Synthèse bibliographique des connaissances sur les dattes et leur qualité microbiologique

  • Introduction

     Les études traitant de la diversité microbienne des produits traditionnels de façon approfondie restent peu nombreuses voire inexistantes pour certains produits indigènes. C‘est le cas du produit dattier « Btana » préparé exclusivement dans le sud des pays de Maghreb en particulier le sud algérien. Il y en a différentes nomination selon les régions mais le mode de production ne change pas beaucoup.Dans le passé, les populations de la région dépendaient des dattes pour leur nourriture ainsi que pour subvenir à leurs autres besoins par le biais de la commercialisation des dattes dans le cadre du troc (Arditi, 1995). Aujourd‘hui le mode de vie des populations du sud algérien s‘est nettement amélioré grâce aux différents programmes d‘agriculture lancés après l‘indépendance, ce qui a permis la diversification des rations alimentaires et a permis l‘émergence de nouvelles techniques de culture. Néanmoins l‘abandon des pratiques traditionnelles comme la production de Btana dans certaines localités créerait un fossé profond entre les générations anciennes et actuelles qui s‘ajoute aux autres aspects de pertes culturelles (comme le mode d‘irrigation traditionnel « Alfagara », le refroidissement de l‘eau par « Garba »,..).Pour faire une contribution à vulgariser ce patrimoine culturel, notre étude s‘est attachée, d‘une part à caractériser le procédé traditionnel de conservation de dattes « Btana » selon les régions et les techniques utilisées. Cependant, il existe très peu d‘informations sur cette pratique traditionnelle dont la complexité est renforcée par une variabilité de préparation inter et intra-région. Ainsi une démarche de diagnostic participatif a été suivie et choisie comme le seul modèle scientifique valable dans ce genre d‘étude attaché à la sociologie et aux habitudes populaires. Sur le plan microbiologique, il a été question d‘améliorer nos connaissances sur les communautés microbiennes qui constituent une fraction importante de la biodiversité du Btana. Tout d‘abord, nous avons souhaité décrire la complexité de la diversité microbienne et réaliser une synthèse regroupant tous les outils culturaux et moléculaires, récemment développés, permettant l‘isolement et l‘identification des microorganismes, ainsi que les techniques récemment développés comme les séquenceurs de deuxième génération. Ces approches permettront une meilleure caractérisation de la biodiversité microbienne de l‘écosystème du Btana. Sur le plan pratique, une analyse comparative des communautés bactériennes associées à ce produit a été conduite sur des échantillons de Batna préparé selon deux méthodes de préparation (directe et indirecte) dans trois régions géographiques (Adrar (Sali), Elmegiar, Ziban (Orlal, Tolga). En plus, il a été question de tester les effets des paramètres spécifique des échantillons (origine, mode de préparation, âge, pH, aw) sur la variabilité de communauté bactérienne. Les résultats des analyses métagénomiques sont obtenus après optimisation d‘extraction d‘ADN et le pyroséquençage des petits fragments d‘ADN 16s et 26S issus de la flore microbienne présente. Pour s‘approcher davantage à la biodiversité de Btana, il a été nécessaire d‗isoler des souches représentatives et définir leur éventuelles propriétés fonctionnelles (physiologiques et enzymatiques) pour déterminer celles qui auraient des activités importantes dans l‘élaboration des caractéristiques de Btana. A notre connaissance, il n’existe pas d’études relatives à l’isolement et l’identification des germes responsables de cette fermentation. Ce présent travail se propose de combler ce vide pour contribuer à améliorer la connaissance dans la matière et découvrir les facteurs éventuels de maîtrise de la qualité hygiénique et nutritionnelle de cet aliment.Au début, une étude bibliographique présente les connaissances actuelles afin de situer le contexte socio-économique et scientifique dans lequel s‘inscrit le sujet. Cette revue bibliographique comprend trois parties. La première partie décrit des généralités sur la place des produits traditionnels et leurs caractéristiques microbiologiques et chimiques. La deuxième partie bibliographique s‘est consacré à présenter de manière détaillée les connaissances actuelles sur les dattes et leur mode de conservation ainsi que les différentes contributions faites par nombreux chercheurs pour améliorer les conditions de conservation des dattes.Enfin, la troisième partie présente les outils classiques et moléculaires couramment utilisés dans les études des écosystèmes microbiennes ainsi que leurs avantages et limites.Sur le plan expérimental, nous avons effectué des analyses microbiologiques classiques sur des échantillons de Btana pour faire d’abord l’inventaire des microorganismes intervenant dans cette fermentation.
  • Définition des aliments traditionnels:

