Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)

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Ethnobotanique de la plante

Les racines du xerochlamy bojeriana, même utilité que le fruit de tapia, sont des ingrédients à la fabrication du « toakagasy ». Son écorce et ses racines sont pilées, puis mélangées aux fibres obtenues des cocons du « landibe » afin de les teinter et de leur offrir plus de résistance [2][3]. Au point de vue thérapeutique, les Malagasy utilisent cette plante pour guérir la maladie des cochons. Le décocté des parties aériennes est administré en boissons dans le traitement de la syphilis secondaire. Autrefois d’après le « tantaran’ny Andriana », des petits fragments de la plante étaient inclus dans la peau pendant une sacrification. C’était le « tetika amin’ny Hatsikana ». Cette pratique était censée protéger des maladies [2][3][4].

Etude antérieure du genre Xerochlamys

Les études chimiques du leptolaena pauciflora Baker, leptolena diospyroidea Cacavo et sarcolaena multiflora ont montré la présence de polyphénols comme les acides phénoliques, les tanins, les leucoanthocyanes et les flavonoïdes. Par contre l’absence d’alcaloïdes, des quinones et des saponines est notée.
La composition chimique des feuilles de ces 3 espèces de SARCOLAENACEAE est assez analogue, surtout en ce qui concerne les polyphénols. Les acides phénoliques sont sensiblement les mêmes : acides p-hydroxybenzoïque 1, vanillique 2, gentisique 3, gallique 4, syringique 5 d’une part et acides p-coumarique 6 et caféique 7 d’autre part. Signalons cependant que l’acide syringique n’a été trouvé que chez leptolaena pauciflora et que, chez cette espèce, il n’y a que des traces d’acide gallique. Les flavonoïdes isolés de ces plantes sont similaires. Par contre, ils sont moins abondants chez Sarcolaena multilora que chez les Leptolaena. Les génines sont toutes de la série des flavonols: kaempférol 8, quercétol 9 et surtout myricétol 10 [7].

Etudes biologiques

– Du point de vue pharmaceutique, les feuilles du leptolaena pauciflora sont douées d’une certaine toxicité. Des essais de toxicité par voie intrapéritonéale chez la souris montrent un résultat concluant : 100 % de mortalité en 24 h pour une dose de 20 g/Kg et 100% en 48 h pour 5 g/kg.
– Du point de vue physiologique, la leptolaena diospyroida est une plante peu toxique. Chez la souris, par voie intrapéritonéale, avec une dose de 5 g/Kg, il y a 80 % de morts en 24 h et 100% en 48 h à partir d’un extrait alcoolique (avec l’extrait aqueux, la dose 100% mortelle est voisine de 20 g/kg, ce qui semblerait indiquer que les principes toxiques sont peu solubles dans l’eau). La mort s’accompagne d’hypothermie et d’hypotonie.
– La toxicité du sarcolaena multiflora est plus faible que celle du leptolaena diosporyroidea. A la dose 5 g/kg, par voie intrapéritonéale, la mortalité est de 50% en 24h, elle est 100% pour 20 g/kg. Là aussi, les extraits alcooliques sont, à dose égale, plus toxique que les extraits aqueux [7].

Composés phénoliques

Les polyphénols sont des composés organiques produits du métabolisme secondaire qui sont largement présents dans le règne végétal. Ces dernières décennies, cette classe de molécule attire une grande attention à cause de ses propriétés bénéfiques à la santé des êtres humains quand ils sont utilisés comme régime ou complément alimentaire [8]. Ces composés présentent une grande utilité aux plantes pour se protéger d’effet exogènes délétères grâce à leur capacité d’absorption des UV-B, mais aussi par leurs propriétés antibactériennes et antifongique [9] [10].
Comme leur nom indique, ils sont caractérisés par la présence de plusieurs groupements phénoliques associés en structure plus ou moins complexe généralement de haut masse moléculaire [11].Le terme « phénol » englobe approximativement 10000 composés naturels identifiés [12]. L’élément structural fondamental qui les caractérise est la présence d’au moins un noyau aromatique de 6 carbones. Il est directement lié au moins au groupe hydroxyle (OH) libre ou engagé dans une autre fonction : éther, ester ou hétéroside [13][14]. Selon le squelette de base et le nombre de carbone de la molécule, il y a de nombreux types de composés phénoliques.

