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Caractères culturaux
E. coli peut être facilement isolé à partir d’échantillons cliniques en utilisant des milieux de culture simples (Mac conckey et EMB). Elle se développe entre 18 à 24 heures à 37°C sur les milieux gélosés en donnant des colonies rondes, lisses, à bords réguliers, de 2 à 3 mm de diamètre, non pigmentées. Sur les milieux lactosés, les colonies sont généralement lactose positif [3, 48].
Caractères biochimiques
E. coli possède un métabolisme respiratoire et fermentaire avec une production de catalase sans production d’oxydase. E. coli possède une nitrate réductase, produit de l’indole à partir de tryptophane, n’utilise pas le citrate comme source de carbone, ne produit pas d’acétoïne ni d’uréase [3, 21].
Caractères antigéniques
Il existe près de 200 antigènes somatiques (O) décrits, près de 60 antigènes flagellaire (H), environ 70 antigènes capsulaires (K) et des antigènes fimbriales (F). Les différents antigènes somatiques, capsulaires et flagellaires permettent de donner les sérotypes de la souche d’E. coli [42].
Epidémiologie
Habitat
E. coli appartient à la flore commensale de l’Homme et de nombreux animaux. C’est une bactérie colonisatrice du tube digestif des animaux à sang chaud. Dans le tractus digestif, elle est localisée au niveau du colon et du cæcum et plus particulièrement dans le mucus recouvrant les cellules épithéliales de la paroi du tube digestif. Via les fèces, E. coli est rejetée dans les eaux environnementales par le biais des effluents, tels que les eaux usées, les lisières ou les déjections des animaux d’élevage et sauvages [13].
Mode de transmission
E. coli peut être transmis par contact direct avec les objets ou surfaces contaminés. La transmission d’une personne à l’autre se fait principalement par voie féco-orale. La transmission à l’homme peut se faire par contact direct avec des animaux contaminés ou un environnement contaminé par leurs excréments. La transmission à l’homme peut s’effectuer par la consommation d’aliments contaminés comme la viande hachée crue ou mal cuite, le lait cru, les salades et les légumes contaminés. Cette transmission se fait également par voie manuportée [13].
Pouvoir pathogène
L’infection urinaire survient généralement suite au passage d’E. coli du tractus intestinal ou du vagin, vers la région péri – urétrale par expression des facteurs de virulence (Cf. Tableau I). A partir de la zone péri- urétrale, E. coli remonte l’urètre et colonise la vessie entraînant une cystite. Certaines souches d’E. coli peuvent ensuite envahir et se multiplier à l‘intérieur des cellules épithéliales et rénales pour provoquer une pyélonéphrite. A partir des reins E. coli peut ensuite envahir la circulation sanguine et entraîner d’autres complications [12, 23].
Les souches d’E. coli pathogènes sont généralement classés en deux grandes catégories selon leur capacité à provoquer une maladie. E. coli entérique (ECE) cause principalement des infections limitées à la muqueuse des intestins et des pathogènes extra-intestinaux (Ex PEC), qui ont la capacité de se propager à partir de l’intestin et vont provoquer des infections dans d’autres organes [50, 42].
Souches d’E. coli pathogènes à localisation intestinale
Les souches d’E. coli pathogènes intestinales sont regroupées sous la dénomination commune
InPEC (Intestinal Pathogenic E. coli) [36]. On distingue sept pathovars au sein des In PEC :
➢ E. coli Entéro-Toxinogènes (ETEC) L’ETEC est responsable de diarrhée infantile avec des conséquences fatales chez les enfants de moins de 5 ans. L’ETEC sécrète des toxines caractéristiques (les entérotoxines thermostables (ST), l’entérotoxine thermolabile (LT)). L’ETEC est la cause principale de la diarrhée chez les voyageurs [6].
