Synthèse et maturation de l’ARN messager 

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Epissage des ARN messagers

Les pré-ARNm sont constitués d’une alternance de séquences qui feront parties de l’ARNm mature, les exons, et de séquences excisées, les introns. Les introns sont en général dans les régions codantes, plus rarement dans la région 5’ non traduite (5’UTR) de l’ARNm et exceptionnellement dans la région 3’ non traduite (3’UTR). Au cours de leur maturation les pré-ARNm subissent une étape d’épissage, qui permet l’excision et l’élimination des introns, pour ne conserver que les exons et les lier entre eux (Jurica and Moore, 2003). La taille des introns varie de quelques dizaines à plusieurs centaines de milliers de nucléotides chez l’homme, avec une taille moyenne de 1900 nucléotides (nt) contre 125 nt pour les exons. On estime qu’il y a en moyenne 7,8 introns contre 8,8 exons par gène (Hoskins and Moore, 2012).
L’excision des introns et la ligation des exons sont réalisées en deux réactions de trans-estérifications successives par la machinerie d’épissage ou spliceosome (Jurica and Moore, 2003). Le spliceosome reconnait les sites consensus d’épissage et catalyse les réactions de trans-estérifications par rapprochement des sites donneurs et accepteurs d’épissage situés de part et d’autre des introns (Will and Luhrmann, 2011). Le complexe de jonction d’exons EJC (Exon Junction Complex) est alors déposé par le spliceosome, 24 nucléotides en amont de la jonction exon-exon (Le Hir, 2000; Le Hir et al., 2000). L’EJC, qui est transporté avec l’ARNm mature vers le cytoplasme, est impliqué dans l’export des ARNm hors du noyau. L’EJC participe aussi à la localisation subcellulaire des ARNm ainsi que dans la régulation de leur niveau de traduction (Giorgi and Moore, 2007). Enfin, l’EJC joue un rôle clé dans le contrôle de qualité des ARNm et sera dissocié à l’issue du premier cycle de traduction.
L’épissage des ARN messagers peut être alternatif. Dans ce cas, certains exons peuvent être exclus et, de la même façon, certains introns peuvent être maintenus dans la séquence de l’ARNm mature (Figure 1). Ainsi, à la fin de l’étape d’épissage, le transcrit d’un même gène donne plusieurs ARNm matures, qui codent pour différents variant protéiques. On a longtemps estimé qu’environ 60% des gènes subissent un processus d’épissage alternatif, permettant de générer 100 000 protéines différentes à partir des 24 000 gènes du génome humain (Nilsen and Graveley, 2010). Cependant, avec l’arrivée des nouvelles technologies de séquençage à haut débit, cette proportion semble être beaucoup plus importante et il semblerait qu’environ 90% des gènes sont le siège d’un épissage alternatif chez l’homme (Wang et al., 2008). L’épissage alternatif est un processus important de la régulation de l’expression des gènes.

Maturation de l’extrémité 3’ de l’ARN messager

A la fin de la transcription, la maturation des pré-ARNm se termine par l’ajout d’une séquence poly-Adénosine ou poly(A) en 3’de la région 3’UTR. A l’exception des histones, tous les transcrits synthétisés par l’ARN polymérase II sont polyadénylés. Cette queue poly(A) peut avoir une taille variable selon le transcrit, allant de 200 à 300 résidus adénosine chez l’homme.
L’ajout de la queue poly(A) se fait en plusieurs étapes. Dans un premier temps, les pré-ARNm sont clivés au niveau d’une séquence poly(U) ou riche en doublets GU, appelée DSE pour DownStream Element, dans une région située à environ 10 à 30 nucléotides en aval du signal de polyadénylation, typiquement de forme AAUAAA. Une dizaine de résidus adénosine sont alors ajoutés à l’extrémité 3’ par la Poly(A) Polymerase (PAP). La distance entre le signal AAUAAA et le DSE détermine donc la région dans laquelle va s’effectuer le clivage. Le site précis de cette coupure est de préférence en 3’ d’un résidu A, le plus souvent après le di-nucléotide CA. L’efficacité du clivage semble être influencée par une séquence en amont, riche en résidus U appelée USE pour UpStream Element, par l’environnement nucléotidique du signal AAUAAA et probablement par la structure secondaire même de la 3’UTR (Tian and Graber, 2012). Cependant, les modalités du clivage ne sont que partiellement connues. Deux facteurs, le CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) et le CstF (cleavage stimulation factor), qui se fixent respectivement sur le signal AAUAAA et sur le DSE, sont indispensables (Millevoi and Vagner, 2010). De même, la PAP semble intervenir dans le processus, mais la protéine qui porte l’activité endonucléase n’a pas encore été identifiée. Le clivage produit une extrémité 3’- OH sur les pré-ARNm, à laquelle la PAP ajoute une dizaine de résidus A, alors que le fragment présentant l’extrémité 5’-phosphate est rapidement dégradé. Dans un second temps, la séquence poly(A) est allongée, et cette extension dépend uniquement de la présence des 10 premiers résidus précédemment ajoutés et du CPSF. En effet, la séquence de 10 résidus A est nécessaire et suffisante pour que la protéine PABPN1 (Poly(A) Binding Protein Nuclear 1) s’y fixe et stimule, en coopération avec le CPSF, l’activité de la PAP en augmentant sa processivité (Kühn and Wahle, 2004) et permettant l’addition d’adénosines supplémentaires (Parent and Bisaillon, 2006). La longueur initiale de la séquence poly(A) est d’environ 200 à 300 résidus adénosines chez les eucaryotes supérieurs et semble être contrôlée par la PABPN1 qui en changeant de conformation permet la dissociation de PAP et l’arrêt de la polymérisation. Cette queue poly(A) via son interaction avec PABPN1, intervient dans le transport nucléo-cytoplasmique des ARNm. Une fois l’ARNm mature transporté dans le cytoplasme, la PABPN1 est remplacé par son homologue cytoplasmique PABPC1 qui le protège contre la dégradation par les ribonucléases agissant dans le sens 3’ vers 5’ et qui intervient dans l’initiation de leur traduction et dans le contrôle de leur stabilité.