Extraction liquide-liquide

C’est une technique pour extraire un ou plusieurs constituants solubles dans une solution par un solvant dans lesquels les corps sont solubles. Cette opération est fréquemment utilisée pour séparer d’un mélange liquide des constituants dont les volatilités sont faibles ou très voisines, ou qui donnent des azéotropes, ou encore qui sont thermo-dégradables.
Pour que l’opération soit réalisable il est nécessaire [23] :
– que les deux phases ne soient pas complètement miscibles .
– que leur masse volumique soit différente .
– qu’il n’existe pas de réactions chimiques entre les divers constituants du mélange.
Après l’évaporation de la solution hydroalcoolique, le résidu sec est récupéré avec 250 ml d’eau tiède (40° C). L’eau est un diluant important pour le procédé d’extraction liquide-liquide avec des solvants extracteurs qui sont non miscibles dans ce dernier. Les solvants extracteurs qui ont été utilisés pendant l’extraction sont : l’hexane, le dichlorométhane et l’acétate d’éthyle.

Tanins et polyphénols

Avant l’utilisation du réactif pour détecter la présence de ces deux composés, dans un bécher, 5 g de l’extrait hydroalcoolique, dissout dans 15 ml d’eau distillée, est chauffée sur une plaque chauffante. Après le chauffage, la solution est filtrée. 4 gouttes de solution de NaCl 10% sont ajoutés dans le filtrat.
Il y a présence de polyphénol lorsqu’il y a formation d’un précipité après l’addition de gélatine 1%. L’apparition d’un précipité après l’ajout de gélatine salée marque la présence des tanins. Pour déterminer la présence du tanin condensé ou tanins hydrolysables, il faut ajouter 4 à 5 gouttes de FeCl3 10% (dans MeOH) dans le filtrat. La coloration bleu-vert de la solution marque la présence de tanins condensés et la coloration noire bleuâtre marque la présence de tanins hydrolysables.

Quinones

Le screening est commencé par l’évaporation de la solution hydroalcoolique de la plante pour obtenir environ 5 g de résidu. Ce dernier est dissout dans 15 ml d’eau distillée puis filtré. Le filtrat est extrait par un mélange d’éther-chloroforme 3/1 (V/V) ou du benzène dans une petite ampoule à décanter. Après l’ajout de 5 ml de NH4OH dans la phase organique, le changement de coloration de cette solution en rouge violacée marque la présence de quinones.

Stéroïdes et terpènoïdes

La détermination de la présence des stéroïdes et des triterpénoïdes se différencie par des tests de coloration et de fluorescence. Après la dépigmentation de 5 g de l’extrait hydroalcoolique par l’hexane, le mélange a été décanté. Le résidu est dissout dans 10 ml de chloroforme. Pour le séchage de la solution, l’addition de Na2SO4 anhydre dans la solution a été la technique utilisée. Avant le test de coloration, la solution est filtrée puis le filtrat est réparti dans 6 tubes à essais propres et secs.

Chromatographie sur couche mince (CCM)

Une CCM a été réalisée pour déterminer les systèmes d’éluant qui ont été utilisés pendant le fractionnement d’un extrait à la chromatographie sur colonne. La plaque CCM utilisée est constituée de silice 60 F254 de 0,2 mm d’épaisseur fixée sur une feuille d’aluminium.
Avant l’utilisation de la plaque, une ligne de dépôt est tracée à environ 1 cm du bord inferieur et une ligne pour le front d’éluant à 1cm du bord supérieur. L’échantillon de l’extrait a été déposé à l’aide d’un tube capillaire sur la ligne de dépôt. Pour que la cuve soit saturée de l’éluant, ce dernier est versé dans la cuve 10 min avant l’introduction de la plaque. La plaque est déposée verticalement dans la cuve. Lorsque l’éluant touche le front d’éluant, elle est séchée à l’air libre pendant 10 min, puis observé au moyen d’une lampe UV (VL-6LC) aux longueurs d’onde de 254 nm et 265 nm. Après, la plaque est placée dans une cuve à vapeur d’iode pour la révélation.
Chaque tache est caractérisée par sa référence frontale Rf, obtenue par le rapport entre la distance parcourue par le composé (dc) et la distance parcourue par le front d’éluant (de). Rf=𝑑𝑐𝑑𝑒.
Quatre systèmes d’éluant différents ont été réalisés pour la détermination du système d’éluant à utiliser pour le fractionnement à la chromatographie sur colonne de l’extrait acétate d’éthyle :
– Hexane/ AcOEt 80/20 (V/V).
– Hexane/ AcOEt 50/50 (V/V).
– Hexane/AcOEt/MeOH 50/40/10 (V/V/V).
– Hexane/AcOEt/MeOH 50/40/10 (V/V/V).

