Soutenance mémoire
Synthèse bibliographique PPR
Problématique
Sur la base de séquences partielles des gènes N et F, les souches de PPRV ont été classées en quatre lignées génétiquement distinctes (I, II, III et IV) (Banyard et al., 2010; Kwiatek et al., 2011). La proéminence et la forte capacité d’expansion de la lignée II et le remplacement de la lignée I, historiquement présente dans l’Ouest africain est soutenue par des études récentes notamment la thèse de Habib Salami. Il a effectué un état des lieux du PPRV au Sénégal. En effet les foyers de maladie dans cette partie de l’Afrique sont maintenant associés quasi systématiquement à un virus de lignée II. L’analyse d’échantillons pathologiques collectés au cours des différentes épidémies de PPR durant la dernière décennie a révélé la propagation de cette lignée de PPRV (Adombi CM et al., 2017 ; Boussini H et al., 2016; Dundon WG et al., 2014; Dundon WG et al., 2018; El Arbi AS et al., 2014; Woma et al., 2016) dans tous les pays situés entre l’océan Atlantique, le désert du Sahara et l’Afrique subhumide / humide alors que son front de migration se situait au Mali en 1999 (Banyard et al., 2010; Munir et al., 2012).
Cette expansion peut être attribuée à une sélection naturelle donnant aux virus un potentiel épidémiologique plus important, ou être le résultat de l’intensification du mouvement et du commerce des animaux. Des travaux sont en cours dans cette région de l’Afrique pour mieux comprendre les schémas spatio-temporels de la mobilité de l’hôte, facteur amplificateur potentiel de la propagation virale (Apolloni A et al., 2018). En Afrique de l’Est, un scénario similaire a lieu avec la lignée IV, mettant en compétition les lignées autochtones (III et II). Historiquement, les virus de certains pays de l’Afrique de l’Est tels que l’Ethiopie, le Soudan, la Tanzanie appartenaient à la lignée III. Mais cette lignée à progressivement été remplacée au cours des années par la lignée IV du PPRV (Banyard et al., 2010; Cosseddu et al., 2013; Kwiatek et al., 2011; Kwiatek et al., 2007; Muniraju et al., 2014c).
Sur le phénomène de remplacement et d’extinction, aucune explication n’est encore toutefois avancée. Il est évident que plus les séquences sont générées mieux l’évolution des virus et le mouvement transfrontalier d’animaux ayant conduit à la diffusion de la maladie seront compris. Toutefois si les courtes séquences de gènes viraux telles que N et F permettent par analyse phylogénétique une définition en lignées elles semblent avoir un potentiel restreint à permettre la reconstruction des mouvements dans le temps et l’espace des PPRV. Un séquençage de fragments longs du génome, voire du génome entier, s’impose donc.
Hypothèses et questions de recherche
Les ARN polymérases virales des virus à ARN négatifs ont un taux d’erreur de l’ordre de 10-3 à 10-5 nucléotides par cycle lors des réplications. Cette forte capacité à muter pendant la réplication est causée par une absence de la fonction de relecture et de correction d’erreurs de réplication des enzymes virales ARN polymérase ARN-dépendantes. Ce taux rapide de changement évolutif des virus à ARN offre des opportunités particulièrement intéressantes pour étudier les processus épidémiques car leurs dynamiques évolutives ont lieu à des échelles de temps similaires (Pybus and Rambaut, 2009). En effet, la rapidité d’évolution des virus à ARN est telle que les relations phylogénétiques entre les souches peuvent être résolues à partir d’échantillons recueillis à seulement quelques jours d’intervalle (Cottam et al., 2006; Cottam et al., 2008). Au cours de sa thèse qui a porté sur le PPRV au Sénégal, Habib Salami a étudié l’ampleur de la diversité génétique au cours d’infections naturelles des petits ruminants dans un foyer de PPR et l’accumulation de ces mutations dans un circuit de diffusion du PPRV. Il a ainsi établi, grâce à la diversité génétique qu’il a utilisée comme marqueur épidémiologique, les circuits de diffusion des petits ruminants au Sénégal. Pour cela, il s’est basé sur l’étude des séquences courtes et des séquences concaténées de deux gènes. Dans notre étude, nous avons étudié la dynamique évolutive et épidémiologique de souches de PPRV collectées sur le Grand Ouest africain à partir de génomes complets.