Structure de l’ARNm mature eucaryote

L’ARN messager eucaryote mature est une structure tripartite, la séquence codant la protéine se trouve au milieu du transcrit, au sein de la phase ouverte de lecture appelée ORF (Open Reading Frame), cette dernière commence par un codon d’initiation et se termine par un codon stop. Elle est constituée de triplets de nucléotides ou codons qui codent chacun un acide aminé. L’ARN messager eucaryote ne peut être réduit à son cadre de lecture mais possède aussi en amont et en aval des séquences dites non traduites appelées 5’ et 3’ UTR (Untranslated Transcribed Region). Ces éléments sont impliqués dans la régulation de la traduction et dans la stabilité des ARN messagers.
En plus de la coiffe, la région 5’UTR d’un ARNm peut contenir des régions structurées telles que les IRES (Internal Ribosome Entry Site) qui peuvent recruter la machinerie de traduction indépendamment de la coiffe, et des uORF, qui, plus favorablement traduites que l’ORF principale, sous certaines conditions particulières (stress, carence, etc.) sont impliquées dans la régulation de la traduction ainsi que dans la stabilité des ARN messagers.
Dans sa région 3’UTR, l’ARNm peut contenir des régions structurées, des motifs de fixation de diverses protéines régulatrices liant l’ARN appelées de façon génériques RBP (RNA-Binding Proteins), des séquences spécifiques permettant l’appariement de petits ARN (miRNA) et enfin, la queue polyA (Figure 2). Si les séquences spécifiques assurant la liaison de protéines ou encore des miARN peuvent être présentes dans l’ensemble du messager, elles se trouvent cependant de préférence dans les régions 3’UTR. Les éléments permettant l’adressage des ARNm et leur rétention au niveau des différents compartiments cytoplasmiques sont essentiellement situés dans les régions 3’UTR (St Johnston, 1995), sans doute parce qu’à l’inverse des 5’UTR, ces régions ne sont soumises à aucune contrainte, et fournissent un terrain propice à l’évolution des éléments de régulation. Ainsi, la région 3’UTR est nécessaire et suffisante au contrôle de la distribution d’un ARNm réparti de façon non uniforme. Par son interaction avec des protéines régulatrices agissant en trans, l’ARNm va être dirigé et retenu dans le site où la protéine correspondante sera ultérieurement nécessaire.

La formation du complexe ternaire eIF2-GTP-Met-ARNtiMet

Le facteur eIF2 est une GTP-ase qui se présente sous deux formes, eIF2-GTP et eIF2-GDP. Le recyclage de la forme eIF2-GDP en eIF2-GTP s’effectue grâce au facteur d’échange eIF2B. Lorsqu’eIF2 est sous sa forme active liée au GTP, il s’associe spontanément avec le Methionyl-ARNt initiateur pour former le complexe ternaire eIF2-GTP-Met-ARNtiMet (Sonenberg and Hinnebusch, 2009). Le Methionyl-ARNt initiateur assure l’apport de la méthionine initiatrice qui formera l’extrémité N-terminale de la protéine en cours de synthèse (Figure 4). L’ARNt initiateur a une grande affinité pour eIF2-GTP et n’en a pas pour eIF2-GDP. C’est cette différence d’affinité qui va permettre sa dissociation après hydrolyse du GTP lors de la reconnaissance du codon initiateur (Kapp and Lorsch, 2004).

Les facteurs d’assemblage du complexe de pré-initiation 43S

En parallèle à la formation du complexe ternaire, la petite sous unité ribosomique 40S s’associe aux facteurs eIF1, eIF1A, eIF3 et eIF5. Cette association favorise la fixation du complexe ternaire sur la 40S pour former le complexe de pré-initiation 43S (Majumdar et al., 2003). Les deux sous-unités ribosomiques sont maintenues dissociées grâce aux facteurs d’initiation qui se fixent sur la surface d’interaction de la 40S à la 60S, prévenant ainsi la formation de ribosome 80S inactif (Figure 4) :
– eIF1 se fixe près du site P et interagit avec eIF3.
– eIF1A se fixe au niveau du site A près du canal d’entrée de l’ARNm et projette ses extrémités dans la cavité du site P, ce qui lui permet d’interagir avec les facteurs eIF3 et eIF2 et de stabiliser le complexe ternaire qui s’insère au niveau du site P.
– eIF5 interagit par ces extrémités N et C terminales avec eIF2 et eIF3.
Le facteur eIF3 est nécessaire à la liaison du complexe ternaire sur la petite sous-unité ribosomique 40S (Dong and Zhang, 2006), et il est aussi capable d’interagir directement avec l’ARN messager (Hinnebusch, 2006).
Les facteurs eIF1, eIF1A et eIF3 une fois liés à la petite sous-unité 40S facilitent la liaison des autres facteurs et permettent un changement de conformation de la sous-unité 40S du ribosome. Cette action ouvre le site de liaison à l’ARNm (Liljas, 2013; Passmore et al., 2007; Sonenberg and Hinnebusch, 2009). Le maintien d’une conformation ouverte de la sous-unité 40S faciliterait le balayage de l’ARNm par le complexe d’initiation jusqu’au codon initiateur.

Formation du complexe eIF4F

Le complexe 43S doit ensuite être recruté en 5’ sur l’ARNm. Cette association n’est possible que si certains facteurs d’initiation sont déjà liés à la coiffe m7-GTP de l’ARNm. Ainsi, de façon concomitante à la formation du complexe de pré-initiation 43S, le complexe eIF4F se forme au niveau de la coiffe. Ce complexe est composé de trois facteurs d’initiation de la traduction eIF4A, eIF4E et eIF4G et de modulateurs eIF4B et/ou eIF4H et PABP. Le facteur eIF4E se lie directement
à la coiffe de l’ARNm ce qui permettra le positionnement du complexe 43S à l’extrémité du transcrit (Sonenberg et al., 1979). Le facteur eIF4E recrute la protéine d’échafaudage eIF4G, l’interaction entre ces deux protéines permet d’ancrer ces protéines de façon stable sur l’ARNm grâce aux sites de liaison à l’ARNm d’eIF4G. Le facteur eIF4G se lie à l’ARN via des motifs RRM (RNA recognition motif) même en l’absence du facteur eIF4E (Mitchell et al., 2010). Ainsi la liaison d’eIF4E à la coiffe sert aussi à prévenir la formation de complexes aberrants sur l’ARNm. Sur le facteur eIF4G vient se fixer le facteur eIF4A, qui est une hélicase de l’ARN qui prévient la formation de structures secondaires dans la région proche de la coiffe de l’ARNm. La protéine PABP, qui fixe la queue poly(A) du messager est également recrutée par la protéine d’échafaudage eIF4G. Les liaisons de PABP à eIF4G et à la queue poly(A) rapprochent les régions 5’ et 3’UTR du messager ce qui permet la circularisation de l’ARNm (Wells et al., 1998). Dans cette configuration, la petite sous-unité ribosomique 40S est liée par l’intermédiaire des facteurs d’initiation à l’extrémité 5’ de l’ARNm ainsi qu’à son extrémité 3’. Selon ce modèle en boucle, PABP permet une synergie entre la coiffe et la queue poly(A) de l’ARN, ce qui augmente les efficacités de traduction et de recyclage des composantes du complexe d’initiation de la traduction (Amrani et al., 2008; Kahvejian et al., 2001; Rajkowitsch et al., 2004).

