Soutenance mémoire
SEPARATION DES VESICULES EXTRACELLULAIRES
Les vésicules extracellulaires, notées EVs, sont des vésicules de taille hétérogène libérées par toutes les cellules du corps. Elles circulent librement dans les fluides biologiques et les derniers travaux menés dans le domaine leur confèrent un rôle de marqueurs dans de nombreuses pathologies. Ainsi, les identifier et les caractériser permettrait des avancées majeures dans le diagnostic et le pronostic de maladies. Or, du fait notamment de cette hétérogénéité en taille, les techniques usuelles d’isolement des EVs possèdent toutes des limites.
Après une description des principales caractéristiques des EVs, nous présenterons les principales techniques actuelles de purification applicables aux EVs. Nous décrirons les différentes méthodes de caractérisations des EVs et un inventaire des principaux avantages et inconvénients sera donné. Enfin, pour finir ce chapitre, nous présenterons les objectifs et les motivations de ces travaux de thèse.
Les vésicules extracellulaires
Les EVs sont présentes dans tous les fluides biologiques (la salive [1] [2], l’urine [3] [4], le liquide amniotique [5], le lait maternel [6] [7], le liquide séminal [8] [9], le fluide vaginal [10], le cordon ombilical [11], le liquide de lavage broncho-alvéolaire [12] et le sang) et peuvent être libérées par quasiment toutes les cellules. Les EVs entrent également en jeu dans la communication intercellulaire [13] et sont également impliquées dans de nombreux processus physiologiques [14]. Aussi, les EVs peuvent jouer un rôle important dans un nombre considérable de pathologies [15], comme les cancers [16] [17], les maladies cardiovasculaires [18] [19] et les maladies coronaires [20], les maladies rénales [21] [22] ou encore dans les maladies neurodégénératives comme par exemple la maladie d’Alzheimer [23] [24]. On pense aujourd’hui que les EVs pourraient avoir un impact déterminant dans le diagnostic et dans le pronostic de ces maladies [25]. Or, les EVs possèdent une large gamme de taille (Figure I.1) allant de 30 nm (soit 100 fois plus petites que les cellules) à environ 1 000 nm de diamètre pour les plus grosses [26]. Aussi, leur caractérisation représente un véritable enjeu car, actuellement, il n’existe pas de technique générique permettant de les isoler et de les analyser de façon simple.
Découverte des vésicules extracellulaires
La découverte des EVs par Erwin Chargaff et Randolph West [27] remonte au milieu du XXIème siècle. En étudiant le temps de coagulation du plasma selon la vitesse de centrifugation, ils découvrent que le plasma, sans cellule, contenait un facteur subcellulaire favorisant la coagulation du sang. Ils observent alors que, lorsque le plasma est débarrassé des plaquettes, il génère une protéine, la thrombine, dont le taux peut varier selon la vitesse de centrifugation. Ceci était en contradiction avec le principal dogme de la médecine de l’époque qui énonçait que les plaquettes étaient responsables de la coagulation du sang. Simultanément, ils mettaient en évidence la présence de particules subcellulaires qui seront identifiées, plus tard, comme des EVs plaquettaires. Dans la même période, l’ensemble des travaux menés par le britannique Peter Wolf [28], mettait à jour une fraction cellulaire provenant des plaquettes, les « poussières de plaquettes ». Ces dernières possédaient une taille comprise entre 20 et 50 nm de diamètre, étaient présentes dans le plasma et possédaient des propriétés coagulantes. Il aura fallu attendre bien des années plus tard pour que ce terme soit remplacé par le nom de microparticules. Par la suite, de nouveaux travaux, réalisés en microscopie électronique par Webber et Johnson, permettaient la visualisation des vésicules subcellulaires libérées par des plaquettes. D’autres travaux ont permis de caractériser les microparticules du plasma et du sérum (James George, 1981) à l’aide notamment de méthodes d’immunocapture. Il a été montré que la concentration en microparticules plaquettaires était dix fois supérieure dans le sérum que dans le plasma. Ceci confirmait le fait que les plaquettes n’étaient pas la seule source d’origine des microparticules.
