Séquençage du gène pncA sur les isolats de Mycobacterium tuberculosis

Définition et classification

Définition : La TB est une maladie contagieuse causée par une bactérie appelée MTB ou encore bacille de Koch (BK). Elle s’attaque habituellement aux poumons, mais parfois aussi à d’autres parties du corps, telles que les reins, les ganglions et les os. Le BK appartient à la famille des mycobactéries, bacilles acidoalcoolorésistants (BAAR), dont la coloration résiste à l’action de l’acide et de l’alcool. Sa croissance est lente, voire très lente (2 à 8 semaines). Il pénètre dans l’organisme par les voies respiratoires.
Classification : Les BK sont des bacilles aérobies assez longs et fins, asporulés et acapsulés. Ils appartiennent au :
 Règne : Bacteria
 Embranchement : Actinobacteria
 Ordre : actinomycetales
 Sous-ordre : Corynebacterineae
 Famille : Mycobacteriaceae
 Genre : Mycobacterium
 Espèce : tuberculosis
Le principal point commun de toutes les espèces appartenant au genre Mycobacterium, placé dans l’ordre des Actinomycètales, est une propriété tinctoriale mise en évidence par la coloration de Ziehl-Neelsen : c’est l’acidoalcoolo-résistance [19]. Ils existent plus de 100 espèces de mycobactéries, parmi cette centaine, seulement 3 sont pathogènes à l’homme :
 Mycobacterium tuberculosis : responsable de la TB
 Mycobacterium leprae : responsable de la Lèpre
 Mycobacterium ulcerans : responsable de l’ulcère de Burili.
Les autres espèces sont des germes saprophytes, on les retrouve dans l’environnement (la terre et les eaux). Ils sont occasionnellement opportunistes en cas d’immunodépression locale ou systémique : c’est le cas des Mycobactéries dites Atypiques [19]. Les Mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis se subdivisent en plusieurs espèces dont on peut mentionner :
 Mycobacterium tuberculosis : communément appelé bacille de Koch ou BK, c’est la mycobactérie humaine, agent de la tuberculose qui est le plus souvent respiratoire [21].
 Mycobacterium africanum : mycobactérie humaine, agent de la Tuberculose isolé en Afrique tropicale [21].
 Mycobacterium bovis : c’est la mycobactérie animale qu’on retrouve chez les bovidés. Elle est occasionnellement responsable de la TB chez l’homme, mais est surtout intestinale (lait) [22].
 Mycobacterium Bovis B.C.G. qui est le Bacille de Calmette et Guérin
 Mycobacterium microti : rare chez l’homme
 M. canetti
 M. pinipennidi
 M. caprae
 M. mungi

Recherche des mycobactéries par culture

     MTB est un bacille à croissance très lente (2 à 6 semaines) et exigeant des milieux spéciaux. Le milieu solide le plus utilisé est celui de Lowenstein-Jensen (LJ) ou une de ses multiples variantes (Coletsos, etc.). Ce sont des milieux solides à base d’œufs, additionnés en proportion variable d’asparagine, de glycérine ou de vert malachite. La culture est aussi effectuée en milieu liquide sur système automatisé (Middlebrook, Mycobacteria Growth Indicator Tube : MGIT par exemple). Les colonies apparaissent après 2 à 4 semaines et sont blanc-ivoire, rugueuses et adhérentes au milieu. Elles grossissent lentement pour atteindre 3-4 mm après 2-3 mois sous un aspect chou-fleur. La décontamination est la première étape de la culture des BAAR et est indispensable pour tous les prélèvements provenant de lésions ouvertes (respiratoires, urinaires, selles, fistules…). La décontamination permet d’éliminer tous les germes banaux susceptibles de souiller le milieu de culture ce qui permettra d’obtenir une culture pure. Les prélèvements provenant de lésions fermées (LCR, liquides de séreuses, pus…) peuvent être dans certains cas ensemencés directement. Ils existent 4 Méthodes de décontaminations :
– Décontamination à la soude à 4 % (méthode de Petroff).
– Décontamination à l’acétyl cystéine et à la soude (méthode de Kubica).
– Décontamination au lauryl sulfate de sodium (méthode de Tacquet-Tison).
– Décontamination à l’acide sulfurique à 4 % (méthode de Löwenstein).
Parmi ces méthodes, la plus utilisée est celle de Kubica, elle s’effectue comme suit :
Dans un tube à centrifuger conique :
– Ajouter à 3 ml de produit pathologique, 4 ml de solution décontaminant.
– Mélanger par agitation au vortex pendant 20 secondes, retourner le tube afin de parfaire le contact.
– Laisser en contact 20 mn à température ambiante en agitant doucement sur agitateur de Kahn.
– Ajouter le tampon phosphate jusqu’à 50 ml.
– Centrifuger 30 mn à 3000 g.
– Jeter le surnageant et reprendre le culot avec 1 ml de tampon phosphate.
Après la décontamination, on peut passer à l’ensemencement qui peut se faire sur milieu liquide et solide.

