Soutenance mémoire
Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études
Recueil des selles
Préparation
Pour améliorer la qualité de l’EPS il est recommandé de :
– s’abstenir de prendre des médicaments à base de charbon, de sels de baryum, de magnésie, d’huiles purgatives, trois jours avant d’envisager l’examen ;
– éviter les aliments qui laissent beaucoup de résidus (crudités notamment peau de tomates, pommes de terre, petits pois, peau de pêche, poires).
Réalisation
L’accueil du malade et son interrogatoire devront être effectués discrètement. Il est nécessaire de tenir compte de la pudeur qui entoure la fonction de défécation quelle que soit la banalité que le coprologiste mette dans cet examen.
Recueillir les premières selles du matin dans un récipient propre et hermétique ; environ 20-40 g (grosse noix) pour les selles moulées et 5-6 cuillères à table pour les selles liquides. Ce prélèvement doit être effectué dans le laboratoire ; car certains parasites sont fragiles et leur durée de vie dans le milieu extérieur très courte. En cas d’impossibilité, il faut apporter le prélèvement dans les 30 minutes suivant l’émission des selles et ne pas les conserver au froid [7, 8].
Cas particuliers
– Scotch test anal: pour le dépistage des OEufs d’oxyure et les oeufs de Tænia
– Écouvillonnage rectal chez le nouveau-né ou le prématuré.
L’EPS doit être effectué immédiatement après réception du prélèvement, surtout pour les selles liquides ou glairo-sanguinolentes, pour éviter la destruction des trophozoïtes des protozoaires ; la transformation des larves rhabditoïdes de Strongyloïdes stercoralis en larves strongyloïdes ou l’embyonnement des oeufs d’Ancylostoma et de Necator.
CONDUITE DES EXAMENS
Examen macroscopique
L’examen coprologique doit comporter une description des selles :
couleur : marron foncé, brun, noirâtre, verdâtre, jaunâtre ;
consistance: selles en billes (en scybales), en fragments, moulées, moulées fermes ou moulées molles, pâteuses, semi-liquides ou franchement liquides.
présence d’éléments nutritionnels ou de parasites macroscopiques (vers ou fragments de vers).
Les selles sont homogènes ou hétérogènes ; par exemple : selles dures fragmentées dans un liquide fécaloïde ou avec du sang, du mucus, etc.
Les boîtes transparentes présentent l’avantage de permettre le repérage des parasites situés dans le fond des boîtes sous les matières fécales (Ascaris, oxyure, anneaux de Taenia par exemple).
Examen microscopique standard
Examen direct en solution salée isotonique (état frais)
C’est le temps majeur de l’EPS ; elle permet de détecter principalement les formes végétatives ou trophozoïtes, mobiles, des protozoaires et les larves mobiles de Strongyloides stercoralis et dans certains cas, les parasites qui se concentrent difficilement.
La préparation sera mise entre lame et lamelle et lue au microscope à l’objectif 10 puis 40.
Sa préparation diffère selon la nature et la consistance de l’échantillon, par suite de la présence éventuelle dans les selles glaireuses ou liquides, de formes végétatives de protozoaires dont la fragilité impose des précautions particulières [7, 8].
Selles glaireuses, muqueuses ou muco-sanguinolentes
Les formes végétatives d’amibes et les oeufs de schistosomes sont généralement recherchés. L’analyse doit être faite immédiatement après l’émission des selles, ou éventuellement recueillir la glaire dans un petit récipient fermé hermétiquement et maintenu sur une platine chauffante à 37° C.
Un fragment de glaire est prélevé et examiné entre lame et lamelle pour repérer les formes végétatives grâce à leur mouvement.
Selles liquides ou en bouse
La consistance des selles nécessite de délayer une parcelle de matière fécale avec une goutte d’eau physiologique, de manière à obtenir une préparation fine et homogène.
Les formes végétatives de flagellés, les kystes de protozoaires, les oocystes de coccidies et les oeufs ou larves d’helminthes sont généralement recherchés.
