Soutenance mémoire
Production des anticorps polyclonaux anti-venins de scorpions Am et Bo chez les chevaux et chez les lapins
Composition du venin du scorpion
Les envenimations par piqûres de scorpions sont caractérisées par l’inoculation du venin. Ce dernier peut être obtenu soit par macération du telson, soit par stimulation manuelle ou électrique de l’animal. Il se présente comme un liquide clair, opalescent, visqueux, thermostable et résistant à la déshydratation (Inceoglu et coll., 2003 ; Kawachi et coll., 2013 ; Ortiz et coll., 2015). Des travaux scientifiques ont montré que le venin de scorpion est de composition variable contenant des molécules très différentes telles que des enzymes (phospholipases et hyaluronidases), des mucopolysaccharides, des neurotransmetteurs, de l’histamine et essentiellement des neurotoxines. Les neurotoxines sont les principales composantes des venins de scorpions responsables des effets toxiques observés après envenimation. La classification de ces toxines est basée sur le type du canal sur lequel elles interagissent. Ainsi elles se fixent spécifiquement avec les canaux ioniques sodium, potassium, chlore et calcium des membranes des cellules excitables. Il existe quatre types de toxines :
• Les toxines actives sur le canal sodium (Na+)
• Les toxines actives sur le canal potassium (K+)
• Les toxines actives sur le canal chlore (Cl-)
• Les toxines actives sur le canal calcium (Ca2+)
Mode d’action du venin de scorpion Les toxines longues agissant sur les canaux Sodium des cellules excitables sont responsables des symptômes de l’envenimation, elles augmentent la perméabilité de la membrane en Na+ entraînant sa dépolarisation intense et une prolongation du potentiel d’action, d’où une modification de la conformation des canaux Ca2+ provoquant une augmentation de sa concentration cytoplasmique suivie d’une libération du contenu de vésicules synaptiques dans la fente synaptique par exocytose (figure 7). De ce fait, les neurotoxines présentes dans le venin sont un puissant activateur du système nerveux autonome engendrant une libération massive des neurotransmetteurs issus des terminaisons nerveuses sympathiques et parasympathiques et des glandes surrénales. Cette décharge est la principale responsable des effets physiopathologiques du venin dont le résultat est une défaillance multi-viscérale des organes, incluant une insuffisance cardiorespiratoire associée à une défaillance neurologique (Martin-Eauclaire et coll., 1995 ; Clot-Faybesse et coll., 1999).
Préparation du gel
D’abord tout le matériel a été désinfecté avec de l’alcool. Sur un support équilibré les plaques en verre sont montées en parallèle avec les espaceurs. L’étanchéité du montage a été vérifiée en faisant couler de l’eau distillée. Le gel de séparation (ou de migration) a été introduit jusqu’aux 2/3 du volume des plaques puis une fine couche d’eau a été ajoutée pour homogénéiser la surface du gel. Le tout est laissé reposer jusqu’à la polymérisation du gel. Nous avons placé ensuite un peigne d’électrophorèse, déposé le gel de concentration (1/3) et laissé polymériser. Juste après sa polymérisation, le peigne est retiré et la cuve d’électrophorèse est remplie avec le tampon de migration pour déposer les échantillons des deux venins des scorpions (Am-Bo) et les marqueurs de poids moléculaires. Après le système élecrophorétique est connecté au générateur,le gel récupéré à la fin de la migration, a été coloré avec le bleu de Coomassie pendant une nuit. Le gel contenant les protéines a été transvasé dans la solution de décoloration, lavé dans plusieurs bains jusqu’à apparition des bandes de protéines. Les composants des gels utilisés sont rassemblés dans le tableau 3.
Analyse élecrophorétique des venins de scorpions Am et Bo et les fractions purifiées
L’analyse électrophorétique sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et dans des conditions réductrices, montre que les protéines de la fraction Am1 et Bo1 ont un poids moléculaire supérieur ou égal à 30 KDa, alors que les protéines de la fraction Am2 et Bo2 possèdent des poids moléculaires inférieurs à 14 KDa (figure 15). En effet, le fractionnement du venin de scorpion Centruroïdes limpidus (Mexique) a donné quatre fractions. Seule la fraction ayant un faible poids moléculaire (4 à 8 KDa) est responsable de la toxicité du venin (Emma et coll., 1999). Des travaux sur le scorpion Occitanus mardochei ont montré également que la fraction toxique à un poids moléculaire de 9,5 kDa et qui est aussi responsable de la toxicité du venin. Quant au venin de scorpion Iurus dufoureius (Turkey), il est composé des protéines ayant des poids moléculaires comprises entre 6.5 et 20 KDa (Ozcan O et coll, 2007). Ces protéines de faible poids moléculaire sont des neurotoxines sont responsables de la quasi-totalité de la toxicité et de la symptomatologie clinique observées lors d’une envenimation scorpionique.
