Stimulation des macrophages alvéolaires murins 

Stimulation des macrophages alvéolaires murins 

Protocoles animaux:
Souris et exposition à la fumée de cigarette

Des souris femelles BALB/c âgées de six à huit semaines provenant de Charles River (St-Constant, QC, Canada) ont été utilisées pour ce projet. À leur arrivée, elles pesaient entre 18 et 20 grammes, étaient exposées à la lumière 12 heures par jour (6AM à 6PM) et avaient un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture (moulée). Lors des protocoles d’exposition, les souris étaient exposées à la fumée de 24 cigarettes de recherche 3R4F, sans filtre, deux heures consécutives par jour (AM) dans un système d’exposition de type « whole body exposure » (Promech Lab AB). Certains protocoles d’exposition ont une durée de quatre jours, alors que d’autres ont une durée de plusieurs semaines, à raison de cinq jours d’exposition par semaine.
Toutes les procédures appliquées dans cette étude ont été préalablement approuvées par le comité de protection des animaux de l’Université Laval (CPAUL) (Numéros d’approbation : 2014121-2 et 2017101-1)

Activation de SIRP

Des protocoles visant à explorer l’impact d’une activation de SIRP en contexte tabagique ont été effectués. La protéine de fusion CD47-Fc, qui a été gracieusement fournie par Novartis (Bâle, Suisse), a été administrée de façon systémique. CD47-Fc est un activateur de SIRP qui est composé du domaine extracellulaire du CD47 murin fusionné avec la portion constante d’un IgG1 humain. Cette dernière portion a été conçue de manière à réduire son affinité avec les récepteurs Fc (FcR) retrouvés sur différents types cellulaires tels que les macrophages et les neutrophiles. Les protocoles d’exposition à la fumée de cigarette étaient d’une durée de quatre jours et l’administration du CD47-Fc se faisait quotidiennement de façon intrapéritonéale à raison de 100g/150l/souris, le véhicule étant du « Phosphate35 buffered saline » (PBS). Les souris contrôles recevaient un isotype de type hIgG1, ne comportant pas la portion CD47 (Novartis, Bâle, Suisse), à la même concentration que le CD47-Fc.

Euthanasie des souris et récolte des échantillons

Pour tous les protocoles, les sacrifices avaient lieu le lendemain de la dernière exposition à la fumée de cigarette. Les souris étaient anesthésiées à l’isoflurane, puis euthanasiées par exsanguination. À la suite de l’exsanguination, les poumons, toujours attachés au coeur, étaient retirés de la cage thoracique. Dans certains protocoles, le multi-lobe droit était rapidement congelé à -80C à des fins d’analyses transcriptionnelles ou protéiques, alors que pour d’autres protocoles, la trachée était canulée afin de réaliser des lavages broncho-alvéolaires effectués comme suit : deux lavages de 500 l de PBS froid chacun suivi de trois lavages de 1 ml dans le poumon complet (superlavages). Les cellules immunitaires du lavage broncho-alvéolaire étaient comptées à l’hémacymètre après dilution 1:1 dans du « Turk Blood dilution fluid » (Fisher scientifique, Ottawa, ON, Canada) afin d’éliminer les globules rouges. Le reste du lavage était centrifugé à 800 g à 4C pendant 10 minutes. Le surnageant était ensuite récolté et congelé à -80C pour d’éventuelles analyses, alors que le culot de cellules était remis en suspension dans du PBS pour obtenir une concentration de cellules d’environ 106 cellules/ml. À l’aide de cette suspension, une impaction des cellules sur lame (cytospin) suivie d’une coloration de type Wright-Giemsa (Héma3, Fisher scientifique, Ottawa, ON, Canada) était faite afin de procéder à des comptes cellulaires différentiels. Trois photos de chacune des lames étaient prises au microscope (Nikon eclipse E600) à l’aide du logiciel Q Capture et 300 cellules par lames étaient comptées. La grosseur des macrophages était également analysée à l’aide du logiciel Image J software (v1.44o) en mesurant la circonférence de 30 macrophages choisis de façon aléatoire pour chaque lame.

