Stratégies d’intervention par le programme de la prévention de la TME au Mali

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Cycle de réplication du VIH :

Le VIH est un rétrovirus qui a besoin d’intégrer le noyau de la cellule infectée pour détourner le fonctionnement cellulaire afin d’assurer sa réplication Les glycoprotéines virales (gp120) permettent au virus de s’attacher à la surface de la cellule à infecter: ce sont des leucocytes de type lymphocyte T4. Le génome de ce virus est un ARN simple brin ou monocaténaire. Le virus possède également l’enzyme, la Transcriptase Inverse, qui lui permet de transcrire son ARN en ADN.
Les cellules cibles du VIH sont les lymphocytes T-CD4, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules de Langherans et les cellules de la microglie (Girard PM, et al. 2011).
1. Fixation de la gp 120 au récepteur CD4
2. Fixation d’une boucle variable de la gp 120 au corécepteur et fixation de la gp41 sur la membrane cellulaire.
3. fusion des membranes virales et cellulaires (voir Figure 4).
Le cycle réplicatif comporte plusieurs étapes aboutissant à la formation de nouveaux virions (Rothe M, et al. 1996) .
 Pénétration
La fixation ou attachement à la cellule repose sur une reconnaissance entre les protéines de la surface virale gp120 et les récepteurs CD4 de la cellule cible. Après l’union avec le récepteur CD4, la gp120 change de conformation et est attiré vers un corécepteur devant également être présent à côté de la molécule CD4. (Pancera M, et al.2005)
 Transcription
Les informations génétiques du VIH sont sous forme d’ARN. Pour assurer l’intégration de ce matériel génétique à celui de la cellule il doit y avoir une étape permettant de convertir l’ARN viral en ADN, c’est la transcription. La transcriptase inverse est une enzyme, contenue à l’origine dans la capside virale, qui permet à l’aide des nucléosides contenus dans la cellule de construire un brin d’ADN viral à partir de l’ARN. L’ADN ainsi produit peut être intégré à l’ADN cellulaire, ce qui est la première étape vers la synthèse de nouveaux virus. Une particularité de la transcriptase inverse est de ne pas être fidèle dans sa transcription et de souvent faire des erreurs. C’est la raison pour laquelle le VIH a une très grande variabilité génétique (Stevenson M 2003)
 Intégration
L’ADN linéaire issu de la phase de transcription inverse est transporté dans le noyau de la cellule. Cet ADN est intégré à l’ADN cellulaire grâce à l’action de l’intégrase qui est une enzyme qui “coupe” l’ADN cellulaire et “recolle” cet ADN avec l’ADN virale.
 Synthèse et traduction
La synthèse de nouveaux virus passe d’abord par la création d’un ARN messager qui porte les informations nécessaires à cette synthèse. Cet ARN messager est “lu” par la “machinerie cellulaire”, comme s’il s’agissait d’un plan de construction. La “machinerie cellulaire” produit alors tous les éléments (protéines de la capside, protéase, matrice …) permettant la formation d’un nouveau virus. Cependant ces éléments ne sont pas encore prêts pour l”’assemblage” ils doivent subir une étape de maturation.
 Maturation
Les protéines formées précédemment n’étant pas matures, elles doivent subir l’action d’une enzyme avant “l’assemblage”. Cette enzyme est la Protéase qui est elle même formée dans l’étape de synthèse. Elle permet d’ajuster la structure des protéines en “coupant” les morceaux superflus. L’action de cette enzyme est indispensable pour la création de virus viables. (Stevenson M 2003).
 L’assemblage
Les protéines de structure du virus (matrice, capside et nucléocapside) sont produites sous forme de polyprotéines. Lorsqu’elles sortent de l’appareil de Golgi, les différentes protéines sont liées entre elles. Elles sont transportées vers la membrane où elles rejoignent les glycoprotéines virales membranaires. Les ARN viraux rejoignent les protéines virales. Les protéines de structure s’assemblent pour former la capside et la matrice, englobant cet ensemble (Stevenson M 2003)].
 Le bourgeonnement
La capside sort de la cellule infectée en arrachant une partie de la membrane cellulaire (à laquelle ont été préalablement fixées les protéines virales de surface gp120 et gp41). A la sortie du virion, une protéase virale doit couper les liens qui unissent les différentes protéines de structure (matrice, capside et nucléocapside), pour que les virions soient infectieux (Stevenson M 2003). (Voir figure 3).