Formation du complexe d’initiation 48S

Le facteur eIF4F (eIF4A/eIF4E/eIF4G) a un rôle essentiel dans la mise en place du complexe d’initiation 48S, grâce au facteur eIF4G qui recrute le complexe de pré-initiation 43S via son interaction avec le facteur eIF3 (sous-unité eIF3e) porté par le complexe 43S. Des expériences menées in vitro ont montrés que le complexe de pré-initiation 43S se lie directement sur les ARNm dépourvus de structures secondaires (Pestova and Kolupaeva, 2002). Cependant les ARNm présentant des structures secondaires dans leur région 5’UTR sont déroulés au préalable au recrutement du complexe de pré-initiation 43S. L’activité hélicase ATP-dépendante du facteur eIF4A assure le dépliement de ces structures secondaires présentes sur la région 5’UTR de l’ARNm (Hinnebusch, 2014). L’efficacité de cette hélicase est potentialisée par les facteurs d’initiation se liant à l’ARN comme eIF4B et eIF4G (Figure 4). Cette efficacité peut être également stimulée par la protéine eIF4H homologue d’eIF4B (Rogers et al., 2001; Rozovsky et al., 2008).

Balayage ou «scanning» de la région 5’UTR

Une fois formé, le complexe d’initiation 48S doit retrouver le codon initiateur, qui peut se situer à plusieurs centaines de nucléotides en aval de la coiffe. Contrairement aux procaryotes où le codon initiateur est balisé par la séquence “Shine-Dalgarno”, site de fixation du ribosome située à environ 6 à 12 nucléotides en amont du codon initiateur, chez les eucaryotes, la recherche du codon initiateur est assurée par le balayage linéaire de la région 5’UTR de l’ARNm. Ce balayage est permis encore une fois grâce à l’hélicase eIF4A, aidée par les facteurs eIF4G, eIF4B ou eIF4H. D’autres hélicases peuvent être requises pour le balayage des ARNm présentant des régions 5’UTR fortement structurées. Par exemple chez la levure, l’hélicase Ded1 intervient dans l’initiation dans le cas d’ARNm avec une longue région 5’UTR (von der Haar and McCarthy, 2002). Chez les mammifères, les hélicases DDX3, DHX29 et RHA interviennent dans l’initiation dans le cas d’ARNm avec une région 5’UTR fortement structurée (Soto-Rifo et al., 2012). L’initiation se fait lors de la rencontre du complexe d’initiation 48S et d’un codon initiateur dans un contexte favorable.

Reconnaissance du codon initiateur

L’identification du codon initiateur AUG est assurée principalement par antagonisme des facteurs eIF1 et eIF5. En effet, Le facteur eIF5 favorise la dissociation du facteur eIF1 du complexe de pré-initiation 43S et le passage de la sous-unité 40S à une conformation fermée. Une étude a montré que la surexpression d’eIF5 dans des cellules de mammifère altère la fidélité de reconnaissance des codons initiateurs tandis que ce phénomène est rétabli par la surexpression concomitante des facteurs eIF1 et eIF5 (Loughran et al., 2012). Par ailleurs, une étude a montré que le facteur eIF1 est capable de dissocier les ribosomes ayant initié sur de mauvais codons initiateurs (Pisarev et al., 2006). Ces études montrent que le facteur eIF1 est en compétition avec l’appariement codon-anticodon. Une fois le codon initiateur reconnu, il y a accommodation de l’ARNt initiateur dans le site P du ribosome, hydrolyse du GTP en GDP du facteur eIF2 et déplacement des facteurs eIF1 et eIF1A par encombrement stérique. Le déplacement de ces facteurs est favorisé par le facteur eIF5 (Figure 4). Une fois le GTP hydrolysé, eIF2-GDP est relargué car il perd son affinité pour le complexe d’initiation. Il semblerait que le facteur eIF3 participe à la reconnaissance des codons initiateurs via ses sous-unités a, b et J (Chiu et al., 2010).

Les déterminants de la reconnaissance du codon initiateur

Chez les eucaryotes la nature des nucléotides environnants le codon initiateur ont un rôle primordial dans la reconnaissance du codon initiateur. L’importance de chacun des nucléotides entourant le codon initiateur a été déterminée par Marylin Kozak (Kozak, 1986). Selon ces règles, le codon AUG, codon initiateur de loin le plus fréquent, est dans un contexte très favorable à l’initiation lorsqu’il est entouré par la séquence nucléotidique 5’-RCCAUGG-3’, où l’adénosine du codon initiateur représente la position +1 de la phase de lecture et le résidu R en position -3 représente une purine. Cette séquence est souvent appelé “le contexte de Kozak”. Il a été montré que les positions nucléotidiques -3 et +4 sont particulièrement importantes pour l’efficacité d’initiation de la traduction car ils stabilisent les changements conformationnels qui interviennent après l’appariement codon-anticodon. Ces résidus interagissent respectivement avec la sous-unité alpha du facteur eIF2 et l’ARN ribosomique 18S (ARNr) qui forme partiellement le site A et sont en compétition avec la liaison du facteur eIF1 (Pisarev et al., 2006). En cas de contexte défavorable, le complexe d’initiation de la traduction ignore l’AUG et continue le balayage. Eventuellement, l’initiation de la traduction se fera au prochain codon d’initiation AUG dans un contexte favorable. Ce mécanisme basé sur la force du codon d’initiation permet une diversification de l’extrémité N-terminale des protéines synthétisées et une modulation de l’efficacité d’initiation de la traduction.
L’initiation de la traduction peut toutefois s’effectuer au niveau d’autres codons que le codon AUG, à des codons initiateurs dits non-canoniques comme les codons CUG, ACG ou GUG. Cependant, si l’initiation sur ces codons non-canoniques est inefficace, elle est renforcée par la présence du contexte optimal de Kozak, en particulier par une purine dans la position -3 et par un G en position +4.

