Structures auto-assemblées de guanines

Etats excités des constituants monomériques de l’ADN en solution aqueuse

               Les mononucléotides sont les chromophores monomériques de l’ADN (cf. Figure I-4). Ils se composent de trois parties : une base (guanine, adénine, cytosine ou thymine), un groupement sucre constitué d’un cycle à 5 atomes (4 atomes de carbone et 1 atome d’oxygène) et un groupement phosphate (PO4-). Le sucre peut adopter différentes conformations. Dans les structures G-quadruplexes, les sucres des guanosines adoptent généralement une conformation C2’-endo. On observe également deux orientations possibles syn et anti de la base par rapport au sucre, selon l’axe définit par la liaison glycosidique. Dans la conformation syn, la base azotée et le sucre pointent du même côté tandis que dans la conformation anti la bases et le sucre ont des directions opposées (Figure I-5). En solution, la durée de vie moyenne des états excités * des nucléotides est très courte (<1 ps) et leur rendement quantique de fluorescence extrêmement faible (de l’ordre de 10-4).32, 36-43 L’absorption et l’émission des photons des constituants monomériques de l’ADN impliquent des transitions 1 ππ* dont les forces d’oscillateur sont élevées. Leur désactivation ultrarapide est attribuée à l’existence de voies de relaxation non-radiative très efficaces impliquant une intersection conique couplant l’état excité émissif 1 ππ* à l’état fondamental (S0). La présence de cette intersection conique est associée à un mouvement intrachromophore à l’état excité.22-23, 25 Dans le cas des purines, comme dGMP et dAMP, il s’agit d’un mouvement de basculement hors du plan aromatique du groupe NH2 en position 2, tandis que dans les pyrimidines comme dTMP et dCMP, il s’agit d’un mouvement de basculement hors du plan du substituant en position C5. Dans le cas de pyrimidines, les études expérimentales et théoriques mettent en évidence l’existence d’une deuxième voie de désactivation non-radiative de la population excitée impliquant le couplage de l’état émissif 1* à un état excité non-émissif de type n*. 44-45 Cette voie supplémentaire de désactivation n’est pas observée dans le cas des purines en solution.20, 40, 46 Parmi elles, dGMP qui est la principale composante des structures G-quadruplexes a fait l’objet de deux études récentes, par absorption transitoire et fluorescence femtosecondes. 40, 46 Contrairement à ce qui est observé pour les autres mononucléotides, les déclins de fluorescence de dGMP dépendent fortement de la longueur d’onde d’émission. Cette dépendance a été attribuée à une surface de potentiel très plate de l’état excité émissif, le long de la coordonnée de réaction (i.e. le mouvement du groupe NH2 en position 2). La figure I-6ci-dessous représente le modèle proposé pour la désactivation des états excités de dGMP dans l’eau, d’après les références 40, 46. Après l’absorption d’un photon, la population excitée diffuse en s’étalant progressivement sur la surface de potentiel de l’état excité, avant atteindre l’intersection conique provoquant ainsi un élargissement du spectre de fluorescence au cours du temps. 46 La conversion interne ultrarapide de l’état excité vers l’état fondamental a lieu via le franchissement de l’intersection conique. L’état fondamental ainsi généré (« état chaud ») possède un excès d’énergie vibrationnelle qui se dissipe vers le solvant en 2 ps

Etats excités à transfert de charge

             Les modèles théoriques qui ne prennent en compte que les interactions électrostatiques (dipôle-dipôle) ne permettent pas de reproduire l’hypochromisme des spectres d’absorption de l’ADN multimère qui est observé expérimentalement. 49, 51, 60 Les interactions de résonnance ou de transfert de charge contribuent aussi à la délocalisation de l’énergie d’excitation et peuvent également modifier la force d’oscillateur des états excités. 61-62 En parallèle de la formation d’excimères ou d’exciplexes, la formation d’états excités à caractère de transfert de charge est un processus souvent invoqué pour expliquer l’allongement de la durée de vie des multimères d’ADN. Ces états se caractérisent par de faibles forces d’oscillateur et des durées de vie radiatives très longues. L’interprétation d’un certain nombre de travaux expérimentaux récents avance l’hypothèse d’un piégeage très rapide des états excitoniques * par des états excités à caractère de transfert de charge proches énergétiquement. 47, 55-56, 58, 63 Plusieurs études théoriques mettent également en évidence la possibilité d’un transfert efficace et rapide des états excitoniques vers des états à caractère de transfert de charge dans différentes séquences d’ADN.