  La première étape de la compréhension des enjeux liés aux aliments traditionnels est de leur trouver une définition qui les distingue des autres produits à caractère industriel. Les spécialistes ont définit « aliment traditionnel » tout aliment appartenant à une culture particulière et préparé à partir des ressources locales disponibles. Ces aliments ont une signification socioculturelles couvrant tous les aspects liés à leur la production à savoir les techniques d‘acquisition et de transformation, l‘usage, la composition, ainsi que les conséquences nutritionnelles de leur consommation (Kuhnlein et al., 2009) La tendance prédominante dans les marchés agro-industriels révèle un intérêt croissant de la part des consommateurs envers des produits traditionnels ayant leurs racines dans les différentes cultures populaires et perçu comme authentique (Van de Kop et al., 2006). La préférence envers ce qui est typique est, en grande mesure, une réaction face aux changements rapides qu‘entraîne la globalisation. Cependant, si les produits traditionnels d‘origine existent depuis longtemps en tant que réalités historiques, culturelles, économiques et sociales, ce n‘est qu‘au début des 21 siècles que ces produits ont fait une connaissance légale et médiatiques (Kuhnlein et al., 2009). Pour cette raison,l‘appauvrissement du patrimoine culturel lié à la production des aliments traditionnels est devenu une situation urgente qui soulève l‘attention des universitaires et des responsables des politiques (Kwik, 2008). Les scientifiques sont devenus très intéressés par la promotion des produits traditionnels, car ils sont conscients de leur potentiel nutritionnels et fonctionnels. Sur le plan microbiologique, une grande partie des produits traditionnels sont l‘ouvre des microorganismes qui constituent une partie intégrante de ces aliments et dont les caractéristiques finales sont régie par la présence ou non des flores microbiennes particulières.Dans les pages suivantes seront abordés, le rôle des aliments traditionnels dans l‘alimentation de nombreuses populations dans le monde.

  • Histoire et développement de connaissance sur les produits traditionnels:

  Après le séchage, la fermentation est la plus ancienne méthode de conservation des aliments. Elle est devenue populaire avec la succession des générations, car elle ne se limite pas à la conservation des aliments, mais elle permet aussi de fournir différentes variété de goûts, de formes ainsi que d‘autres qualités sensorielles (Smid and Hugenholtz, 2010; Campbell-Plat, 1994)La production d‘aliments fermentés a débuté comme un processus naturel dans lequel les aliments disponibles ainsi que les conditions environnementales régnant ont permis la sélection des microorganismes particuliers qui ont modifié et conservé les aliments. Pendant les Moyens-Âges, les variétés des aliments et boissons fermentés dépendaient principalement des matières premières existantes et des goûts et des préférences des populations locales (Tou et al., 2007).Les populations se sont familiarisées avec ces produits fabriqués dans leur région et certains de ces produits sont devenus une partie intégrante essentielle de leur régime et habitude alimentaire. Ce savoir faire lié à la conservation des aliments a été propagé oralement loin de son lieu d‘origine d‘une région à une autre par le biais de la migration et les différentes épisodes de conquêtes et de guerres (Prajapati and Nair, 2008). Les produits traditionnels jouaient un rôle social spectaculaire durant les mariages, nomination et sevrage des nouveaux nés, et durant les festivités et les prières spirituelles (Hounhouigan et al., 1993). D‘autre part, la fermentation des produits alimentaires assure un moyen naturel de gestion des stocks des familles et facilite le transport des nourritures pour les paysans nomades (Simango, 1997).D‘autre part, les produits fermentés sont une source des nutriments importants, en particulier pour les protéines, les acides aminés, et les facteurs de croissances. Ces attributs étaient certainement méconnus par les anciennes générations qui en ont tiré profits pendant longtemps sans le savoir (Smid and Hugenholtz, 2010). Avec le temps, les gens ont appris les attribues thérapeutiques et nutritionnels des aliments fermentés, ce qui a donné une plus grande popularité à ce type de produits (Hounhouigan et al., 1993).Actuellement on qualifie certains produits traditionnels d‘« aliments fonctionnels » dont les attributs ont été mis en évidence par des études approfondies et des projets de recherche très vastes, par conséquence, les connaissances liées à certains produits traditionnels se sont développées et ont même permis d‘en produire à grande échelle commerciale (Hsieh et al., 2008).