Arrivée de la sous-unité ribosomique 60S

Après reconnaissance du codon d’initiation, les facteurs d’initiation sont libérés à la suite de l’activité GTP-ase d’eIF5B qui stimule l’hydrolyse du GTP lié à eIF2 et le passage de la sous-unité 40S à une conformation fermée (Pestova et al., 2000). La dissociation des facteurs d’initiation eIF1, eIF2-GDP et eIF5 libère la surface d’interaction de la sous-unité 40S avec la sous-unité 60S. Après hydrolyse du GTP en GDP du facteur eIF5B, ce dernier perd son affinité pour le complexe d’initiation et se dissocie spontanément entrainant avec lui la dissociation du facteur eIF1A. Ce mécanisme permet ensuite la fixation de la grande sous-unité ribosomique 60S pour la constitution du ribosome 80S et le début de l’élongation (Nanda et al., 2013). Cependant, aucune étude ne montre précisément le devenir du facteur eIF3, qui semble rester fixé sur la sous-unité 40S (Figure 4).
Enfin, le facteur eIF2B qui est une GEF (Guanosine nucleotide Exchange Factor) assure l’échange GDP/GTP d’eIF2 afin de régénérer le facteur eIF2-GTP et former un complexe ternaire actif pour le cycle d’initiation suivant (Jackson et al., 2010; Sonenberg and Hinnebusch, 2009).

La terminaison de la traduction et le recyclage des ribosomes chez les eucaryotes

Dès que le ribosome rencontre un codon stop, la terminaison de la traduction est déclenchée. La terminaison de la traduction est un évènement très important dans la synthèse protéique, elle permet non seulement la reconnaissance du codon stop et la libération du polypeptide synthétisé, mais aussi, la dissociation ainsi que le recyclage des sous-unités ribosomiques. On trouve trois codons stop chez les eucaryotes traditionnellement appelés ambre (UAG), ocre (UAA) ou opale (UGA). Le processus de terminaison de la traduction est principalement orchestré par deux facteurs eRF (eucaryotic Release Factors), mais deux autres protéines, ABCE1 (ATP Binding Cassette E1) et PABP ont un rôle important dans ce processus (Tableau III).

Le facteur Upf1

Le facteur Upf1, appelé aussi RENT1 (Regulator of nonsense transcripts 1), est une ARN hélicase ATP dépendante appartenant à la superfamille des hélicases de type I. Ce facteur est relativement bien conservé chez les mammifères avec 48% d’identité de séquence avec la levure et 62% avec la drosophile (Culbertson and Leeds, 2003). Chez les mammifères, le facteur Upf1 interagit à la fois avec les facteurs de terminaison de la traduction eRF1 et eRF3 (Czaplinski et al., 1998), et forment le complexe dit de surveillance qui est impliqué dans la voie de dégradation NMD (Nonsense-mediated mRNA decay). Ce dernier permet la reconnaissance des ARNm contenant un codon stop prématuré et l’enclenchement du processus de dégradation. Ce processus sera plus approfondi dans le chapitre suivant. La région centrale d’Upf1, qui est la plus conservée, contient deux motifs en doigt de zinc riches en cystéine et sept motifs de la famille des hélicases de type I. L’activité hélicase est essentielle à la fonction d’Upf1. En effet, la mutation R844C, qui abolit son activité hélicase, inhibe la NMD dans les cellules de mammifères (Sun et al., 1998). Upf1 possède aussi une activité ATPase dépendante de l’ARN qui réside dans les motifs Ia et II du domaine hélicase (Bhattacharya et al., 2000). La mutation de deux résidus (DE636AA) dans le motif II non seulement supprime son activité ATPase mais aussi son activité hélicase (Bhattacharya et al., 2000). Plus récemment, il a été montre que l’activité ATPase d’Upf1 est nécessaire pour le relargage et le recyclage des facteurs du NMD qui sont fixés sur l’ARNm (Franks et al., 2010). En effet, chez les mutants DE636AA, les facteurs du NMD restent fixés sur des mRNP intermédiaires, partiellement dégradées en 3’, qui s’accumulent dans les P-bodies (Franks et al., 2010). Les séquences N-terminale et C-terminale d’Upf1 contiennent de multiples résidus de serine qui peuvent être phosphorylés par la kinase SMG1 ; cette phosphorylation est une étape indispensable dans le mécanisme du NMD (Yamashita et al., 2001).
En plus de son rôle dans la voie NMD, Upf1 aurait un rôle dans l’efficacité de terminaison de la traduction et dans le recyclage des ribosomes aux codons stop prématurés. Chez la levure, grâce à des expériences étudiant la traduction par profilage de ribosome ou ribosome profiling dans des cellules déplétées en Upf1p, Wu et ses collaborateurs ont constaté que la déplétion d’Upf1 conduit à une terminaison et à un recyclage défectueux au niveau des codons de terminaison normaux de plus de 1500 gènes (Wu et al., Translational Control Meeting 2016, Cold Spring Harbor). Une étude plus ancienne chez la levure a montré que la terminaison de la traduction était moins efficace en l’absence d’Upf1, que l’ARNm soit soumis à la NMD ou non (Keeling et al., 2004). Ainsi, chez la levure, Upf1 augmenterait l’efficacité de terminaison de la traduction indépendamment de la dégradation de l’ARNm. Contrairement à ce qui a été observé dans les cellules de mammifères où Upf1 aurait un rôle inhibiteur sur la terminaison de la traduction (Ivanov et al., 2008). Cette différence pourrait s’expliquer par le fait qu’il existe chez la levure deux homologues à Upf1 humain, Upf1p et Mtt1p (Czaplinski et al., 2000). C’est le facteur Mtt1p qui serait capable de fixer le domaine GTPase d’eRF3 et d’inhiber la terminaison de la traduction chez la levure. Upf1 humain aurait donc acquis au cours de l’évolution les caractéristiques de Mtt1p, ce qui conduirait à une terminaison de la traduction ou un recyclage du ribosome défectueux au niveau des codons de terminaison normaux.