Coefficient d’absorption molaire de G-quadruplexes

                Les coefficients d’absorption molaire des oligonucléotides ne peuvent pas être déterminés de manière classique car ils sont fortement hygroscopiques, ce qui fausse leur pesée. Par contre, le coefficient d’absorption molaire des simples-brins peut être estimé de manière théorique, par la méthode de calcul du plus proche voisin (http://biophysics.idtdna.com/UVSpectrum.html).1 La méthode prend en compte les interactions entre les bases adjacentes. Le spectre d’absorption est obtenu en sommant les spectres d’absorption des sous-unités constituant une séquence. Par exemple pour un simple brin de séquence d(TG3T), il s’agit de la somme des spectres d’absorption de dT terminal, d(TG), d(GG), d(GT) et dT terminal, respectivement. Soulignons que le programme calcule les spectres d’absorption des formes simples-brins dissociées à température ambiante. Les oligonucléotides que nous avons étudiés s’associent à température ambiante, nous avons donc déterminé le spectre des formes dissociées simples-brins à 96°C et approximé leur coefficient d’absorption molaire à celui du spectre calculé à température ambiante.

Anisotropie de fluorescence en régime stationnaire

                Lorsque les molécules sont irradiées par une lumière polarisée linéairement, leur probabilité d’absorption dépend de l’orientation de leur moment de transition d’absorption par rapport à la direction de la polarisation de la lumière excitatrice. Seules les molécules dont l’orientation de leur moment transition d’absorption est proche de la direction de la polarisation de la lumière excitatrice vont absorber les photons. La probabilité d’absorption des molécules est proportionnelle à | | où désigne le moment de transition d’absorption de la molécule et le vecteur unitaire de la direction du champ électrique de la lumière incidente. L’absorption d’une lumière polarisée crée donc une distribution d’orientation anisotrope de molécules à l’état excité. De ce fait, la fluorescence émise par les molécules est également polarisée. Tout changement de direction du moment de transition d’émission, pendant la durée de vie de l’état excité, conduit à une dépolarisation de la fluorescence.

Caractérisation des G-quadruplexes tétramoléculaires : mesure des courbes de fusion

                Nous avons vu au chapitre I que la formation des structures G-quadruplexes s’accompagne d’un hyperchromisme du spectre d’absorption autour de 295 nm. Pour caractériser la formation des quadruplexes, nous avons donc mesuré l’évolution de l’absorbance de l’échantillon à 295 nm en fonction de la température. Pour cela, nous avons enregistré les spectres d’absorption des quadruplexes tétramoléculaires tous les 4°C, avec un gradient de 0.44°C/min, pour la gamme de températures croissantes entre 24°C et 96 °C, puis tous les 10 °C, avec un gradient de 0.55°C/min, pour la gamme de températures décroissantes entre 96 °C et 26 °C. La Figure III-1 représente l’évolution obtenue pour les séquences d(TG3T) en présence de K+. La courbe obtenue s’appelle une courbe de fusion. Elle présente une transition à une température donnée (température de fusion) qui traduit le passage de la forme associée de l’ADN à basse température, à la forme dissociée à haute température. Nous constatons ici que l’absorbance des séquences d(TG3T) à 295 nm diminue de ~35% et atteint une valeur minimum à 64°C lorsque la température croît. Lors de la décroissance de la température, l’absorbance diminue linéairement jusqu’à 26°C. L’allure de ces deux courbes est caractéristique de la formation de structures G-quadruplexes et sont en accord avec la référence 7. Nous pouvons voir que les courbes de montée et de descente en température de la figure III-1 ne sont pas superposables. Ce phénomène est lié à des cinétiques de dénaturation et/ou de renaturation très lentes, par rapport au gradient de température que nous avons utilisé. La réassociation des brins d’ADN en une structure G-quadruplexe tétramoléculaire n’a pas lieu pendant nos mesures. Par conséquent la transition que nous observons ici sur la Figure III-1 ne reflète pas l’équilibre thermodynamique. Il est bien établi que la température de transition entre les formes associées et dissociées des séquences d(TG3T), en présence de Na+ , est proche de la température ambiante.1, 5 Ces séquences qui, à température ambiante, sont pour moitié sous leur forme dissociée n’ont donc pas été étudiées dans le cadre de ma thèse.