➢ E. coli entéro-hémorragiques (EHEC) E. coli entérohémorragiques est responsable de diarrhée sanglante ou de colite hémorragique. La caractéristique de ce pathovar est la production de vérotoxine également connu sous le nom de Shiga toxine (Stx). Stx est produite dans le côlon et endommage le tissu entraînant une diarrhée sanglante [49]. ➢ E. coli entéro-invasifs (EIEC) Les EIEC sont très similaires dans leurs aspects biochimiques, génétiques et pathogéniques aux Shigella spp. Ils ont les mêmes mécanismes de pathogénicité [6].
➢ E. coli entéro-pathogènes (EPEC) E. coli entéro-pathogène est une cause fréquente de diarrhée infantile dans les pays en développement. EPEC colonisent d’abord l’épithélium intestinal, puis entraîne un effacement de microvillosités à la surface des entérocytes et cause ainsi une diarrhée sanglante [8, 47].
➢ E. coli à adhérence diffuse (DAEC) Les DAEC sont définis par leur profil d’adhérence sur les cellules HeLa et ont été associés à la diarrhée dans le monde. Elles sont également responsables d’infections récurrentes des voies urinaires [39].
Souches d’E. coli pathogène à localisation Extraintestinale
Les souches d’E. coli pathogènes extra-intestinales sont regroupées sous la dénomination commune ExPEC (Extra intestinal Pathogenic E. coli) [44]. On distingue essentiellement deux pathovars au sein des ExPEC :
– les E. coli uro-pathogènes (UPEC),
– les E. coli responsables de méningites, le plus souvent chez le nouveau-né.
Les infections extra-intestinales à E. coli sont communes à tous les groupes d’âge et peuvent infecter n’importe quel organe ou site anatomique chez l’homme.
Le clone ST131 est responsable d’infections urinaires et de septicémies à travers le monde. Il est caractérisé par sa multirésistance aux antibiotiques dont les fluoroquinolones [45].
Mécanisme d’action des fluoroquinolones
Après avoir franchi la paroi bactérienne, les fluoroquinolones se fixent sur les complexes formés entre l’ADN bactérien et la topoisomérase II (ADN gyrase) ou la topoisomérase IV, qui sont respectivement responsables du surenroulement négatif de la molécule d’ADN et de la séparation des brins néoformés au cours de la réplication. La fixation des fluoroquinolones stabilise le complexe topoisomérase/ADN ce qui conduit à une accumulation de brins d’ADN cassés, ce qui est létale pour la bactérie. L’action des fluoroquinolones est bactéricide [1, 9]
Résistance d’Escherichia coli aux fluoroquinolones
Depuis leur mise sur le marché, l’incidence de la résistance aux fluoroquinolones ne cesse de croître chez les entérobactéries, la proportion de souches résistantes aux fluoroquinolones à Dakar est passée de moins de 28,0% en 2000 à 48,9% en 2015 [19, 20, 30]. Cette résistance fait intervenir différents mécanismes chromosomiques et plasmidiques.
Mécanisme chromosomique de la résistance aux fluoroquinolones
La résistance chromosomique est due à des mutations localisées à l’intérieur et à l’extérieur de la membrane plasmique. Ces mutations conduisent soit à la perte d’affinité de l’antibiotique pour sa cible, soit à une augmentation de son excrétion hors du cytoplasme, soit à une diminution de sa pénétration transmembranaire [28, 30, 35].
Perte d’affinité des fluoroquinolones pour les topoisomérases
La perte d’affinité provient de mutations dans la région quinolone resistance determining region (QRDR) des topoisomérase II et IV qui sont les cibles principales des fluoroquinolones. Les topoisomérases sont des complexes enzymatiques constitués de deux paires de sous-unités, d’une part la protéine GyrA (97 kDa), codée par le gène gyrA et la protéine GyrB (90 kDa), codée par le gène gyrB pour la topoisomérase II, d’autre part la protéine ParC (75 kDa), codée par le gène parC et la protéine ParE (70 kDa), codée par gène parE pour la topoisomérase IV. Les mutations impliquent des substitutions en acides aminés qui apparaissent dans la région QRDR des sous-unités Gyr et Par [11, 28].