Purification des différents anti-venins de scorpions
Les anti-venins polyclonaux anti-Am et anti-Bo préparés chez le cheval et chez le lapin ont été purifiés par chromatographie sur colonne d’affinité à raison de 1ml pour les fragments F(ab’)2 et 2 ml pour les anti-venins monospécifiques préparés chez le lapin. Après incubation d’une heure, nous avons commencé par éluer la fraction non retenue des anticorps, par la suite la fraction d’anti-venin est éluée par la solution d’acide acétique pH. Les profils chromatographiques montrent la fraction des anticorps éluée (Figures 18, 19, 20, 21). Nous avons calculé le rendement de fixation des anticorps par estimation de la charge en acides aminés aromatiques (D.O à 280 nm) de la fraction non retenue. Les rendements des quatre chromatographies ont montré un pourcentage élevé (supérieur à 90 %) de la fixation des anticorps sur le ligand (venin Am et venin Bo) de la colonne d’immuno-affinité (Tableau 20).
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
I Scorpions
I- Généralités
I- Répartition de scorpions
I– Répartition des scorpions dans le Monde
I– Répartition des scorpions en Afrique et au Maroc
I- Anatomie externe des scorpions
I- Épidémiologie de l’envenimation scorpionique
I– Épidémiologie de l’envenimation scorpionique dans le Monde
I– Épidémiologie de l’envenimation scorpionique au Maroc
II Composition du venin du scorpion
III Mode d’action du venin de scorpion
IV Symptomatologie et grades cliniques de l’envenimation scorpionique
V Traitements
V- Traitements symptomatiques
V- Traitements spécifiques : L’immunothérapie antiscorpionique
MATERIELS & METHODES
PARTIE : Caractérisation biochimique et toxique des venins de scorpions Androctonus mauretanicus (Am) et Buthus occitanus (Bo)
I Matériel biologique
I- Venins
I- Anti-venins
II Méthodes
II- Dosage des protéines
II– Estimation à 80 nm
II– Méthode Bradford
II—a Principe de la méthode
II—b Tampons, solutions et réactifs
II—c Protocole expérimental
II- Fractionnement du venin de scorpion Am et Bo par chromatographie gel de filtration
II– Principe
II– Tampons, solutions et réactifs utilisés
II– Équipement
II– Protocole expérimental
II- Lyophilisation
II– Principe
II– Protocole expérimental
II- Analyse élecrophorétique des venins de scorpions Am et Bo et les fractions purifiées
II– Principe
II– Tampons, solutions et réactifs utilisés
II– Matériel
II– Protocole expérimental
II—a Précipitation des protéines par l’acétone
II—b Préparation du gel
II- Etude de la toxicité du venin de scorpion Androctonus mauretanicus (Am) et Buthus occitanus(Bo)
II– Principe
II– Protocole expérimental
PARTIE : Mise au point d’un Test ELISA bispécifique pour le dosage du venin des scorpions Androctonus mauretanicus et Buthus occitanus chez les patients envenimés
I Production des anticorps polyclonaux anti-venins de scorpions Am et Bo chez les chevaux et chez les lapins
II Purification des différents anti-venins de scorpions Am et Bo par la chromatographie d’affinité
II- Principe
II- Tampons, solutions et réactifs utilisés
II-Équipement
II- Dosage de la concentration en protéines des venins de scorpions Am, Bo et les différents anticorps des lapins (IgG) et chevaux (Fab’)
II- Préparation de la colonne d’immunoaffinité
II- Protocole de purification
III- Mise au point de la méthode ELISA « double Sandwich » : Détermination des conditions optimales
III- Principe
III- Tampons, solutions et réactifs utilisés
III-Équipement
III- Protocole expérimental
III- Evaluation de la sensibilité du test ELISA
RESULTATS & DISCUSSION
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