Au cours des dernières décennies, les avancés dans ce domaine ont permis d’établir que (1) les microparticules proviennent de nombreux types cellulaires et (2) qu’elles jouent un rôle de médiateur dans la coagulation sanguine. Les vésicules sont aujourd’hui un domaine majeur dans la recherche mondiale comme en atteste les courbes suivantes .
Du fait de leur taille hétérogène, de la difficulté à les détecter et à les caractériser par des méthodes conventionnelles, il n’existe pas de consensus permettant de classer les EVs. Toutefois, les EVs peuvent être nommées selon les cellules ou tissus dont elles sont originaires (par exemple dexosomes si elles proviennent des cellules dendriques ; prostasomes pour les vésicules dérivées de la prostate ; vésicules synaptiques issues des neurones). Aussi, des critères de taille, de densité, de morphologie, de composition protéique peuvent également entrer en jeu dans la classification des EVs, même si certains critères de classification se chevauchent et rendent leur distinction délicate. La classification la plus commune (par la taille) sera exploitée dans ce manuscrit et permettra de distinguer les types de vésicules suivantes : les exosomes (Exo), les microvésicules (MVs) et les corps apoptotiques (non détaillé dans ce manuscrit).
Les exosomes
Johnstone et al. [30] a été le premier à isoler des exosomes à partir d’érythrocytes de mouton et à démontrer que ces vésicules comportaient un nombre important d’enzymes. Il a été admis, par la suite, que les exosomes transportaient également des protéines mais également des acides nucléiques comme l’ARNm et microARN (Valadi et al. dans les années 2000). De ce fait, les exosomes, définis il y a une quarantaine d’années déjà, sont toujours aujourd’hui au centre d’une recherche accrue.
Taille et densité :
Les exosomes sont présentes et sécrétées dans un grand nombre de fluides biologiques, corporels mais aussi dans des milieux de cultures. Leur diamètre se situe dans la limite basse des EVs, entre 30 et 100 nm [26] et leur densité est comprise entre 1.13 et 1.19 g/mL [26]. Les méthodes standards de coloration négative permettent leur visualisation en microscopie électronique à transmission (TEM) et mettent en avant leur forme en « coupe » .
Biogénèse
Le mécanisme de formation des exosomes (Figure I.4), observé il y a plus de trente ans, reste à ce jour encore à l’étude. Une des voies de formation des exosomes, consiste en l’invagination de la membrane des endosomes et implique une première étape, la formation de vésicules intraluminales (ILV). Ces vésicules sont générées à l’intérieur d’endosomes multivésiculaires ou corps multivésiculaires (MVE). La fusion de la membrane des MVE avec la membrane plasmique d’une cellule permet la sécrétion et la libération des vésicules intraluminales ou exosomes vers l’extérieur de la cellule. Une seconde voie, plus directe, consiste en une libération des exosomes directement à partir de la membrane plasmique. La composition en protéines (plus de 4 000 protéines différentes ont été identifiées) [33], lipides et acides nucléiques caractérise les exosomes. Du fait de leur origine endosomale, tous les exosomes contiennent des protéines de transport, de fusion membranaire ou des protéines impliquées dans la formation et de la fusion de la membrane (GTPase, Alix, …) ainsi que des lipides (cholestérol) ou des phospholipides… De plus, les exosomes contiennent en quantité importante des miARN, ARN non codant, mais également des ARNm. Cependant, il semble que le contenu de la cargaison d’ARN des exosomes puisse être similaire à celui provenant des cellules parentales. Ainsi, ces miARN pourraient être utilisés comme marqueurs fiables.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I : SEPARATION DES VESICULES EXTRACELLULAIRES : ETAT DE L’ART ET POSITIONNEMENT DU PROJET