Physiopathologie du VIH chez l’enfant

Elle se rapporte à l’évolution de l’infection à VIH en l’absence de toute intervention pouvant retarder la progression vers la maladie. Dans son ensemble, l’infection à VIH de l’enfant n’est guère différente de celle de l’adulte. Le déficit immunitaire sévère aboutit aux mêmes complications infectieuses.(Chakraborty R. 2005).
Il existe deux formes au profil évolutif très différent :
 Forme rapidement évolutive
Elle concerne environ 15 % des enfants infectés et se caractérise par la constitution, en quelques mois, d’un déficit immunitaire sévère qui touche, en général, aussi bien l’immunité cellulaire que l’immunité humorale (Mayaux MJ, et al. 1996). Les premiers symptomes se manifestent chez ces enfants entre 1 et 6 mois. Il s’agit d’adénopathies, de splénomégalie, d’hépatomégalie, de complications infectieuses (pneumopathies, diarrhées, candidoses pharyngées…) voire d’une encéphalopathie à VIH. Le décès survient en règle avant 5 ans car ces enfants sont d’emblée très immunodéprimés.
L’encéphalopathie à VIH survient essentiellement dans cette forme évolutive et est caractérisée par:
 des troubles du maintien postural et une spasticité avec hypertonie pyramidale
 une atteinte des fonctions cognitives
 une dyspraxie buccolinguale.
Elle évolue par paliers vers une aggravation progressive avec microcéphalie. Elle représente un facteur pronostic corrélé au risque d’infection opportuniste. (Tardieu M, et al. 2000).
 Forme lentement évolutive
Chez 80% des enfants infectés, les perturbations immunitaires significatives n’apparaissent qu’après plusieurs années d’évolution (Blanche S, et al. 1997), parfois même après l’âge de 10 ou 15 ans. La symptomatologie clinique peut débuter assez précocement, avant l’âge de 6 mois, sous forme d’une polyadénopathie, avec ou sans hépato splénomégalie, mais ces symptômes restent stables ou même disparaissent pour faire place à une longue période asymptomatique. Les complications infectieuses entrainent la lente dégradation du statut immunitaire. Des infections bactériennes, ORL ou bronchiques, sont observées dans un premier temps puis, lorsque le taux de lymphocytes TCD4+ est effondré, surviennent des infections opportunistes identiques à celles de l’adulte. L’atteinte neurologique ne prend pas la forme de l’encéphalopathie du nourrisson mais correspond plutôt à ce qu’est observé chez l’adulte en situation de déficit immunitaire sévère. La progression en termes de mortalité et de morbidité est similaire à long terme à celle des adultes infectés par le VIH et la survie moyenne est de 95 % à 5ans en l’absence de TARV mais imprécise à plus long terme.

Stratégie de prévention de la transmission mère-enfant

Selon la mise à jour programmatique de l’OMS en 2012 sur l’utilisation des antirétroviraux pour traiter la femme enceinte et prévenir l’infection à VIH chez le nourrisson, l’OMS recommandait de commencer la prophylaxie par ARV au cours de la grossesse, du travail et de l’accouchement ainsi que pendant l’allaitement et sur une période prolongée. Les options recommandées permettent une réduction importante du risque de TME.
L’option A était basée sur une administration quotidienne d’AZT à la mère à partir du troisième trimestre de grossesse et une dose unique de NVP au moment du travail et de l’accouchement. Une prophylaxie à base de NVP était aussi administrée au nourrisson pendant 6 semaines après la naissance, jusqu’à la fin de l’allaitement maternel.
L’option B qui propose une association de trois ARV dès la 14ème semaine de grossesse jusqu’à la naissance de l’enfant. Cette prophylaxie est poursuivie jusqu’à la fin de l’allaitement.
L’option B+ est de préconiser le même schéma à base d’association de trois ARV pour toutes les femmes enceintes infectées par le VIH, mais aussi de continuer ce traitement à vie quel que soit le taux de CD4 (OMS 2014).