Méthodologie Tâche 1.
Cette phase de la thèse a permis de collecter le matériel biologique grâce à un dispositif de surveillance et de diagnostic en partenariat avec le Laboratoire Central Vétérinaire (LCV, Bamako, Mali) ainsi qu’avec la collaboration des services vétérinaires nationaux. Les enquêtes ont été initiées en lien avec les services vétérinaires du Mali alertés par des suspicions de foyers de PPR. Sur les trois années successives du projet, elles ont été réalisées avec recueil des commémoratifs détaillés. Les échantillons mentionnent la date de récolte (mois/année) et la localité et sont accompagnés des commémoratifs d’enquête (espèces, composition des troupeaux, systèmes d’élevage). Les services vétérinaires ont pu informer des liens avec des marchés à bétail ou des routes de transhumance susceptibles d’avoir introduit et diffusé les pathogènes. Les informations recueillies auprès des éleveurs ont permis également de mieux connaitre leurs pratiques en termes d’utilisation de vaccins (PPR).
Les prélèvements contenant des charges de pathogènes importantes (larmes, poumons pour PPR) ont été collectés et maintenus au froid (à 4°C sur glace) pendant la durée des missions de terrain. Tâche 2. Evaluer la diversité génétique de l’agent pathogène incriminé. Au LCV de Bamako, les aliquots des échantillons récoltés ont été conservés à -80°C et l’identification par PCR entreprise directement sur l’échantillon sans passer par l’isolement. Un test multiplex PCR permettant l’identification des agents de la PPR, de la PPCC, de la variole caprine et de la pasteurellose développé à APHL à Vienne en Autriche (Unité de Production et Santé Animale) a été utilisé pour le criblage des prélèvements. Les parties typage et séquençage NGS et isolement ont été réalisées au CIRAD, Montpellier. Les séquences d’une petite portion du gène N du PPRV ont été obtenues pour les échantillons positifs, afin de réaliser une première étude de la diversité génétique dans les régions échantillonnées. Deux méthodes de séquençage de génomes complets, mises au point au CIRAD, ont été utilisées sur une sélection d’échantillons représentatifs de la diversité génétique de la PPRV observée.
Tache 3. Intégration de l’analyse épidémiologique du pathogène. Les études phylogénétiques réalisées à partir des échantillons des foyers de PPR au Mali permettent d’évaluer le risque pour les filières de productions et de proposer des stratégies de contrôle adaptées. Cette dernière phase consiste à confronter les données de séquences aux données épidémiologiques (espèces animales concernées, dates et lieu de prélèvement…), de manière à établir la biodiversité des souches au Mali. La plasticité des génomes dans les prélèvements d’hôtes malades (caprins) permet de mesurer cette biodiversité et également de dater l’apparition de la PPR au Mali. L’obtention de séquences génomiques complètes et leur alignement avec les données accessibles de GenBank ont permis d’ouvrir la voie à des études de phylogénie (analyse par maximum de vraisemblance ou maximum de parcimonie), des études de datation moléculaire (inférences bayésiennes et chaines de Markov comme implémentées par exemple dans le programme BEAST) et de phylogéographie. Les arbres phylogénétiques ont permis d’évaluer le nombre de groupes de souches circulant au Mali. L’intégration à ces analyses des informations des souches des pays de l’Afrique de l’Ouest permettent une meilleure compréhension des mécanismes de diffusion et à terme d’affiner les stratégies de lutte.