Les vésicules extracellulaires
I.1. Découverte des vésicules extracellulaires
I.1.a. Les exosomes
I.1.b. Les microvésicules
I.2. Rôles biologiques et pathologiques des EVs
I.3. Récapitulatif des différentes classes d’EVs
Les techniques de purification et d’isolement des EVs
II.1. Méthode de purification par la taille
II.1.a. Chromatographie d’exclusion par la taille (SEC)
II.1.b. Fractionnement par écoulement de champ (FFF)
II.1.c. Filtration et ultrafiltration
II.2. Ultracentrifugation
II.3. Précipitation
II.4. Les méthodes d’immunocapture
II.5. Les dispositifs microfluidiques
II.5.a. L’acousto-fluidique
II.5.b. Déplacement latéral déterministe (DLD)
II.6. Récapitulatif des différentes techniques de purification des EVs
Motivations et objectifs de la thèse
CHAPITRE II : PRINCIPE DE LA FILTRATION HYDRODYNAMIQUE ET TECHNOLOGIES DE FABRICATION DES DISPOSITIFS
Principe du dispositif de tri
I.1. Principe de la filtration hydrodynamique
I.2. Calcul des dimensions des puces microfluidiques
I.2.a. Dispositif 2D – Premier dispositif à 1 canalisation secondaire
I.2.b. Dispositif 2D – Dispositif à 10 canalisations secondaires
I.2.c. Dispositif 3D – Dispositif à 100 canalisations secondaires
I.2.d. Dispositif 3D – Dispositif adapté au tri des exosomes
I.3. Récapitulatif des différents dispositifs microfluidiques réalisés
Technologie de fabrication des puces microfluidiques
II.1. Présentation de la technologie « films secs »
II.1.a. Préparation du substrat et des ouvertures fluidiques
II.1.b. Réalisation du réseau de canalisation
II.1.c. Scellement des dispositifs
II.1.d. Techniques de fabrication 3D des puces microfluidiques
II.2. Technologie PDMS
Conclusion
CHAPITRE III : SEPARATION DE PARTICULES SUBMICROMETRIQUES PAR FILTRATION HYDRODYNAMIQUE
Protocole et observation des dispositifs de tri
I.1. Présentation du banc expérimental
I.2. Préparation des échantillons synthétiques : billes fluorescentes
I.3. Tests microfluidiques de validation des dispositifs à 1 et 10 canalisations secondaires
I.4. Tests microfluidiques sur les dispositifs à 100 canalisations secondaires à l’aide de billes synthétiques
I.5. Étude de la filtration de solutions de billes monodisperses
I.5.a. Mesure « témoin »
I.5.b. Caractérisation de la filtration des NP 480-OVA
I.5.c. Caractérisation de la filtration des NP 920
I.5.d. Caractérisation de la filtration des NP 140-CAS
I.6. Filtration de mélanges de billes synthétiques
I.7. Caractérisation des mélanges de billes synthétiques
I.7.a. Mélange 1 : NP 480-OVA et NP 920
I.7.b. Mélange 2 : NP 140-CAS et NP 920
I.8. Interprétations des résultats
Tests de filtration d’échantillons biologiques
II.1. Préparation et tests de filtration d’échantillon de plasma
II.1.a. Préparation des échantillons
II.1.b. Tests de filtration d’échantillon de plasma
II.2. Caractérisation des échantillons de plasma
II.2.a. Analyse par cytométrie en flux et calibration des différents NPs
II.2.b. Analyse par cytométrie du mélange de NP 480-OVA avec des NP 920
II.2.c. Analyse par cytométrie du plasma dilué 10 fois avec des NP 480-OVA
II.2.d. Analyse par cytométrie du plasma dilué 2 fois avec des NP 480-OVA ou NP920
II.2.e. Conclusion
II.3. Préparation et test de filtration d’échantillon de sang
II.3.a. Filtration d’un mélange de sang complet et de billes
II.3.b. Caractérisation des tests de filtration par comptage de cellules
II.3.c. Analyse de la filtration d’un échantillon de sang dilué 100 fois
II.3.d. Analyse de la filtration d’un échantillon de sang dilué 10 fois
II.3.e. Conclusion
Conclusion et perspectives
CONCLUSION GENERALE