Les antibiotiques de première ligne

Il s’agit de :
 L’isoniazide (INH) : puissant bactéricide sur les bacilles tuberculeux en phase de réplication, l’isoniazide est actif sur les bacilles des cavernes et à un moindre degré sur les bacilles intra-macrophagiques. Il n’a pas d’activité sur les bacilles du caséum solide [23].
 La rifampicine (RMP) : Elle est active sur les bacilles des cavernes, du caséum solide et sur les bacilles intra macrophagiques: elle a une activité stérilisante [24].
 Le Pyrazinamide (PZA) : Il est uniquement actif sur les bacilles intramacrophagiques et son activité à ce niveau est forte, détruisant les bacilles quiescents pouvant rester plusieurs années dans les macrophages : il a une activité stérilisante puissante. Il évite donc les rechutes et a permis de raccourcir le traitement antituberculeux à 6 mois [23].
 La streptomycine (S) : Elle possède une forte activité bactéricide sur les bacilles extracellulaires. Elle n’est plus utilisée en première intention dans la plupart des pays aujourd’hui du fait de son administration parentérale exclusive et de sa toxicité rénale et auditive dose-dépendante. La streptomycine est utilisée en deuxième intention en cas de tuberculose résistante à la rifampicine ou en cas d’atteinte de la fonction hépatique, gênant l’utilisation des autres antituberculeux de première ligne potentiellement hépatotoxiques [23].
 L’éthambutol (EMB) : Ce médicament est bactériostatique et agit sur les bacilles des cavernes et sur les bacilles intra-macrophagiques mais n’a pas d’action sur les bacilles du caséum solide. Mais prévient la multi résistance [23].

Rifampicine

     La Rifampicine est un médicament de première ligne important pour le traitement de la TB. La rifampicine (RIF) est un dérivé de la rifamycine. Elle fut introduite dans le traitement anti tuberculeux en 1972 et son activité bactéricide est puissante. La Rifampicine est bactéricide pour M. tuberculosis. La Rifampicine est active à la fois contre les bacilles en phase de multiplication et ceux en phase stationnaire (dont l’activité métabolique est faible). Ce dernier type d’action est lié à sa puissante activité stérilisante in vivo qui va de pair avec sa capacité de raccourcir le traitement de la TB de 12– 18 mois à 9 mois. La Rifampicine interfère avec la synthèse d’ARN en se liant à la sous-unité β de l’ARN polymérase. L’ARN polymérase est un oligomère consistant en un noyau enzymatique formé par quatre chaines α2ββ′ en association avec une sous-unité σ qui stimule spécifiquement la transcription à partir des promoteurs. Le site de liaison de la rifampicine est situé en amont du centre catalytique et bloque physiquement l’élongation de la chaîne d’ARN. Pour M. tuberculosis, la résistance à la rifampicine survient à une fréquence de 10–7 à 10–8. Les mutations dans la région de la paire de base (bp) 81 de rpoB sont observées dans environ 96% des isolats de M. tuberculosis résistants à la rifampicine. Les mutations dans les positions 531, 526, et 516 sont parmi les mutations les plus fréquentes observées dans les souches résistantes à la rifampicine. Les mutations dans rpoB entraînent généralement une résistance de haut niveau ainsi qu’une résistance croisée avec toutes les rifamycines. Toutefois, les mutations spécifiques dans les codons 511, 516, 518 et 522 sont en association avec un faible niveau de résistance à la rifampicine. Il existe des souches de M. tuberculosis dépendantes de la rifampicine. Ces souches connaissent une croissance médiocre dans un milieu à base d’œufs, mais se développent mieux en présence de rifampicine. Ces souches ne sont pas dépendantes de la rifampicine puisqu’elles pourraient encore se développer médiocrement en l’absence de rifampicine. Les circonstances dans lesquelles les souches dépendantes de la rifampicine surviennent restent encore mal définies, mais elles apparaissent souvent comme une TB -MDR et semblent se développer en présence de traitements répétés avec des rifamycines chez des patients en retraitement [26].