Stratégies d’intervention par le programme de la prévention de la TME au Mali.

 Prophylaxie ARV et schémas thérapeutiques dans la prévention de la TME (option B+) .
Protocoles thérapeutiques
 Chez la mère
La conduite à tenir doit prendre en compte plusieurs facteurs:
– L’état clinique et immunologique de la mère
– Le moment auquel elle se présente à la structure de santé par rapport à la date prévue pour l’accouchement
– Les capacités de la structure en matière de traitement antirétroviral (disponibilité des ARV, disponibilité des prescripteurs, accessibilité de la structure de référence)
Schémas thérapeutiques (cf. tableau 1)

Alimentation du nourrisson

Le conseil en alimentation doit se faire à tout moment (avant, pendant la grossesse et après l’accouchement).
Le choix du mode d’alimentation doit être éclairé et se fera entre :
– Un allaitement maternel exclusif jusqu’à 6 mois avec sevrage à 12 mois.
– Une alimentation artificielle si les conditions suivantes sont réunies : alimentation acceptable, faisable, abordable financièrement, durable dans le temps et sûre.
NB : L’alimentation mixte est proscrite
L’aide à l’observance doit être renforcée chez la mère optant pour l’allaitement maternel, surtout si la charge virale est élevée.
Avec l’approche tester et traiter, le diagnostic doit se reposer sur des outils fiables.

LE DIAGNOSTIC DE L’INFECTION CHEZ L’ENFANT

Diagnostic de l’infection

Le diagnostic précoce de l’infection VIH chez le nourrisson exposé est complexe, en raison du passage à travers la barrière placentaire d’anticorps maternels contre le VIH. Dans ces conditions, un résultat positif de la sérologie VIH traduit tout simplement l’exposition du nourrisson et non l’infection. Cette présence d’anticorps maternels chez le nourrisson rend les techniques courantes de diagnostic de l’infection VIH utilisées chez l’adulte sans intérêt.
La cinétique de disparition de ces anticorps est variable. La perte des anticorps maternels se situe pour certains enfants nés de mères séropositives pour le VIH autour de l’âge de 12 mois, et, la plupart de temps, ils ont complètement disparu à l’âge de 18 mois (Palasanthiran P, et al. 1994). Avant l’âge 18 mois, le diagnostic de l’infection VIH ne peut être établi de façon fiable que par des techniques virologiques permettant de mettre en évidence le virus lui-même. Auparavant, ce diagnostic nécessitait un travail intense de culture virale dans des laboratoires sécurisés. A ce jour, deux techniques sont régulièrement utilisées : la Polymerase Chain Reaction (PCR) qui permet d’amplifier et de détecter le matériel génétique du virus dans le plasma (VIH-ARN) ou dans les cellules mononuclées (ADN proviral du VIH) ; la détection de l’antigène ultrasensible p24 qui nécessite juste des équipements minimum dans le laboratoire. Ces techniques peuvent permettre de détecter des enfants infectés par le VIH dès le premier jour de vie (Ngo-Giang-Huong, et al . 2008).

Détection et quantification de l’antigène p24

La détection et la quantification de l’antigène p24 (protéine de la capside virale) sérique se font par technique ELISA. Ce titrage reflète très indirectement la quantité de virus présent dans le sérum, car il quantifie principalement la quantité d’antigène libre et, pour une moindre part, l’antigène associé au virus. Le défaut de sensibilité de l’antigénémie p24 est en partie dû à l’association de cet antigène avec les anticorps correspondants. Les procédures de dissociation des complexes humains sensibilisent la technique et améliorent la quantification de l’antigène p24. Positive dans les dix jours qui suivent la primo-infection. Toute antivénérien p24 doit être contrôlée par neutralisation afin de vérifier la spécificité de la réaction (Le Faou 2012).