La protéine ABCE1

La protéine ABCE1 (ATP binding cassette E1) est une protéine appartenant à la superfamille des ATP binding cassette. C’est une protéine essentielle et très conservée chez les eucaryotes et les archées (Pisarev et al., 2010). Structuralement, le domaine N-terminal d’ABCE1 contient deux domaines avec des groupements fer-soufre (Fe-S) suivis par deux domaines NBD pour Nucleotide Binding Domain (Becker et al., 2012; Karcher et al., 2008). Chez les eucaryotes, ABCE1 joue un rôle important dans différent processus cellulaires notamment la division cellulaire. Il a été montré que la suppression d’ABCE1 dans les cellules tumorales humaines HEK293 inhibe la prolifération cellulaire. Dans cette même étude, il a été montré que ABCE1 co-immunoprécipite avec les facteurs d’initiation de la traduction eIF2 et eIF5. Ces résultats suggèrent qu’ABCE1 serait impliqué dans l’assemblage du complexe d’initiation de la traduction (Chen et al., 2006). L’implication d’ABCE1 dans la terminaison de la traduction et le recyclage des ribosomes a été montrée par son interaction avec le facteur de terminaison de la traduction eRF1 (Barthelme et al., 2011). La déplétion du facteur ABCE1 induit une altération de la reconnaissance des codons stop (Khoshnevis et al., 2010). De plus, il a été montré que le facteur ABCE1 joue un rôle clé dans le processus de recyclage des ribosomes (Pisarev et al., 2010) de façon ATP dépendante (Dever and Green, 2012; Jackson et al., 2012).

Le mécanisme de terminaison de la traduction

Chez les eucaryotes, la reconnaissance du codon stop est catalysée par les facteurs de terminaison eRF1 et eRF3 dans le site A du ribosome. Ces deux facteurs interagissent via leur domaine C-terminale et forment un complexe ternaire eRF1-eRF3-GTP dans lequel eRF3 est lié au GTP. Des expériences de déplétion en eRF3a dans différentes lignées de cellules humaines réalisées dans mon équipe, ont montrés qu’eRF1 est dégradé lorsqu’il n’est pas associé à eRF3 (Chauvin et al., 2005). De plus, en utilisant des formes d’eRF3a portant des mutations dans le site de liaison à eRF1, ils ont montrés que le facteur eRF3a était ubiquitinylé et dégradé par le protéasome lorsqu’il n’était pas associé à eRF1 (Chauvin and Jean-Jean, 2008). Ces résultats suggèrent que la formation du complexe de terminaison est contrôlée par des mécanismes de dégradation protéolytique qui permettent à la cellule d’adapter l’abondance de ces facteurs aux taux global de synthèse protéique qui surviennent lors du passage des cellules d’un état quiescent à un état prolifératif. Ces deux facteurs de terminaison fonctionnent de façon coopérative, la protéine eRF1 stabilise la fixation du GTP sur eRF3 et stimule son activité GTP-ase dépendante du ribosome (Mitkevich et al., 2006; Pisareva et al., 2006) et la protéine eRF3, potentialise l’activité de reconnaissance des codons stop (Salas-Marco and Bedwell, 2004) ainsi que l’activité de libération du polypeptide par eRF1 (Alkalaeva et al., 2006).
Ainsi, des lors que le codon stop rentre dans le site A du ribosome, il recrute le complexe eRF1-eRF3-GTP pour former le complexe de pré-terminaison. Il a été montré que la liaison d’eRF3-GTP sur eRF1 entraîne un changement conformationnel des domaines intermédiaire et N-terminal d’eRF1 (Cheng et al., 2009 ; Taylor et al., 20012), ce changement de conformation entraine une augmentation de l’affinité du complexe pour le ribosome se trouvant au niveau d’un codon stop (Fan-Minogue et al, 2008). eRF1 reconnait alors le codon stop et déclenche un changement de conformation du complexe de pré-terminaison, ce qui déclenche l’hydrolyse du GTP du facteur eRF3.

Reconnaissance des codons stop

La caractéristique la plus importante dans ce processus est, tout d’abord, la compaction de l’ARNm et l’accommodation de quatre nucléotides dans le site A du ribosome. Ceci dépend du résidu A1825 de l’ARNr 18S qui interagit avec le nucléotide +2 du codon stop sur lequel vient s’empiler le nucléotide +3. Cette conformation permet aussi l’interaction du nucléotide +4 avec le résidu G626 de l’ARNr 18S qui stabilise l’ARNm (Brown et al., 1990; des Georges et al., 2014). Cette compaction de l’ARNm est très importante dans la reconnaissance du codon stop par l’ARNm (Kryuchkova et al., 2013; Shirokikh et al., 2010). Ensuite, les résidus Asparagine 61 et Lysine 63 du domaine NIKS interagissent avec l’Uracile (nucléotide +1) du codon stop. Il a été montré que l’hydroxylation de la Lysine 63 diminue la translecture et favorise la libération du polypeptide (Feng et al., 2014). L’interaction entre le résidu Gln 55 et le motif YxCxxxF avec les nucléotides +2 et +3 permet de discriminer un codon stop d’un codon sens. La chaine principale de la Cystéine 127 du motif YxCxxxF forme deux liaisons hydrogènes avec le résidu A1825, ce qui le stabilise facilitant l’empilement des deux bases +2 et +3 du codon stop. Ensuite la Glutamine 55 ainsi que la Tyrosine 125 du motif YxCxxxF agissent ensemble pour positionner la chaine latérale du Glutamate permettant son interaction avec le résidu Adénosine de la position +2 ou +3 des codons stop. Ces interactions ne sont possibles qu’avec des résidus purines des bases +2 ou +3 des codons stop, c’est ce qui permet donc la discrimination des autres codons sens (Brown et al., 2016). Le motif GTS situé près de la base +3 du codon stop, peut adopter deux conformations différentes qui sont interdépendantes du motif YxCxxxF. Dans le cas du codon stop UAG, la Thréonine 32 du motif GTS interagit avec la base G de la position +3 du codon stop (Wong et al., 2012). Cependant dans le cas du codon stop UGA, le motif YxCxxxF subit un petit mouvement pour permettre l’accommodation de la Guanosine en position +2 lui permettant de se mettre en face et d’interagir avec la Thréonine 32 du motif GTS (Figure 8).
Il a été montré chez la levure que les mutations des résidus Sérine 33 en Alanine du domaine GTS provoquent une diminution de l’efficacité de terminaison spécifiquement sur le codon UGA in vivo. De plus, les résidus Sérine 33 et 70 interagissent ensembles pour permettre la reconnaissance du codon stop UGA et cette interaction implique une conformation particulière modulé par le motif YxCxxxF. Enfin, il a été montré, dans cette même étude, que le phénotype des souches mutantes Arginine65 et Lysine109 en Alanine, présentent une augmentation de la translecture au niveau des trois codons stop (Blanchet et al., 2015). La combinaison de toutes ces observations permet de dire que tous ces résidus du domaine N-terminal d’eRF1 sont importants dans la reconnaissance du codon stop et la moindre modification de ces résidus perturbe complètement le processus de terminaison (Cheng et al., 2009; Kolosov et al., 2005, 2005; Seit- Nebi, 2002).