La fermentation au service des produits traditionnels :

  La fermentation entraîne des modifications importantes de l‘aliment en ce sens qu‘elle améliore les caractéristiques organoleptiques des denrées alimentaires, leur valeur nutritionnelle et leur qualité sanitaire (Salunkhe et al., 1985 ; Kadam, 1999). De plus, la fermentation augmente la digestibilité des carbohydrates, et la disponibilité des micronutriments et contribue à l‘élimination d‘éléments toxiques et de facteurs antinutritionnels existants dans certains produits végétaux (Prajapati and Nair, 2008).De façon générale, la fermentation, consiste en une transformation de la matière première brute (d‘origine végétale ou animale) à une variété de produits à valeurs ajoutées sous l‘action des microorganismes. Cela montre combien la connaissance de ces acteurs microbiens est primordiale pour comprendre le processus de fermentation mis en place. Le premier pas a été mené par le célèbre microbiologiste français Louis Pasteur dans le 19 siècle, depuis lors, il est considéré comme le père de la fermentation microbienne (Bourdichon et al., 2012).Il existe plusieurs voies de fermentations, dont la fermentation alcoolique, la fermentation lactique, la fermentation butyrique et la fermentation propionique. Les fermentations alcoolique et lactique sont les plus connues et les plus couramment utilisées par les microorganismes. La fermentation alcoolique,principalement réalisée par les levures telle que S. cerevisiae, produit de l‘éthanol et du CO2. La fermentation lactique est réalisée par les bactéries lactiques pour produire principalement de l‘acide lactique et d‘autres métabolites tels que l‘éthanol et le CO2 (Makhloufi, 2011). De façon générale, la fermentation procure différents avantages aux aliments parmi lesquels on cite
1- La conservation et la préservation de l‘aliment via la production des métabolites inhibiteurs comme les acides organiques (acide lactique, acide acétique, acide formique, etacide propionique), éthanol, dioxyde de carbone (CO2), diacetyl, reuterine, bacteriocines. La fermentation est souvent corrélée avec un abaissement de l‘activité de l‘eau ce qui va empêcher le développement microbien (Gaggia
et al., 2011).
2- La fermentation contribue à la sécurité du produit traditionnel par l‘inhibition des microorganismes pathogènes (Adams and Nicolaides, 2008) et l‘élimination des produits toxiques(Ray and Panda, 2007).

