II 1 Protection de la 4-bromoaniline
II 2 Méthylation du composé 2’
II 3 Synthèse du composé 4’
III Formation du motif C et variations de fonctions
III 1 Synthèse du composé 5a par réaction de Suzuki-Miyaura
III 2 Réduction en alcool du composé 5a
III 3 Oxydation du composé 6a
III 4 Réaction d’amination réductrice du composé 7a
IV Déprotection du Boc de 8a et purification de la NMA 8b par production de sels chlorhydrates
IV 1 La déprotection de la fonction Boc
IV 2 La formation des sels chlorhydrates de la NMA
V Conclusion
Bibliographie du chapitre II
Chapitre III : Synthèses de dérivés du 2-aryl-BzT pour les études en physico-chimie
I Introduction
II Synthèse des composés 12b et 16b : la sonde 2-aryl-BzT radicalaire
II 1 Synthèse du composé 12b par amination réductrice
II 1 a Voie 1 : intégration du motif 4-amino-TMP
II 1 b Voie 2 : intégration du motif 4-amino-TEMPO
II 2 Synthèse du composé 16b par amidation
II 2 a Production des composés 13a/13b
II 2 b Voie 1 : intégration du motif 4-amino-TMP
II 2 c Voie 2 : introduction du 4-amino-TEMPO
III Synthèse du composé 9b : la sonde 2-aryl-BzT de photoaffinité
III 1 Formation de la diaziridine
III 2 Formation de la diazirine et activation du groupement carboxylate
III 3 Réaction de couplage entre la NMA protégée au Boc et le dérivé diazirine
III 3 a Description de la réaction de couplage
III 3 b Description des spectres RMN du composé 9a
III 3 c Déprotection de la fonction Boc portée par le composé 9a
IV La Chimie click et la fonction azoture
IV 1 Généralités
IV 2 Réactivité des azotures
IV 3 La réaction de cycloaddtion (3+2) de Huisgen
IV 4 Fonctionnalisation du motif 2-aryl-BzT par cycloaddition de Huisgen
IV 5 Voie d’accès au dérivé azoture
IV 5 a Voie A indirecte par la formation du dérivé tosylate
IV 5 b Voie B directe à partir de l’alcool
IV 6 Déprotection de la méthylaniline du composé 18a
V Réaction avec les composés 18a/18b
V 1 Formation de l’amine
V 1 a Hydrogénation catalytique
V 1 b La réaction de Staudinger
V 2 La cycloaddition Azoture-Alcyne catalysée au cuivre (CuAAC) …
VI Publication de la structure du complexe [Cu(Cl2)(20a)]n
VII Conclusion et perspectives
Bibliographie du Chapitre III
Chapitre IV : Techniques de suivi d’agrégation de l’amyloïde-β
I Introduction
II Mesures d’affinités des différentes sondes pour les fibres
II 1 Principe et protocole
II 2 Résultats et interprétations
II 2 a Analyse des pourcentages d’insertion
II 2 b Évaluation d’une constante de dissociation approximée K’d
II 3 Conclusion et perspectives
III Suivi de l’agrégation par la fluorescence de la NMA
III 1 Principe de fluorescence
III 2 Expérience et résultats
III 2 a Suivi de l’agrégation du peptide Aβ28 avec la ThT et la NMA
III 2 b Suivi de l’agrégation en présence simultanée de la ThT et de la NMA
III 3 Conclusion et perspectives
IV Suivi de l’agrégation par voltampérométrie cyclique de la sonde Fc-BTA
IV 1 Principe de l’électrochimie pour l’étude de l’agrégation
IV 1 a Voltampérométrie cyclique (CV : cyclic voltammetry)
IV 1 b Voltampérométrie à vague carrée (SWV : Squarewave voltametry)
IV 1 c L’électrochimie pour suivre l’agrégation
IV 2 Expériences et résultats
IV 2 a Influence des fibres Aβ28 sur le voltammogramme du Fc-BTA
IV 2 b Résultats et interprétations
IV 2 c Calcul du K’d
IV 3 Conclusion et perspectives
V Suivi de l’agrégation de la sonde TEMPO-BTA
V 1 Principes des mesures RPE pour suivre l’agrégation
V 2 Expériences et résultats
V 2 a Influence du peptide Aβ28 sous forme agrégée ou non sur le signal RPE du TEMPO-BT
V 2 b Suivi de l’agrégation par RPE
V 2 c Calcul de la constante de dissociation K’d
V 2 d Calcul du temps de corrélation τc
V 3 Conclusion et perspectives sur le suivi d’agrégation par RPE
VI Conclusion générale sur l’étude de l’agrégation
Bibliographie du chapitre IV
Chapitre V : Vers une caractérisation du site d’interaction entre le peptide Aβ et le motif 2-aryl- BzT
I Investigation de l’interaction ligand/protéine par cristallographie aux RX et criblage in silico
I 1 Cristallographie aux RX
I 2 Cryomicroscopie électronique (Cryo-ME)
I 3 Criblage in silico
II Investigation de l’interaction TEMPO-BTA et du peptide Aβ par RMN
II 1 Utilisation de la RMN pour détecter les sites d’intérêts
II 2 Expériences et résultats
II 3 Conclusion et perspectives
III Investigation de l’interaction DA-BTA et le peptide Aβ par SM
III 1 Principe et choix de la fonction de photomarquage
III 1 a Nitrène via le motif azoture de phényle
III 1 b Radical carbocentré via le motif benzophénone
III 1 c Carbène via le motif diazirine
III 1 d Résumés des caractéristiques des fonctions chimiques de photomarquage
III 2 Expériences et résultats
III 2 a Protocole
III 2 b Résultats préliminaires et interprétations
III 3 Conclusion et perspectives
IV Conclusion générale sur la caractérisation du site d’interaction
Bibliographie du Chapitre V
Conclusion générale
Annexes
Parties expérimentales
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