Culture et stimulation des macrophages alvéolaires murins

Une fois les cytospins réalisés, les superlavages étaient centrifugés pendant 10 minutes à une vitesse de 800 g. Le culot cellulaire était remis en suspension dans 1 ml de PBS et un deuxième compte cellulaire était effectué en ne comptant que les macrophages alvéolaires, distingués visuellement par leur plus grande taille. Les comptes étaient aussi effectués en utilisant du bleu de trypan à 0,4% (Fisher scientifique, Ottawa, ON, Canada) (dilution 1 :1) afin de compter seulement les cellules vivantes. La suspension de cellules était centrifugée de nouveau à 800 g pendant 10 minutes et remise en suspension dans du RPMI 1640 complet (WISENT Inc, Saint-Bruno, Québec, Qc, Canada) contenant 10% de sérum de veau foetal (SVF) (Fisher scientifique, Ottawa, ON, Canada) et 1% d’antibiotiques (pénicilline 10 000 IU/ml et streptomycine 10 000 g/ml) (WISENT Inc, Saint-Bruno, Québec, Qc, Canada), à raison de 50 000 cellules/100 l par puits d’une plaque 96 puits. Des triplicatas étaient effectués pour chaque condition de stimulation lorsque le nombre de cellules le permettait. Une incubation minimale d’une heure à 37C, 5% CO2, était effectuée afin de permettre aux macrophages alvéolaires d’adhérer à la plaque avant de procéder aux stimulations in vitro. Le surnageant de chaque puits était ensuite aspiré et remplacé par 100
l de milieu contenant les divers stimuli. Certains puits étaient incubés avec 1 g/ml de lipopolysaccharide (LPS) (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA), une molécule permettant de mimer une infection bactérienne, alors que d’autres étaient stimulées avec 10 g/ml de « Polyinosinic–polycytidylic acid sodium salt » (POLY (I:C)) (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA), une molécule mimant une infection virale. Les puits servant de contrôles négatifs contenaient seulement les cellules et du RPMI complet. À la suite d’une incubation de 24 heures, le surnageant de culture de chaque puits était récolté et gardé à -80C pour le dosage des cytokines libérées.

Dosage des cytokines

Les deux cytokines pro-inflammatoires IL-1 et TNF- ont été dosées par la technique « Enzyme-linked immunosorbent assay » (ELISA) de type sandwich et à phase solide dans le surnageant des macrophages alvéolaires ayant été stimulés in vitro. Les ELISA ont été faits en utilisant des trousses DuoSet provenant de la compagnie R&D system en suivant les instructions du manufacturier. L’absorbance a été mesurée à l’aide du lecteur de plaque Synergy H1 hybrid reader (BioTeK, Winooski, VT, USA).

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Table des matières

Résumé
Abstract
Table des matières
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Remerciements
Introduction
Le tabagisme
Composantes de la cigarette
Impacts du tabagisme sur la santé pulmonaire
Les impacts du tabagisme à court terme
Les impacts du tabagisme à long terme
La fumée de cigarette et l’immunité pulmonaire
Immunité innée pulmonaire
Rôles des macrophages
Rôles des neutrophiles
Rôles des cellules dendritiques
Immunité adaptative pulmonaire
Le système de régulation SIRP et CD47
Description détaillée de SIRP et CD47
Interaction entre SIRP et CD47
Implications de l’axe SIRP/CD47
Chapitre 1 : hypothèses et objectifs
1.1. Pertinence de l’étude
1.2. But du projet
1.3. Hypothèses 
1.4. Objectifs du projet 
Chapitre 2 : méthodologie 
2.1. Protocoles animaux
2.1.1. Souris et exposition à la fumée de cigarette
2.1.2. Activation de SIRP
2.2. Euthanasie des souris et récolte des échantillons
2.3. Culture et stimulation des macrophages alvéolaires murins 
2.4. Dosage des cytokines 
2.5. PCR quantitatif
2.5.1. Extraction d’ARN et transcriptase inverse
2.5.2. RT-qPCR
2.6. Cytométrie en flux 
2.6.1. Récolte et digestion
2.6.2. Marquage extracellulaire
2.7. Analyses statistiques
Chapitre 3 : résultats
3.1. Caractérisation des niveaux pulmonaires de SIRP et de CD47 en contexte tabagique
3.1.1. L’exposition à la fumée de cigarette module les niveaux d’ARNm de SIRP et de CD47 dans le poumon
3.1.2. Une exposition de quatre jours à la fumée de cigarette affecte les niveaux protéiques de SIRP chez différents types cellulaires présents dans le poumon et le lavage broncho-alvéolaire
3.2. Investigation de l’impact d’une activation de SIRP sur l’inflammation pulmonaire induite par la fumée de cigarette
3.2.1. L’Activation de SIRP, par l’administration systémique de la protéine de fusion CD47-Fc, entraine une diminution de l’inflammation pulmonaire induite par la fumée de cigarette
3.3. Investigation de la capacité de liaison de la protéine de fusion CD47-Fc aux différents types cellulaires de l’environnement pulmonaire en contexte tabagique
3.3.1. L’exposition à la fumée de cigarette pendant quatre jours semble altérer la liaison du CD47-Fc aux différents types cellulaires du poumon et du lavage bronchoalvéolaire.
Chapitre 4 : discussion 
4.1. Forces et limites de l’étude 
4.2. Perspectives 
Conclusion 
Bibliographie
Annexe

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