3- La fermentation améliore la valeur nutritionnelle et la qualité organoleptique du produit (van Boekel et al. 2010). Dans le temps actuel, on recense de centaines des produits fermentés parmi lesquels on peut citer, le lait fermenté (Dahi, kurut, Lben, fromages, yaourt), les céréales fermentés (Cassava, Gergoush …), fruits (fermented masau ) légumes (Idli, Hawaijar.), poissons (Jeotgal.), viande (salami , nem chua), graines (Maari, Bikalgais, Kantong) et d‘autre produits mixtes qui ne cessent d‘émerger (Jashbhai et al., 2008 ; Parkouda et al., 2010, Thorsen et al., 2011, Compaoré et al., 2013a ; Kpikpi et al., 2009 ; Guan et al., 2011 ; Aidoo et al., 2006 ; Jeyaram et al., 2008 ; Nyanga et al., 2007). La liste des matières premières à partir du quelles les produits fermentés sont fabriqués est très longue. Généralement on admet la classification selon les critères suivants (Dirar, 1993; Iwuoha and Eke, 1996; Steinkraus, 1997; Gadaga et al., 1999):
♦ Selon, les microorganismes impliqués dans la fermentation (levures, moisissures, bactéries)
♦ Selon le type de produit : ex ; boisson, produit céréale, produit laitier
♦ Selon la nature des produits: fruit, céréales, tubercules.
♦ Selon la méthode de préparation: back-slopping, fermentation spontanée, culture starter
♦ Selon la localisation géographique: produit originaire d‘un pays ou région spécifique ; roquefort, …
La préparation des produits traditionnels est toujours faite dans les demeures des particuliers ou sous forme d‘une activité artisanale limitée dans l‘espace. Notons que certains produits traditionnels ont franchit cette barrière est sont maintenant produits à grande échelle (ex : Kimchi). Dans le passé, il n‘y avait pas des donnés fondés sur les produits fermetés ni sur leur impact économique, nutritionnel et sanitaire. Néanmoins, ces derniers années, de nombreux articles et livres sont consacrés à ces produits indigènes et leurs différents impacts sur tous les aspects de la vie de producteurs et de consommateurs (Cagno
et al., 2012, Arroyo-López et al., 2012).

La qualité microbiologique et la diversité microbienne des aliments traditionnels :

  Le constat général montre que les aliments fermentés produits et consommés partout dans le monde ne présentent pas un réel risque sanitaire pour les consommateurs, sauf dans le les pays en voie de développement, où ces produits requièrent une attention particulière du point de vue sanitaire et nécessitent un travail laborieux pour limiter les risques qui accompagnent leur préparation (Ramesh and Montet 2014).Les procédés traditionnels appliqués ne permettent pas toujours d‘obtenir des produits de qualité hygiénique et organoleptique satisfaisante (Tamang, 2005; Jeyaram et al., 2010).En effet certains microorganismes pathogènes sont retrouvés dans ces aliments (Abriouel et al., 2007; Parkouda et al., 2010; Line et al., 2011) car certains germes sont capables de résister au pH acide résultant de la fermentation comme certaines souches acido-tolérantes d‘E. coli entérohémoragique ou de résister à des traitements thermiques par sporulation comme Bacillus cereus (Chen et al., 2009). Les sources de contamination sont multiples. On en cite, l‘utilisation d‘une eau insalubre, les insectes et mouches qui s‘attaquent au produit durant la préparation, la vaisselle et les ustensiles impropres, l‘absence de l‘hygiène corporelle des manipulateurs ainsi que l‘état crasseux des lieux et de l‘atmosphère de travail. De nombreuses études ont démontré que la fermentation spontanée des produits traditionnels ne garantisse pas souvent la qualité du produit désiré. Cette dernière est étroitement liée à la nature des matières premières utilisées de même que leur qualité chimique et microbiologique (Ramesh and Montet 2014).. D‘autre part, l‘usage des substrats naturels et leur microflore associée, ainsi que le potentiel d‘erreurs induites par les préparateurs engagés lors de pratique traditionnelle, aura pour effet une instabilité et variabilité dans la qualité microbiologique de l‘aliment (Bourdichon et al., 2012). La fermentation du produit est spontanée par la participation d‘une culture mixtes des levures, moisissures et bactéries. Certains de ces groupes agissent en parallèle tandis que d‘autre en manière séquentielle avec une alternance des flores dominantes durant la fermentation (Bourdichon et al., 2012). Parmi les autres facteurs dictant la nature de la microflore développée dans les produits traditionnels on peut citer : l‘activité de l‘eau, le pH, la température et la composition de la matrice alimentaire (Blandino et al., 2003). Selon un grand nombre de chercheurs, la fermentation assure elle même la sécurité du produit traditionnel. Elle inhibe la croissance, la survie et la production des toxines pour la majorité des bactéries pathogènes. La présence des acides organiques (particulièrement l‘acide lactique et acétique) issus de la fermentation est le premier responsable de cet effet inhibiteur. L‘inhibition est fonction du microorganisme concerné, de la température, la quantité de la forme dissociée de l‘acide et le pouvoir tampon de l‘aliment qui agit en faveur des microorganismes indésirable (Ramesh and Montet 2014).Un pH inférieur à 4 est suffisant pour inhiber le développement des bactéries pathogènes, mais le taux de contamination dépond de certains éléments dont la quantification est très difficile, comme le niveau de contamination de la matière première ou l‘eau ajoutée durant la préparation et le degré d‘hygiène pratiqué durant la préparation (Adams and Nicolaides, 1997; Nout and Mortarjemi, 1997).