Détection des acides nucléiques viraux par amplification génique

Principe de la PCR

La PCR pour réaction de polymérisation en chaine est une technique d’amplification génique in vitro de biologie moléculaire. Elle est utilisée pour amplifier de l’ADN en milliers de copies identiques par une succession de réactions de réplication de la matrice d’ADN (Saiki RK, et al. 1985).La PCR est basée sur le mécanisme de réplication de l’ADN. Elle comprend 3 étapes dont une dénaturation thermique de l’ADN, une hybridation par des amorces oligonuléotides, et une élongation par une enzyme de polymérisation. Chaque réaction emploie deux amorces spécifiques qui bornent la séquence d’intérêt à amplifier, ainsi qu’une sonde de détection. La détection et l’amplification se font de manière simultanée par la détection de la fluorescence engendrée pendant l’amplification grâce informatique couplée à l’appareillage. La détection de la fluorescence utilise des technologies variées selon les systèmes de détection mis en place (Tse C, et al . 2003, Bastard JP, et al. 2002).

La quantification de l’ARN viral plasmatique

La charge virale du VIH peut être mesurée par les techniques de biologie moléculaire utilisant l’amplification de la cible ou l’amplification du signal ou par des techniques biochimiques de quantification de l’activité transcriptase inverse (Mboup S, et al.2015). Il est effectué grâce à des techniques permettant de détecter le matériel génétique viral. La recherche de l’ADN dans les cellules blanches et de l’ARN dans le plasma sont les méthodes moléculaires utilisées pour réaliser le diagnostic de l’infection à VIH chez l’enfant de moins de 18 mois (Cunninghan CK, et al. 1999 : Young M, et al. 2000). Cela permet aussi de clarifier une sérologie douteuse. Plusieurs méthodes ont été mises au point pour amplifier soit une séquence d’ADN, soit une séquence d’ARN. La plus utilisée des méthodes d’amplification sélective est la polymérisation en chaine (PCR).

La détection qualitative de l’ADN

L’ADN proviral des cellules mononuclées sanguines peut être détecté par PCR. Cette technique, utilisée, est plus approprié chez le nouveau-né pour le diagnostic d’une primo-infection indétectable par ELISA du fait de la présence d’anticorps maternels.

Place des DBS dans le diagnostic précoce de l’infection au VIH-1

Le diagnostic précoce du nourrisson est une étape importante pour le traitement des nourrissons infectés par le VIH afin de réduire la morbidité et la mortalité infantiles (Aledort JE, et al. 2006; Stevens W, et al 2008). Le prélèvement de sang sur papier buvard ou papier filtre DBS (Dried Blood Spot) est une approche simple et efficace dans le diagnostic du VIH Les nombreuses difficultés rencontrées au cours des prélèvements et traitements des échantillons veineux sur tube (réalisation du prélèvement chez l’enfant, volume de sang insuffisant, délai de traitement des échantillons de sang veineux, rupture de la chaîne de froid) ont rendu souvent inaccessible le dépistage précoce des enfants avant l’âge de 18 mois. L’utilisation des DBS dans la détection moléculaire de l’ADN et l’ARN du VIH-1, décrite en 1991, constitue une aide précieuse au diagnostic biologique décentralisé. Ainsi, les difficultés liées au transport et à la conservation des prélèvements veineux sur tube ont diminué (Diouara A.A. et al., 2014, Kebe K. et al., 2011)

La méthodologie d’étude

Présentation de l’étude

L’étude porte sur 196 prélèvements fait sur DBS d’enfants nés de mères infectées par le VIH- 1. Ces prélèvements viennent des sites de PTME de Bamako et Ségou Nos travaux se sont déroulés à l’institut national de recherche en santé public (INRSP) de Bamako.(Mali) dans de l’unité de biologie moléculaire au service de Bactériologie Virologie en 2016. Il s’agit d’une étude rétrospective.
Ainsi ce sont 196 prélèvements de DBS qui ont été testés par la technique COBAS®AmpliPrep/TaqMan HIV-1 V2.0 des laboratoires Roche puis avec la technologie m2000 REAL TIME HIV-1 des laboratoires Abbott. Afin de comparer leur sensibilité, leur spécificité ainsi que la concordance. 2.2. La réalisation d’un DBS
Les DBS (Dried Blod Spot) avaient été réalisés dans les sites périphériques à partir de sang du talon pour les enfants de moins de 10Kg ou du bout du doigt pour les enfants de plus de 10 Kg, recueillis sur papier buvard puis séchées et conservées à température ambiante (25° à 30°C) en présence de dessicants et un indicateur d’humidité jusqu’à acheminement vers le site d’analyse (Voir figure 4 ).