Dissociation du complexe de terminaison et recyclage des ribosomes

Dès lors que le polypeptide néosynthétisé est libéré, le processus de recyclage démarre. Au début de cette étape, le ribosome est encore fixé sur l’ARNm avec l’ARNt dans le site P et le facteur eRF1 dans le site A (Figure 9). Cette étape permet la libération des sous-unités ribosomiques ainsi que les facteurs de terminaison qui seront utilisés aux prochains tours de traduction.
Chez les procaryotes, le facteur de terminaison RF3 est impliqué dans la dissociation des facteurs de terminaison (Freistroffer et al., 1997) et dans le recyclage par l’intermédiaire de la protéine RRF pour Ribosome Recycling Factor (Janosi et al., 1996). Chez les eucaryotes, la dissociation et le recyclage sont assurés par un seul facteur ABCE1 (Barthelme et al., 2011). Une étude récente a montré que suite à la libération d’eRF3 du ribosome, le facteur eRF1 reste associé au ribosome et permet le recrutement d’ABCE1. Il a été montré que l’interaction ABCE1-eRF1 est requise pour la dissociation efficace des sous-unités ribosomiques (Pisarev et al., 2007). Le mécanisme par lequel ABCE1 agit dans la dissociation et le recyclage n’est pas encore bien élucidé. La protéine ABCE1 pourrait intervenir soit avant soit après le relargage du polypeptide (Figure 9). Après la libération du polypeptide, la protéine ABCE1 vient alors dissocier la sous-unité 60S qui est relarguée alors que la sous-unité ribosomique 40S et l’ARNt au site P restent fixés sur l’ARNm. ABCE1 fonctionne avec le facteur eIF6 pour dissocier les sous-unités ribosomiques (Pisarev et al., 2010). Le facteur d’initiation eIF6 se fixe sur la sous unité-ribosomique 60S au niveau de son site de fixation à la 40S, et ainsi permet de maintenir les deux sous-unités ribosomiques dissociées (Miluzio et al., 2009; Sanvito et al., 1999). Des études récentes ont montré qu’ABCE1 interagit avec le ribosome via son domaine Fe-S (Barthelme et al., 2011; Becker et al., 2012; Preis et al., 2014; Shoemaker and Green, 2011). L’hydrolyse de l’ATP d’ABCE1 permet un changement de conformation du ribosome qui entraine une déstabilisation de l’ARNt-désaminoacylé du site P (Figure 10), et la dissociation de la sous-unité 60S tandis que la sous-unité 40S et l’ARNt restent associés à l’ARNm.
Ce sont les facteurs d’initiation eIF3, par sa sous unité eIF3j, eIF1 et eIF1A qui sont responsables de dissocier l’ARNt de la sous-unité 40S. La libération de l’ARNt est suivie par la dissociation de l’ARNm de la sous-unité 40S (Pisarev et al., 2010, 2007).

La réinitiation de la traduction chez les eucaryotes

La réinitiation de la traduction est un mécanisme traductionnel qui nécessite la présence d’uORF en amont de la région codante de l’ARNm. La réinitiation après une courte séquence codante a été observée dès la découverte du modèle de balayage de l’ARNm par le ribosome (Kozak, 1987a). Dans cette étude, ils ont montré que l’insertion d’un codon stop quelques nucléotides en aval d’un codon d’initiation induit la réinitiation de traduction au niveau d’un codon d’initiation situé en aval. Environ la moitié des gènes codants des protéines portent des uORF dans la région 5’UTR de l’ARNm (Iacono et al., 2005; Timothy G. Johnstone et al., 2016). La présence de ces uORFs est corrélée avec une réduction de 30% à 80% de l’expression des protéines codées par l’ORF principale (Calvo et al., 2009) et ce en affectant l’efficacité de traduction de la région codante en aval. La présence d’une ou plusieurs uORF en amont de la phase codante de l’ARNm présente une situation spéciale pour le complexe d’initiation qui scanne le 5’UTR de l’ARNm à la recherche du codon initiateur. Lorsque le complexe d’initiation 48S qui scanne le 5’UTR de l’ARNm reconnaît, en amont du codon d’initiation du cadre de lecture principal, un ou plusieurs codons AUG dans un contexte favorable à l’initiation de la traduction, il initie la traduction à leur niveau. Ces codons AUG sont souvent suivis de près par un codon de terminaison et on observe alors la synthèse d’un court polypeptide. Après terminaison de la traduction de cette uORF, certaines sous-unités 40S du ribosome restent associées à l’ARNm, continuent à le scanner à la recherche d’un autre codon initiateur qui peut être ou pas celui du cadre de lecture principal de la protéine. La sous-unité 40S qui a reformé un complexe d’initiation peut donc réinitier la traduction au niveau du prochain codon initiateur se trouvant dans un contexte favorable. Récemment, il a été montré, qu’après terminaison de la traduction d’une petite uORF, l’association du facteur eIF3 peut persister sur la sous-unité 40S, le complexe d’initiation multi-factoriel (complexe ternaire, eIF1, eIF1A et eIF5) rejoint ce complexe et la réinitiation se produit (Asano, 2014). Cependant, l’efficacité de réinitiation dépend de plusieurs paramètres, notamment la taille de l’uORF, la distance qui sépare son codon stop du codon initiateur de l’ORF (Valásek, 2012), la séquence peptidique codée par l’uORF (Rahmani et al., 2009; Roy and von Arnim, 2013; von Arnim et al., 2014) et bien d’autres paramètres qui seront détaillés plus loin.
Récemment, Gunišová et ses collaborateurs ont soumis toutes les uORF de GCN4 à une analyse fine afin d’identifier toutes les séquences cis-régulatrices entourant ces uORF, qui contribuent de manière autonome ou en synergie à l’efficacité globale de réinitiation sur GCN4. Ils ont pu déterminer que, en plus des éléments présents en 5′ de l’uORF1 et l’uORF2, les 12 premiers nucléotides des séquences 3’ des uORF 1 et 3 contiennent un motif conservé AU1-2A/UUAU2 qui favorise la réinitiation de façon autonome. Ils ont également identifié des séquences inhibitrices de la réinitiation dans les régions 3’, immédiatement après les séquences AU riche des uORF2 et uORF3. De plus, dans cette même étude ils ont soulignés la contribution du domaine N-terminal d’eIF3 dans la réinitiation et ont pu constater qu’il y a une corrélation négative entre l’efficacité de réinitiation et l’efficacité de terminaison de la traduction (Gunišová et al., 2016). Les uORF et leurs mécanismes de régulation de la traduction seront plus approfondis dans le prochain chapitre.