Le pyroséquençage :  

  Après amplification, les microgouttelettes (microréacteurs) sont dissociées, et les microbilles porteuses de l‘ADN largement amplifié sont transférées dans des plaques picotitrées (Picotiterplate : PTP, GS Junior Titanium Picotiterplate kit, Roche) en fibre optique contenant 1,4 million de puits dont le diamètre (40 µm) va permettre de ne récupérer qu‘une seule bille par puits. Différents couches de billes sont successivement déposées dans les puits de PTP fixé sur un support (Bead deposition device, Roche) : des billes contenant les enzymes indispensable au pyroséquençage (ADN polymérase, sulfurylase, luciférase), et des billes permettant de combler le volume de puits (packing beads) pour ne récupérer qu‘une seule bille par puits. La PTP est enfin chargée dans le GS Junior. A l’intérieur de chaque puits, se déroule la réaction de pyroséquençage,  basée sur la détection du pyrophosphate relâché lors de la réaction de polymérisation de l‘ADN. Les nucléotides sont ajoutés les uns après les autres dans un ordre défini. Si le nucléotide ajouté correspond à celui attendu par la polymérase, il est incorporé dans le brin en cours de synthèse (d‘élongation) et libère un Pyrophosphate. Ce dernier sera utilisé par l‘ATP sulfurylase pour générer de l‘ATP. En présence de molécule d‘ATP, la luciférase oxyde la luciférine en oxyluciférine en émettant un signal lumineux. L‘enzyme Apyrase dégrade les nucléotides non adéquats à chaque cycle d‘addition séquentielle des nucléotides. Ainsi, il est possible de réaliser 400 000 réactions de séquençage en parallèle. Le signal lumineux est détecté par une caméra CCD qui permet de capturer les images après addition de chaque nucléotide. L‘analyse des différentes images capturées permet la déduction de la séquence des différents fragments d‟ADN par connaissance de l‘ordre dans lequel les 4 nucléotides sont ajoutés automatiquement. Ceci est traduit en Pyrogramme. Des logiciels bioinformatiques sont ensuite utilisés pour identifier les séquences initiales des différents amplicons d‘extrait d‘ADN.

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Table des matières

Contexte général de l‘étude
Introduction
Synthèse Bibliographique
I-Etude de la diversité des aliments traditionnels
1- Définition des aliments traditionnels
2- La fermentation au service des produits traditionnels
3- Les perspectives de la fermentation en tant que moyen de conservation des aliments
II- La qualité microbiologique et la diversité microbienne des aliments traditionnels 
a- Les majeurs groups microbiens impliqués dans les produits traditionnels fermentés
b- Levures
c- Champignons filamenteux (Moisissures)
III- Synthèse bibliographique des connaissances sur les dattes et leur qualité microbiologique 
1- La valeur nutritionnelle
2- Les enjeux socioéconomiques de la production des dattes en Algérie
3- Facteurs de détérioration de la qualité des dattes
4- La qualité microbiologique des dattes
a- Études de la diversité microbienne des dattes :
b- Les microorganismes impliqués dans la détérioration des dattes
5- Techniques de conservation des dattes
a- Traitement thermique:
b- Stockage à froid
c- Fumigation
6- Essais d‘amélioration des conditions de conservation des dattes
7- Les méthodes de conservation traditionnelles des dattes 
– Bajou
– Khabia
– Btana
Méthode directe
Méthode indirecte
IV- Outil de l‘étude de la biodiversité microbienne des produits traditionnels 
1- L‘approche culturale
1-1 Limites des méthodes de culture classique
1-2 Stratégies innovantes d‘enrichissement et d‘isolement