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Table des matières

INTRODUCTION
I. GENERALITES
I.1 Généralités sur la plante
I.1.1 Famille des SARCOLAENACEAE
I.1.2 Description et répartition géographique du Xerochlamys bojeriana
I.1.3 Position systématique
I.1.4 Ethnobotanique de la plante
I.2 Etude antérieure du genre Xerochlamys
I.2.1 Etude chimique
I.2.2 Etudes biologiques
I.3 Composés phénoliques
I.4 Flavonoïdes
I.4.1 Définition et classification
I.4.2 Activité biologique des flavonoïdes
I.5 Toxicité
I.5.1 Toxicité aigüe
I.5.2 Dose létale 50 (DL50)
II. MATERIELS ET METHODES
II.1 Matériels
II.1.1 Matériel végétal
II.1.1.1 Choix et récolte des plantes
II.1.2 Animaux d’expériences
II.2 Méthodes
II.2.1 Broyage
II.2.2 Extraction
II.2.2.1 Extraction solide-liquide
II.2.2.1.1 Macération
II.2.2.2 Extraction liquide-liquide
II.2.3 Criblage phytochimique
II.2.3.1 Alcaloïdes
II.2.3.2 Flavonoïdes
II.2.3.3 Tanins et polyphénols
II.2.3.4 Quinones
II.2.3.5 Stéroïdes et terpènoïdes
II.2.3.6 Saponines
II.2.3.7 Polysaccharide
II.2.4 Isolement et purification
II.2.4.1 Isolement
II.2.4.1.1 Chromatographie sur couche mince (CCM)
II.2.4.1.2 Chromatographie sur colonne (CC)
II.2.4.1.3 Purification
II.2.5 Spectroscopie
II.2.5.1 Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
II.2.5.1.1 RMN monodimensionnel
II.2.5.1.1.1 Spectroscopie RMN-1H
II.2.5.1.1.2 Spectroscopie RMN-13C
II.2.5.1.2 RMN bidimensionnel
II.2.5.1.2.1 Corrélations mononucléaires
II.2.5.1.2.2 Corrélations Hétéronucléaires
II.2.6 Toxicité aigüe
III. RESULTATS ET DISCUSSIONS
III.1 Résultats de l’extraction
III.1.1 Résultat de l’extraction solide-liquide
III.1.2 Résultat de l’extraction liquide-liquide
III.2 Résultats du criblage phytochimique
III .2.2 Criblage des alcaloïdes
III.2.3 Criblage des Flavonoïdes et Leucoanthocyanes
III.2.4 Criblage des polyphénols et tanins
III.2.5 Criblage des Quinones
III.2.6 Criblages des stéroïdes et terpenoïdes
III.3 Résultat de l’étude du système d’éluant
III.4 Résultat du fractionnement de l’extrait acétate d’éthyle
III.4.1 Groupe G3 : 8 à 17
III.4.2 Groupe G4 : 18 à 19
III.4.3 Groupe G6 :28 à 67
III.5 Résultat de l’isolement et de la purification
III.6 Résultats de l’analyse structurale
III.6.1 Analyse du spectre RMN proton monodimensionnel du P3
III.6.2 Analyse du spectre RMN 13C de P3
III.6.3 Analyse du spectre RMN DEPT 135° du produit P3
III.6.4 Spectre de corrélation HSQC du P3
III.6.5 Spectre de corrélation HMBC
III.7 Résultat de l’étude de la toxicité aigüe
CONCLUSION
REFERENCES
Références bibliographies

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