La pathogénie
La pathogénie du PPRV est très peu connue, la plupart des connaissances obtenues sont basées sur la comparaison avec d’autres virus du genre Morbillivirus comme CDV, RPV et MV. La voie principale d’infection du PPRV est la voie respiratoire comme tous les morbillivirus. Dans le cas de MV, il a longtemps été pensé que la première étape de l’infection et la réplication primaire du virus dans les cellules épithéliales de la voie respiratoire étaient suivies d’une seconde amplification dans les tissues lymphoïdes puis une dissémination dans tout l’organisme. L’identification de la molécule d’activation de signalisation lymphocytaire (CD150 ou SLAM) (une protéine exprimée à la surface des cellules dendritique ou des lymphocytes mais pas des cellules épithéliales) comme le principal récepteur des morbillivirus a permis de mieux comprendre le modèle d’infection de l’hôte par MV (Adombi et al., 2011; Baron, 2005; Barrett et al., 1993; Meng et al., 2011; Pawar et al., 2008; Tatsuo H et al., 2000; Yanagi et al., 2006). Cette découverte suggère fortement que MV pénètre dans son hôte au niveau alvéolaire en infectant les macrophages et les cellules dendritiques qui vont ensuite transporter le virus dans le tissu lymphoïde associée aux muqueuses (BALT pour bronchus-associated lymphoid tissue et dans les ganglions lymphatiques trachéo-bronchiques).
Cette infection se traduit par une amplification locale du virus et sa dissémination systémique à partir des lymphocytes CD150+ infectés. Cependant, les morbillivirus ne sont pas seulement lymphotropes mais également épithéliotropes. Le PPRV est retrouvé dans différents tissus non lymphoïdes de l’hôte tel que le poumon, le coeur, les reins et même le cerveau comme dans le cas de MV et CDV. Ainsi, tous ces virus utilisent d’autres récepteurs alternatifs exprimés sur la surface des cellules épithéliales ce qui va permettre leur dissémination chez l’hôte. Ce récepteur cellulaire, Nectin-4 ou CD46 a été identifié en 2011 (Mühlebach MD et al., 2011; Noyce RS et al., 2011). Les récepteurs SLAM et Nectin-4 ont des fonctions équivalentes et sont tous les deux impliqués dans la formation de syncytia et la diffusion du virus de cellule à cellule. Pendant les infections à morbillivirus, les aérosols contenant le virus entrent par les voies respiratoires supérieures et ciblent les cellules dendritiques et les macrophages. Ces cellules infectées colonisent les ganglions lymphatiques locaux où le virus peut infecter une nouvelle population de cellules qui expriment le récepteur SLAM. Les lymphocytes infectés disséminent le virus chez l’hôte via le système sanguin et lymphatique périphérique puis les cellules épithéliales respiratoires, gastro-intestinales, urinaires et le système endocrinien via le récepteur épithéliale Nectin-4. Le récepteur Nectin-4 fonctionne alors comme un ‘récepteur de sortie’, permettant l’amplification et la libération du virus via différentes sécrétions. Les deux récepteurs sont donc nécessaires pour la pathogénie complète du virus (Kato et al., 2012 ; Sawatsky B et al., 2012).
Le PPRV, comme tous les autres morbillivirus, est un virus lymphotrope et provoque une immunosuppression chez l’hôte infecté. Cette immunosuppression, même si elle n’est que transitoire, favorise une infection bactérienne secondaire contribuant à aggraver la maladie chez l’animal (Jagtap SP et al., 2012; Rajak KK et al., 2005; Schneider-Schaulies S et al., 2001). Cela est en partie le résultat de la réplication du virus dans les cellules lymphoïdes et de leur destruction (Schobesberger M et al., 2005; Von Messling et al., 2004). Cependant, des études ont montré que cet effet peut aussi être causé par les protéines virales. Il a été montré que l’interaction des deux glycoprotéines virales, H et F, avec la surface des cellules lymphoïdes induit une immunosuppression (Heaney et al., 2002; Schlender J et al., 1996). La protéine N des morbillivirus, à travers ses interactions avec certains récepteurs cellulaires, est impliquée dans l’apoptose et dans l’inhibition des facteurs de réaction inflammatoire de la cellule hôte (Kerdiles YM et al., 2006a; Kerdiles YM et al., 2006b; Laine D et al., 2005; Takayama I et al., 2012). En effet, beaucoup de protéines virales contribuent à la dérégulation de la réponse immunitaire de la cellule hôte. En plus des protéines H, F et N, les deux protéines non-structurales C et V inhibent l’action de l’interféron(Nanda and Baron, 2006; Ohno S et al., 2004; Shafer et al., 2003). Les vaccins ont des effets immunosuppresseurs résiduels et transitoires mais une réponse immunitaire forte et de longue durée s’établit quelques jours après (Baron et al., 2016) vaccination. Dans le cas de RPV, il a été démontré que la lymphopénie est corrélée à la virulence du virus et à la gravité de la maladie qu’il cause (Rey Nores and McCullough, 1997; Wohlsein et al., 1995).