Dégradation et surveillance des ARNm eucaryotes

Mécanisme général de dégradation cytoplasmique des ARNm

La dégradation des ARNm a longtemps été considérée comme une simple étape d’élimination des ARNm. Au cours des dernières années, cette vision a été totalement remise en cause. Les temps de demi-vie des ARNm, révélateurs de leur vitesse de dégradation, peuvent varier énormément. Ainsi chez les mammifères, ils varient de 15 minutes (ARNm c-fos) à 24 heures (ARNm de la globine), montrant que la dégradation des ARN est un processus spécifique et non un processus par défaut.
La dégradation des ARNm est essentielle. En l’absence d’une dégradation rapide des ARNm, une régulation rapide de la production de protéines par la seule induction transcriptionnelle serait impossible (Camier and Séraphin, 2007). Les différentes voies de dégradations des ARNm “normaux” (par opposition à aberrants dont nous verrons le processus particulier de dégradation plus loin) sont décrites dans le schéma ci-dessous (Figure 11).
Figure 11 : Les principales voies cytoplasmiques de dégradation des ARNm normaux. L’événement initial le plus fréquent est une désadénylation. Le corps de l’ARNm est ensuite dégradé par une des 2 voies : 5’-3’ ou 3’-5’. Dans le cas de la voie 5-3’, la désadénylation est suivie du clivage de la coiffe par l’enzyme Dcp2/Dcp1 puis d’une digestion exonucléolytique par Xrn1. Dans le cas de la voie 3’-5’, la désadénylation est suivie du recrutement du complexe Ski et d’une digestion exonucléolytique par l’exosome ; la coiffe est finalement dégradée par l’enzyme DcpS. En grisé est représenté une voie plus rare, amorcée par une coupure endonucléolytique de l’ARNm, suivie des voies classiques (Camier and Séraphin, 2007).
Que de précautions pour manipuler les ARNm au laboratoire afin qu’ils ne soient pas immédiatement dégradés par les ribonucléases ! Et pourtant, dans les cellules les ARN côtoient de nombreuses nucléases. Dans la cellule, plusieurs facteurs contribuent à la protection des ARNm contre l’action des ribonucléases. Lors de sa synthèse, l’ARNm subit des modifications à ses extrémités 5’ et 3’ : ajouts d’une coiffe et d’une queue poly(A). Ces marques, liées par des protéines spécifiques, les cap-binding protein (CBP) et Poly(A)-binding protein (PABP), le protègent de l’action des exoribonucléases (Shatkin and Manley, 2000). L’ARNm est également associé à d’autres protéines au sein de larges particules ribonucléoprotéiques (mRNP) qui notamment le protègent des coupures endonucléolytiques non spécifiques. La dégradation d’un ARNm résulte d’un profond remaniement de la mRNP, déclenché par des signaux spécifiques conduisant au recrutement des enzymes et activateurs de la dégradation.

La désadénylation

La dégradation cytoplasmique des ARNm chez les eucaryotes débute, le plus souvent, par un raccourcissement de la queue poly(A), on parle de désadénylation. Cette étape détermine en grande partie la vitesse de dégradation de l’ARNm. Deux complexes protéiques cytoplasmiques (très conservés chez les eucaryotes) possèdent une activité de désadénylation :
– le complexe Pan2-Pan3, activé par la PABP associée à la queue poly(A). Il semble intervenir lors d’une étape initiale de désadénylation rapide (Brown and Sachs, 1998; Yamashita et al., 2005).
– le complexe Ccr4-Caf1-Not, majoritaire chez les mammifères, la drosophile et la levure, inhibé par la PABP. Il contient 2 exonucléases, Ccr4 et Caf1 (Bianchin et al., 2005; Daugeron et al., 2001; Finoux and Séraphin, 2006; Tucker et al., 2002).
L’étape de désadénylation n’inactive pas définitivement l’ARN, celui-ci peut éventuellement être polyadénylé à nouveau ou, dans certains cas, stabilisé par des protéines spécifiques (chez les métazoaires). Cependant le plus souvent, lorsqu’un certain nombre de résidus A restant sur l’ARNm est atteint, de l’ordre de 10 chez la levure ou 30-60 chez les mammifères, l’ARNm s’engage dans une dégradation rapide et irréversible.
Deux voies sont possibles pour la seconde étape : la voie 5’-3’ ou la voie 3’-5’, selon le sens de dégradation.

Les voies exonucléasiques 5’-3’ et 3’-5’

Dans la voie 5’-3’, après désadénylation, la mRNP subit un remodelage conduisant au recrutement et à l’activation de l’enzyme de clivage de la coiffe en 5’ formée par le complexe Dcp1/Dcp2 (decapping proteins 1et 2), c’est une étape irréversible (Cougot et al., 2004; Simon et al., 2006). L’ARN clivé est ensuite dégradé de façon processive par l’exonucléase Xrn1 dans le sens 5’-3’. Dans la voie 3’-5’, la désadénylation est suivie du recrutement d’un complexe exonucléolytique appelé exosome, via l’association des protéines Ski. L’exosome est un complexe d’une dizaine de sous-unités catalysant une digestion de 3’-5’. Il possède un cœur de neuf exoribonucléases 3’-5’ associées à d’autres protéines nécessaires à son activité nucléaire et cytoplasmique (Büttner et al., 2006; Dziembowski et al., 2007; Mitchell et al., 1997). La voie 3’-5’ se termine avec l’hydrolyse de la coiffe par l’enzyme DcpS. Cette même enzyme hydrolyse également la coiffe libérée lors de la dégradation 5’-3’ (Liu et al., 2002; van Dijk et al., 2003).