2- Méthodes de culture indépendantes pour palier les limites des approches culturales
2-1 Méthodes basées sur l‘amplification PCR
2-2 L‘amplification aléatoire d’ADN polymorphe (Random Amplified Polymorphic DNA ou RAPD)
2-3 Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (Restriction fragment length polymorphism (RFLP )
2-4 l‘Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA)
2-5 Analyse de l‘espace intergéniques ribosomales (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis : RISA) :
2-6 La technique d‘électrophorèse sur gel du gradient de dénaturation (Denaturating Gradient Gel Electrophoresis –DGGE- )
2-7 La TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)
2-8 Le Polymorphisme de conformation des simples brins (Single-Strand Conformation
Polymorphism (SSCP))
3- Les techniques basées sur l‘hybridation.
3-1 La méthode d‘hybridation in-situ par fluorescence (FISH)
4- Les techniques d‘étude de la biodiversité microbienne par séquençage des gènes
4-1 Séquençage de Sanger :
4-2 Technologies de séquençage de seconde génération
V- La mesure de la de biodiversité microbienne :
1- Les estimateurs de richesse spécifique :
2- Les courbes de raréfaction
3- Les indices de diversité :
– L‘indice de Simpson
– L‘indice de diversité de Shannon
– L‘indice de l‘équitabilité J
VI- Limites des approches modernes d‘étude de la biodiversité microbienne 
1- Limites liées à l‘extraction et les procédés d‘optimisation
Matériel et méthodes
1- Description générale du projet de thèse:
2- Matière première de préparation du Btana : 
3- Prélèvement et description des échantillons 
4- Détermination des populations microbiennes
5- Identification des isolats bactériens
6- Identification des isolats de levures et étude de leur profil fermentaire
7- Optimisation de l‘extraction d‘ADN du produit Btana en vue d‘une étude métagenomique de la microflore microbienne

7-1  -Préparation des échantillons de Btana et de l‘extrait cellulaire
7-2 Protocols A: DNeasy plant kit
7-3 Protocols B: CTAB (modifié de Probeski
et al., 1997)
7-4 Protocol C : CTAB-DNeasy
7-5 Purification de l‘extrait d‘ADN
8- Évaluation de l‘efficacité des protocoles d‘extraction d‘ADN
a- Amplification de l‘ADN extrait
b- Électrophorèse du produit de PCR
c- Analyse statistiques des données de l‘extraction d‘ADN
9- Analyse métagenomique de la microflore bactérienne et fongique par la technique de séquençage haut-débit « pyroséquençage »
9-1 Préparation des amorces taguées
9-2 Préparation de la librairie des clones
9-3 Dosage des produits de PCR
9-4 Réalisation des banques et amplification clonale par PCR en émulsion
9-5 Le pyroséquençage
9-6 Traitement des séquences de lectures et analyse des données
– Analyse de la qualité des séquences de lecture (reads).
– Triage
– Enlèvement des bruits de fond (denoising)
– Alignement, groupement des OTUs et affiliation taxonomique des séquences
Resultats et discussion
1- Identification de souches bactériennes isolées du produit traditionnel Btana 
2- Optimisation de l‘extraction d‘ADN à partir du produit dattier Traditionnel Btana
3- Analyse métagenomique de la flore bactérienne associée au produit traditionnel « Btana »
4- Analyse metagenomic de la flore fongique associée au produit traditionnel « Btana » et isolement des levures dominantes 
Discussion génerale
Conclusion générale et perspectives :
Références bibliographiques
ANNEXES

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