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Table des matières
1 Introduction
1.1 Le contexte
1.2 Problématique
1.3 Hypothèses et questions de recherche
1.4 Objectifs
1.5 Méthodologie
2 Synthèse bibliographique PPR
2.1 Généralité sur la Peste des Petits Ruminants
2.1.1 La peste des petits ruminants
2.1.2 Etendue géographique de la maladie
2.1.3 Le virus de la peste des petits ruminants
2.1.4 Le cycle viral
2.1.5 Les signes cliniques de la maladie – le Pouvoir pathogène
2.1.6 Le diagnostic de la PPR
2.1.7 Epidémiologie, Hôtes et Transmission
2.1.8 Les moyens de traitement et de prévention
2.2 La répartition géographique
2.3 L’élevage et le commerce de petits ruminants au Mali et en Afrique de l’Ouest
2.3.1 L’élevage des petits ruminants
2.3.2 Le flux de commerce des petits ruminants
2.4 Etat des connaissances sur la biologie évolutive de PPRV qui sous-tendent la propagation de la maladie
3 PCR en temps réel asymétrique basé sur le gène M du PPRV pour le diagnostic et la différenciation des lignées du virus
3.1 Introduction
3.2 Matériels et méthodes
3.2.1 Utilisation du gène M du PPRV pour le diagnostic de la PPR
3.2.2 Génotypage du PPRV par analyse de séquence
3.3 Résultats
3.3.1 Génotypage par analyse de séquences
3.3.2 Génotypage par PCR en temps réel asymétrique
3.4 Discussion
4 Etude de la diversité génétique du PPRV au Niger
4.1 Introduction
4.2 First genetic characterization of Peste des Petits Ruminants (PPR) from Niger: On the advancing front of the Asian virus lineage
4.3 Discussion
5 Répartition et diversité génétique du PPRV au Mali et d’autres pays de l’Afrique de l’Ouest
5.1 Introduction
5.2 Matériels et méthodes
5.2.1 La collecte du matériel biologique
5.2.2 Les analyses de laboratoires
5.3 Résultats
5.3.1 Description de foyers
5.3.2 Le profil du test multiplex
5.3.3 Isolement du PPRV
5.3.4 La RT-PCR et le Profil électrophorétique des produits de PCR
5.3.5 Les séquences et l’analyse de l’arbre phylogénétique basé sur 255 nucléotides du gène N 82
5.3.6 Analyse phylogénétique détaillée des souches du Mali
5.4 Discussion
6 Etude génomique de la diversité des souches de PPRV au Mali et dans d’autres pays d’Afrique de l’Ouest
6.1 Introduction
6.2 Matériels et méthodes
6.2.1 Séquençage par amplification aléatoire (SISPA)
6.2.2 Séquençage par amplification spécifique.
6.2.3 Les analyses phylogénétiques et de datations moléculaires à partir des génomes complets et incomplets
6.3 Les résultats
6.3.1 Le séquençage du génome complet par amplification aléatoire (SISPA)
6.3.2 Le séquençage du génome complet par la méthode d’amplifications spécifique
6.3.3 La phylogénie avec les génomes complets et incomplets
6.3.4 Les analyses de datations moléculaires à partir des génomes complets et génomes incomplets
6.4 Discussion
7 Discussion générale – Conclusion Perspective
8 Bibliographie
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