La technologie COBAS®AmpliPrep/TaqMan HIV-1 V2.0 de Roche

Principe

 COBAS®AmpliPrep Le système COBAS® AmpliPrep automatise la purification de l’ADN et de l’ARN grâce à la technologie des billes magnétiques (Magnetic Beads). En supprimant les étapes chronophages et sujettes aux erreurs de préparation manuelle. (Manuel d’utilisation COBAS® AmpliPrep, v 2.0, 06-2015.).
COBAS®TaqMan L’analyseur COBAS TaqMan 48 est un système automatisé d’amplification, de détection et de quantification des acides nucléiques utilisant la technologie PCR en temps réel. Cette technologie emploie un dosage basé sur l’activité 5’, 3’ exonucléasique de la Taq polymérase thermostable. L’analyseur COBAS TaqMan 48 utilise deux amorces (une amorce sens qui se fixe sur le brin négatif et l’autre anti-sens qui se fixe au brin positif) nécessaires à l’amplification du produit. La dénaturer à plus 50°C l’ADN cible expose les séquences cibles des gènes (gag et LTR) aux amorces spécifiques. Pendant que le mélange refroidit, les amorces s’hybrident à l’ADN cible. En présence d’ions manganèse (Mn²+) et d’un excès de déoxynucléotides triphosphates (dntps), l’ADN polymérase thermostable de Thermus species allonge les amorces hybridées le long des matrices cibles, ce qui génère une molécule d ADN bicatenaire appelée amplicon. L analyseur COBAS TaqMan 48 répète automatiquement cette opération pendant un nombre défini de cycles, chaque cycle doublant effectivement la quantité d amplicons ADN. La méthode utilise deux sondes fluorescentes doublement marquées par des marqueurs spécifiques : le reporter qui est un fluorochrome qui se situ à l’extrémité 5’ et le quencher qui se place à l’extrémité 3’. Durant l’étape d’élongation le fluorochrome de la sonde se sépare du quencher suite à l’activité exonucléasique dé la Taqplymérase en émettant fluorescence proportionnelle à la séquence amplifiée.

Technique d’extraction, d’amplification et détection (voir annexe 1)

La technologie Real time HIV-1 test des laboratoires Abbott

Principe

L’ADN est extrait avec la plateforme automatique de m2000® instrument.
 Extraction d’acide nucléique
La lyse des particules virales par Tampon de Lyse (identique pour ARN et ADN) se fait par dénaturation des protéines avec le GITC (Guanidine Iso Thio Cyanate), la lyse de la capside virale ou protéines de la membrane cellulaire et l’inactivation des RNAses / DNAses se font grâce au Tween (Détergent) et casse les membranes.
La capture ADN se fait via les micro-particules magnétiques, cette étape est suivit du Lavage des ADN capturés. La chimie ADN utilise des lavages aux sels chaotropiques (tampon de lavage 1 : GITC, Tween,) et des lavages à l’eau (tampon lavage 2 : Eau sans DNase).
L‘élution des ADN purifiés se fait par le tampon élution constitué de 20 mM tampon Phosphate qui crée un détachement compétitif de l’ADN et des ions Fe2+ magnétique.
 Amplification et détection de l’acide nucléique.
Les Tests Real Time Abbott utilise une sonde d’hybridation partiellement double brin . En plus de l’étape d’amplification, il y a une étape supplémentaire de détection qui se fait à 35°C dans chaque cycle de PCR. Pour l’hybridation de la sonde et la lecture, le dosage HIV d’Abbott utilise 2 séries d’amorces; une série spécifique au HIV et une autre spécifique au IC( contrôle interne) . Les amorces d’Abbott sont non-compétitives, le IC est détectable même à des concentrations élevées du VIH. Les amorces du HIV-1 ciblent le gène de l’intégrase dans la région pol. Les amorces IC sont des séquences du gène de citrouille Les sondes spécifiques au HIV et au IC, chacune marqué au fluorophore à leur extrémité 5’ sont utilisée pour détecter les produits amplifiés à chaque cycle.