Réduction de la perméabilité et surexpression des pompes à efflux
La résistance chromosomique aux quinolones peut également être associée à la diminution de la perméabilité membranaire et/ou à la surexpression des systèmes d’efflux. Chez E. coli, les porines OmpF et OmpC sont nécessaires à la diffusion des quinolones dans le cytoplasme bien que certaines fluoroquinolones aient la capacité de diffuser à travers la bicouche phospholipidique. Une mutation de ces porines conduit à une réduction de la perméabilité membranaire aux fluoroquinolones chez E. coli.
. De plus, des systèmes d’efflux constitutifs exprimés par E. coli excrètent les fluoroquinolones hors du cytoplasme cellulaire. E. coli possède plus d’une vingtaine de pompes à efflux dont la pompe à efflux AcrAB-TolC codée par le gène acrAB-tolC situé dans la membrane interne. Les mutations survenant dans le gène acrR (répresseur de acrAB) augmentent l’activité de la pompe et à une augmentation de l’efflux des fluoroquinolones [11, 32].
Le support de la résistance aux quinolones était supposé être uniquement chromosomique, jusqu’en 1998 où Martinez-Martinez et ces collaborateurs, ont décrit pour la première fois une souche de Klebsiella pneumoniae dont le support de la résistance aux quinolones est un plasmide transférable PMQR (Plasmid Mediated Quinolone Resistance) [41, 46].
Mécanisme plasmidique de la résistance aux fluoroquinolones
La résistance plasmidique est due à l’acquisition de gènes de résistance par E. coli. En fonction du gène de résistance acquis, nous distinguons trois mécanismes plasmidiques : la protection de la cible des fluoroquinolones ; l’acétylation enzymatique de l’antibiotique et les pompes à efflux [20, 41].
Protection de la cible des fluoroquinolones
Ce mécanisme a pour déterminant génétique les gènes qnr codant pour les protéines Qnr. Les Qnr sont des protéines à motifs pentapeptidiques qui se fixent aux topoisomérase II et IV en compétition avec l’ADN. Ainsi, les protéines Qnr s’intercalent entre les topoisomérases et les fluoroquinolones bloquant ainsi leur activité. Il existe plusieurs variants des protétines Qnr (QnrA, QnrB, QnrS et QnrD) décrits à travers le monde [30, 46].
Acétylation enzymatique des fluoroquinolones
Ce mécanisme a été décrit chez des souches d’E. coli isolées en Chine. Le déterminant de cette résistance est le gène aac(6’)-Ib-cr qui est un variant du gène aac(6’)-Ib avec deux substitutions (Trp102Arg et Asp179Tyr) de la protéine AAC(6’)-Ib élargissant ainsi le spectre d’activité de la nouvelle enzyme AAC(6’)-Ib-cr, qui confère également une résistance de bas niveau à la ciprofloxacine et la norfloxacine par acétylation de l’atome d’azote présent sur le noyau pipérazinyl [22, 27].
Excrétion des fluoroquinolones hors du cytoplasme
Les déterminants plasmidiques de ce mécanisme sont des gènes qepA et oqxAB, codant des pompes d’efflux.
– La pompe à efflux QepA
Découverte en 2002 au Japon, la pompe à efflux nommée QepA est codée par le gène qepA situé sur un plasmide de résistance. Le gène qepA code pour une protéine de 511 acides aminés qui est une pompe à efflux de la famille des transporteurs MFS (pour Major Facilitator Superfamily). Depuis la découverte du gène qepA, un variant de ce gène, nommé qepA2, qui présente deux substitutions en acides aminés a été mis en évidence. Ce variant confère un phénotype de résistance similaire à qepA, renommé depuis qepA1 [46].