Coupures endonucléolytiques

Dans certains cas, la dégradation peut être amorcée par une coupure endonucléolytique, qui donne naissance à 2 fragments d’ARN : un fragment 5’ coiffé et dépourvu de queue poly(A), pris en charge par l’exosome, et un fragment 3’ sans coiffe pris en charge par l’exonucléase Xrn1. Les endonucléases impliquées restent cependant mal connues (pour revue Camier and Séraphin, 2007).

Sites cytoplasmique de la dégradation des ARNm

De nombreuses études ont mis en évidence l’existence de sites (ou foci) d’accumulation de protéines impliquées dans le métabolisme des ARNm dans le cytoplasme (Cougot et al., 2004; Eulalio et al., 2007; Parker and Sheth, 2007; van Dijk et al., 2003). Ces sites (appelés P-bodies pour « processing bodies », ou Dcp-bodies pour « decapping bodies ») contiennent en particulier des acteurs de la voie de dégradation 5’-3’ (Dcp2, Dcp1, Xrn1,…). Les enzymes et activateurs de la dégradation ne sont pas uniquement localisés dans ces foci, on les trouve également diffus dans le cytoplasme. Certaines enzymes de dégradation, comme l’exosome ou les désadénylases, semblent être localisées de manière diffuse dans le cytoplasme et absentes des foci (Parker and Sheth, 2007). La proportion de dégradation totale s’effectuant dans les foci cytoplasmiques et la localisation intracellulaire des autres évènements de dégradation restent à déterminer, ce qui pose la question de l’organisation spatiale de la dégradation des ARNm dans les cellules.

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Table des matières

Préambule : la régulation de l’expression des gènes
Introduction
I. l’ARN messager eucaryote 
1. Synthèse et maturation de l’ARN messager
1.1. Maturation de l’extrémité 5’ de l’ARN messager
1.2. Epissage des ARN messagers
1.3. Maturation de l’extrémité 3’ de l’ARN messager
2. Structure de l’ARNm mature eucaryote
II. La traduction chez les eucaryotes 
1. L’initiation
1.1. Les étapes de l’initiation de la traduction dépendante de lacoiffe
1.1.1. Formation du complexe de pré-initiation 43S
1.1.1.1. La formation du complexe ternaire eIF2-GTP-Met-ARNti Met
1.1.1.2. Les facteurs d’assemblage du complexe de pré-initiation 43S
1.1.2. Formation du complexe eIF4F
1.1.3. Formation du complexe d’initiation 48S
1.1.4. Balayage ou “scanning” de la région 5’UTR
1.1.5. Reconnaissance du codon initiateur
1.1.6. Les déterminants de la reconnaissance du codon initiateur
1.1.7. Arrivée de la sous-unité ribosomique 60S
1.2. Le cas du premier tour de traduction
2. L’élongation
3. La terminaison de la traduction et le recyclage des ribosomes chez les eucaryotes
3.1. Les principaux facteurs de terminaison et de recyclage
3.1.1. Le facteur eRF1
3.1.2. Le facteur eRF3
3.1.3. Le facteur Upf1
3.1.4. La protéine ABCE1
3.2. Le mécanisme de terminaison de la traduction
3.2.1. Reconnaissance des codons stop
3.2.2. Translecture des codons stop
3.2.3. Libération de la protéine néo-synthétisée
3.2.4. Dissociation du complexe de terminaison et recyclage des ribosomes
4. La réinitiation de la traduction chez les eucaryotes
III. Dégradation et surveillance des ARNm eucaryotes 
1. Mécanisme général de dégradation cytoplasmique des ARNm
1.1. La désadénylation
1.2. Les voies exonucléasiques 5’-3’et 3’-5’
1.3. Coupures endonucléolytiques
1.4. Sites cytoplasmique de la dégradation des ARNm
2. La surveillance des ARNm et la dégradation des ARNm aberrants
2.1. Les acteurs majeurs de la voie NMD
2.1.1. Les protéines Upf
2.1.2. Les protéines SMG
2.2. Le complexe de Jonction Exon-Exon (EJC)
2.3. Mécanisme de dégradation des transcrits contenant des codons non-sens (NMD)
IV. Régulation de l’initiation de la traduction 
1. Régulation par modulation de l’activité des facteurs d’initiation de traduction
1.1. Régulation par le facteur eIF2
1.2. Régulation par le facteur eIF4E
1.2.1. Régulation d’eIF4E par le facteur 4E-BP et la voie TOR
1.2.2. Régulation par phosphorylation d’eIF4E et la voie MAPK
2. Régulation par les éléments présents sur la région 5’UTR
2. 1. Les mécanismes de régulation de la traduction par les uORF
2.2. Les uORF et la réponse au stress
2.3. Les uORF et la stabilité des ARNm
2.4. Les uORF et les pathologies humaines
3. Les Nouvelle technologie pour étudier les mécanismes de régulation traductionnelle
3.1. Qu’est-ce que le ribosome profiling ?
3.2. Limites du ribosome profiling
3.3. Les biais du ribosome profiling
3.3.1 Le choix de la nucléase
3.3.2. Les empreintes contaminantes
3.3.3. Profondeur de séquençage
Objectif de la thèse
Résultats 
I. Analyse globale de la traduction des cellules déplétées en eRF3 ou Upf1 
1. Stratégie d’étude
2. Mise au point des expériences de ribosome profiling et de RNA-seq
3. Analyse bioinformatique du RNA-seq et du Ribo-seq
4. Analyse d’une première série d’expériences de Ribosome profiling
5. Analyse d’une deuxième série d’expériences de Ribosome profiling
6. Validation des résultats du Ribosome profiling
7. Détection des transcrits exprimés dans les cellules HCT116
8. Identification des uORF fonctionnelles dans les cellules HCT116
9. Analyse de l’effet des facteurs eRF3 et Upf1 sur l’expression des gènes
Article 1 : Involvement of translation termination factor eRF3 and nonsense-mediated mRNA decay factor Upf1 in the translational control of uORFs carrying mRNAs: a genome wide analysis.
II. Effet de la déplétion en Upf1 sur la formation du ribosome 80S 
Discussion 1
1. Identification des uORF dans le traductome des cellules HCT116
2. Usage des codons d’initiation non canoniques par les uORF fonctionnelles
3. Rôles respectifs d’eRF3 et Upf1 dans le contrôle traductionnel par les uORF
4. Déplétion en eRF3 et translecture des codons stop
Bibliographie 

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