Différences entre m2000sp/rt et COBAS®AmpliPrep/ COBAS®TaqMan

Le m2000sp/rt a été conçu pour fonctionner sur un système ouvert. Il nécessite également plus de manipulations manuelles de la part du laboratoire avant que les échantillons ne soient chargés sur les t m2000sp et m2000rt que sur le COBAS®AmpliPrep/ COBAS®TaqMan. Par exemple, le m2000sp/rt exige des opérateurs de test qu’ils retirent le DBS des tubes d’échantillon avant que les tubes d’échantillons ne soient chargés sur l’instrument, ce qui n’est pas nécessaire lors de l’utilisation du COBAS®AmpliPrep/ COBAS®TaqMan. Comme le m2000sp/rt est un test de système ouvert, le test pourrait être plus sujet à la contamination croisée de l’échantillon si les opérateurs ne suivent pas les procédures. Cependant, le test m2000sp/rt fournit un point de rupture entre l’extraction de l’acide nucléique et les procédures d’amplification de la cible, ce qui n’est pas fourni par COBAS®AmpliPrep/ COBAS®TaqMan. Ce point de rupture permet aux opérateurs de garder les acides nucléiques extraits et de procéder ultérieurement à une amplification en temps réel en cas de coupure de courant. L’automate m2000sp/rt peut traiter 96 échantillons en l’espace de 8 h, ce qui n’est pas le COBAS®AmpliPrep/ COBAS®TaqMan. Pour l’analyse avec le m2OOOsp/rt on introduit parmi les échantillons les deux contrôles (positif et négatif) ; alors que pour le COBAS®AmpliPrep/ COBAS®TaqMan sur chaque rack d’échantillons on met les deux contrôles (Chang J, et al. 2014).

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Table des matières

PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I: GENERALITES SUR LE VIH
1. Définition et classification des VIH
2. Morphologie et structure
3. Organisation génétique du virus
4. Cycle de réplication du VIH
5. Modes de transmissions
6. Physiopathologie du VIH chez l’enfant
CHAPITRE II : PREVENTION DE LA TME
1. Définition
2. Objectif
3. Stratégie de prévention de la transmission mère-enfant
4. Stratégies d’intervention par le programme de la prévention de la TME au Mali
5. Alimentation du nourrisson
CHAPITRE III : LE DIAGNOSTIC DE L’INFECTION CHEZ L’ENFANT
1. Diagnostic de l’infection
1.1. Détection et quantification de l’antigène p24
1.2. Détection des acides nucléiques viraux par amplification génique
1.2.1. Principe de la PCR
1.2.2. La quantification de l’ARN viral plasmatique
1.2.3. La détection qualitative de l’ADN
2. Place des DBS dans le diagnostic précoce de l’infection au VIH-1
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
CHAPITRE I : JUSTIFICATION OBJECTIFS ET CADRE
I . Justification
2. Objectifs
2.1. Objectif général
2.2. Objectifs spécifiques
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODE
1. Matériel (cf.Annexe 1)
2. La méthodologie d’étude
2.1. Présentation de l’étude
2.2. La réalisation d’un DBS
2.3. La technologie COBAS®AmpliPrep/TaqMan HIV-1 V2.0 de Roche
2.3.1. Principe
2.3.2. Technique d’extraction, d’amplification et détection (voir annexe 1)
2.4. La technologie Real time HIV-1 test des laboratoires Abbott
2.4.1. Principe
3.1. Définitions
3.2. Appreciation des tests
CHAPITRE III : RESULTATS
1. Les caractéristiques sociodémographiques :
2. Analyse des résultats sur les plateformes COBAS®AmpliPrep/TaqMan et m2000rt RealTime HIV
3. Analyse statistique des résultats entre les deux plateformes
CHAPITRE IV : DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES

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