– La pompe à efflux OqxAB
Un plasmide conjugatif porteur d’une résistance à l’olaquindox, utilisé en agriculture dans certains pays du monde comme promoteur de croissance, a été identifié parmi des souches d’E. coli provenant d’élevages de porcs. Le mécanisme de résistance impliqué est une pompe à efflux non spécifique nommée OqxAB. Il s’agit d’un mécanisme rare conférant une résistance de bas niveaux aux fluoroquinolones [17].
Méthodologie
Extraction ADN
L’extraction de l’ADN a été réalisée par thermolyse sur souche pure obtenue après repiquage sur milieu MH. Deux colonies de culture pure d’E. coli ont été mises en suspension dans un tube Eppendorff® contenant de l’eau physiologique stérile placé dans un bain-marie à une température de 100C pendant 12 min. Le tube était ensuite centrifugé à 4C (centrifugation réfrigérée), à la vitesse de 10 000 tr/min pendant 10min. Le surnageant contenant l’ADN a été recueilli et la pureté de l’ADN a été évaluée au Nanodrop Lite®.
Préparation des Mix
Nous avons utilisé des paires d’amorces spécifiques (amorce sens et amorce anti-sens) (Cf.Tableau III), de l’ADN matriciel, de l’eau tamponnée (Reaction buffer B Solis BioDyne) et du master mix (Master Mix FIREPol® Solis Biodyne) prêt à l’emploi pour préparer le mélange réactionnel sous hotte à flux laminaire. Le master mix contenait de l’ADN polymérase (FIREPol® DNA polymerase), des désoxyribonucléotides (1 mM dNTP), du chlorure de magnésium (12,5 mM
MgCl).
Répartition des Souches en fonction des gènes portés
Toutes les souches analysées hébergeaient au moins un gène de résistance détecté. Trois souches (6%) portaient cinq gènes de résistance (gyrA-parC-parE-qnrB-aac(6’)-ib, n= 3).
Cinquante pourcent (50, 25/50) des souches portaient quatre gènes de résistance (gyrA-parC- parE- aac(6’)Ib n= 24, gyrA-parC-parE-qnrB n=1).
Trente-six pourcent (36%, 18/50) des souches portaient trois gènes de résistances (gyrA-parC- parE, n=18). Quatre pourcent (4%, 2/50) des souches portaient deux gènes de résistance (parC-aac(6’)-ib, n=2).
La présence d’un seul gène (cf. figure 12) a été trouvé chez 4 (2/50) des souches.
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Table des matières
Première partie :
I. Généralités sur Escherichia coli
I.1. Historique
I.2. Taxonomie
I.3. Caractères bactériologiques
I.3.1. Caractères morphologiques
I.3.2. Caractères culturaux
I.3.3. Caractères biochimiques
I.3.3. Caractères antigéniques
I.4. Facteurs de virulence
I.5. Epidémiologie
I.5.1. Habitat
I.5.2. Mode de transmission
I.6. Pouvoir pathogène
I.6.1. Souches de Escherichia coli pathogènes à localisation intestinale
I.6.2. Souches de Escherichia coli à localisation Extraintestinale
II. Les fluoroquinolones
II.1. Structure et classification
II.2. Mécanisme d’action des fluoroquinolones
III. Résistance d’E. coli aux fluoroquinolones
III.1 Mécanisme chromosomique de la résistance aux fluoroquinolones
III.1.1. Perte d’affinité des fluoroquinolones pour les topoisomérases
III.1.2. Diminution de la perméabilité et surexpression des pompes à efflux
III.2. Mécanisme de la résistance plasmidique aux fluoroquinolones
III.2.1. Protection de la cible des fluoroquinolones
III.2.2. Acétylation enzymatique des fluoroquinolones
III.2.3. Excrétion des fluoroquinolones hors du cytoplasme
IV. Définition et principe de la technique PCR
IV.1. Définition
IV.2. Principe
V. Séquençage
2ième partie : travail expérimental
I. Objectif
II. Cadre d’étude
III. Souches bactériennes
IV. Matériels et méthodes
IV.1. Matériels
IV.2. Méthodologie
V. Résultats
VI. Discussion
Références bibliographiques
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