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Table des matières

CHAPITRE I : ETAT DE L’ART ET OBJECTIFS 
1 G-QUADRUPLEXES
2 ETATS EXCITÉS DE L’ADN
2.1 Etats excités des constituants monomériques de l’ADN en solution aqueuse
2.2 Etats excités des simples brins et double hélices d’ADN
2.3 Etats excités * délocalisés
2.4 Etats excités à transfert de charge
2.5 Excimères et exciplexes
3 PROPRIÉTÉS PHOTOPHYSIQUES DES STRUCTURES G QUADRUPLEXES DE L’ADN
4 OBJECTIFS
RÉFÉRENCES
CHAPITRE II : MÉTHODOLOGIE
1 PRODUITS
1.1 Solutions tampons
1.2 Oligonucléotides
2 SPECTROSCOPIE D’ABSORPTION STATIONNAIRE
2.1 Dispositif
2.2 Coefficient d’absorption molaire de G-quadruplexes
2.3 Calculs des spectres d’absorption du mélange stœchiométrique de mononucléotides
3 SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENCE STATIONNAIRE
3.1 Dispositif
3.2 Acquisition et traitement des données
3.3 Rendement quantique de fluorescence
3.4 Calculs des spectres de fluorescence stationnaire du mélange stœchiométrique de mononucléotides
4 SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENCE RÉSOLUE EN TEMPS
4.1 Comptage de photons uniques corrélés en temps
4.1.1 Principe
4.1.2 Dispositif
4.2 Génération de somme de fréquences (« up-conversion »)
4.2.1 Principe
4.2.2 Dispositif
4.3 Anisotropie de fluorescence
4.3.1 Anisotropie de fluorescence en régime stationnaire
4.3.2 Anisotropie de fluorescence résolue en temps
4.3.3 Calculs des déclins de fluorescence et de l’anisotropie de fluorescence pour le mélange stœchiométrique de mononucléotides
4.4 Traitement des données et construction des histogrammes
RÉFÉRENCES
CHAPITRE III : PRÉPARATION ET CARACTÉRISATION DES STRUCTURES G-QUADRUPLEXES
1 LES QUADRUPLEXES TÉTRAMOLÉCULAIRES
1.1 Temps de formation des G-quadruplexes tétramoléculaires
1.2 Protocole de formation des G-quadruplexes tétramoléculaires : l’hybridation
1.3 Caractérisation des G-quadruplexes tétramoléculaires : mesure des courbes de fusion
1.4 Caractérisation des G-quadruplexes tétramoléculaires : mesure des spectres de fluorescence stationnaire
1.5 Pourcentage de simples-brins à l’équilibre
2 LES G-QUADRUPLEXES INTRAMOLÉCULAIRES TÉLOMÉRIQUES
2.1 Préparation des G-quadruplexes télomériques
2.2 Caractérisation des G-quadruplexes télomériques : les courbes de fusion
2.3 Pourcentage de simples-brins à l’équilibre
RÉFÉRENCES
CHAPITRE IV : EFFET DE TAILLE SUR LA FLUORESCENCE DES G-QUADRUPLEXES D(TGNT)
RÉFÉRENCES
CHAPITRE V : EFFET DE LA NATURE DU CATION SUR LES PROPRIÉTÉS OPTIQUES DES G-QUADRUPLEXES D(TG4T)4
RÉFÉRENCES
CHAPITRE VI : ETUDE SPECTROSCOPIQUE DES G-QUADRUPLEXES TÉLOMÉRIQUES : D(GGG(TTAGGG)3)
1. COMPARAISON DE TEL21 ET D(TG4T)4 EN PRÉSENCE D’IONS NA+
1.1 Résultats
1.2 Discussion
2. COMPARAISON DES PROPRIÉTÉS PHOTOPHYSIQUES DE TEL21/NA+ ET TEL21/K+
2.1 Résultats
2.2 Discussion
RÉFÉRENCES
CHAPITRE VII : CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

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