La révélation des extraits d’ADN

    La révélation sur gel de migration électrophorétique permet d’apprécier la taille, la quantité et la qualité de l’ADN extrait. Un extrait d’ADN génomique non dégradé présente, sur gel, une seule bande de haut poids moléculaire (1100pb) en référence au marqueur Smart Ladder 100pb.

CONCLUSION

      Au terme de cette étude nous pouvons conclure que les jeunes de sexe masculin sont plus exposés à la TB-MR et que les patients ayant déjà reçu un traitement antérieur sont plus susceptibles de développer une résistance. Comme l’objectif général de cette étude était d’identifier les mutations dans le gène pncA qui pourraient être à l’origine de la résistance de MTB au PZA, les résultats obtenus montrent une variété de mutations sur la portion du gène étudié. Ces mutations retrouvées chez des isolats présentant une résistance à la rifampicine détectée par l’automate GeneXpert devront être documentées davantage pour élucider les zones d’ombres qui entourent l’utilisation du PZA dans les régimes de traitement de la TB sensible et résistante et l’apparition des mutations qui parfois ne sont pas associées à une résistance et les nouvelles mutations non encore décrites dans la littérature. A la fin de cette étude nous pouvons tirer comme perspectives :
 Faire de futures investigations pour comprendre la relation entre les mutations sur le gène pncA, leur association à la résistance au PZA et leur impact sur l’issu du traitement antituberculeux pour une optimisation future des régimes de traitement de la TB. D’envisager d’autres études par rapport à la résistance au PZA car il a été noté dans la littérature que des mutations dans d’autres régions du génome (rpsA et panD) et l’inhibition de fas1 par l’acide pyrazinoïque pourraient être associées à la résistance au PZA.
 De faire une étude plus poussée pour comprendre la résistance concomitante de la rifampicine et du PZA.

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Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE
Chapitre I : Synthèse Bibliographique
I. Définition et classification
I. 1. Définition
I.2. Classification
II. Historique
III. Caractères bactériologiques
III.1. Caractères morphologiques de M. tuberculosis
III.2. Caractères biochimiques de M. tuberculosis
IV. Diagnostic biologique
IV.1. Méthode classique
IV.I.1.La Bacilloscopie
IV.I.2. Lecture au microscope
IV.I.3.Recherche des mycobactéries par culture
IV.2. Méthode moléculaire
IV.2.1. Détection sur système GeneXpert : test XPERT MTB/RIF®
IV.2.2. Principes du test XPERT MTB/RIF
IV.2.3. Procédure du test XPERT MTB/RIF
IV.2.4.Résultats et interprétations
V. Molécules utilisées dans le traitement antituberculeux
V.1. Les antibiotiques de première ligne
V.2. Les antibiotiques de seconde ligne
VI. Résistance aux antituberculeux : les différents types de résistance
VI.1. Origines des résistances
VI.2. Mécanismes de résistance
VI.2.1.Isoniazide
VI.2.2.Rifampicine
VI.2.3.Pyrazinamide
VI.2.4.L’ethambuthol
VII. Épidémiologie de la tuberculose et de la résistance
VII.1. Dans le monde
VII.2. Au Sénégal
DEUXIEME PARTIE : ETUDE DE LA RESISTANCE AU PZA
Chapitre II
I. Matériel et méthodes
I.1. Matériel de base
I.2. Réactifs
II. Méthode
II.1. Cadre d’étude
II.2. Préparation de l’échantillon
III. Résultats
III.1 Population d’étude
III.2 La révélation des extraits d’ADN
III.3 Les séquences nucléotidiques obtenues
III.4 Test de résistance
IV. Discussion
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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