Selles moulées
Les kystes de protozoaires et les oeufs ou larves d’helminthes seront recherchés.
L’examen direct sera effectué après dilution des selles dans de l’eau physiologique, afin de réaliser une préparation fine et homogène.
Examen en solution de lugol
Principe. – La coloration au lugol permet de mettre en évidence les kystes de protozoaires spécialement les noyaux des kystes d’amibes.
Réalisation. – La réalisation se fera de la même façon que selon l’état frais, mais en remplaçant la solution d’eau physiologique par une solution iodo-iodurée à 1% : déposer sur une lame identifiée une goutte de lugol, y ajouter un morceau de selles et mélanger jusqu’à avoir une préparation homogène et fine.
Résultat. – Les kystes seront colorés en jaune-brun, les membranes nucléaires et les caryosomes en brun foncé et les vacuoles en brun-rougeâtre (Figure 1).
NB : le lugol détruit les formes végétatives.
Examen microscopique direct après colorations spéciales
Coloration au Merthiolate Iode
Formol (technique de Sapero, Lawlesset Strome) Principe. C’est une méthode de fixation et de coloration en tubes permettant une bonne observation des structures nucléaires (chromatine et caryosome) nécessaires à l’identification des formes végétatives et kystiques de nombreux protozoaires, en plus
de la coloration des parasites. La fixation intervient rapidement et fige les amibes à la position qu’elles ont à ce moment-là : ceci permettant d’apprécier la forme des pseudopodes. Les formes végétatives perdent leur mobilité mais seront conservées et fixées. Réalisation. Préparé au moment de l’emploi :
o Verser 2,35 ml de solution mère MF dans 0,15 ml de solution iodo iodurée ;
o Mélanger avec 0,25 ml d’échantillon fécal ;
o Homogénéiser à l’aide d’un agitateur puis laisser sédimenter pendant 30 minutes ;
o Recueillir avec une pipette Pasteur la partie supérieure du culot et lire examiner au
microscope. Résultat. Le MIF colore en rouge le cytoplasme, la membrane nucléaire et le caryosome des protozoaires. Les kystes mûrs apparaissent en blanc sur fond rosé de la préparation (Figure 2).
Autres techniques de coloration
Il existe d’autres techniques de coloration parmi lesquelles, nous pouvons noter :
La coloration à l’hématoxyline ferrique ;
La coloration à l’APV- Trichrome ;
La coloration au noir chlorazole de Kohn ;
La coloration de Ziehl-Neelsen modifiée par Henriksen et Pohlenz pour la recherche de cryptosporidies.
Examen microscopique après concentration
On appelle concentrations les techniques par lesquelles on essaie, à partir de la grande quantité de matières fécales recueillies, d’obtenir dans un faible volume les oeufs, larves et kystes de parasites ; par élimination des résidus de la digestion.
L’intérêt de la concentration coprologique est à l’origine de la mise au point d’un très grand nombre de méthodes que leur principe permet de classer en trois groupes [4, 11, 12]:
méthodes physiques
méthodes physico-chimiques ou diphasiques
méthodes mixtes ou combinées.
Méthodes physiques
Ces méthodes de concentration font intervenir des phénomènes physiques et permettent de distinguer différents types de concentration.
Concentration par sédimentation ou centrifugation
Le principe porte sur la dilution des selles dans un liquide de densité (d) intermédiaire entre les parasites qui se déposent, les particules alimentaires non digérées et les cadavres microbiens qui surnagent ou restent en suspension.
Densité des débris < d < densité des éléments parasitaires
Plusieurs modalités pratiques ont été décrites : sédimentation simple en eau physiologique ou en eau glycérinée, ou association sédimentation-centrifugation.
Sédimentation simple
Avantages. – Technique recommandée pour les larves d’anguillule et les oeufs d’Ascaris non fécondés. Elle ne nécessite pas de produits chimiques particuliers.
Inconvénients. – De nombreuses cellules végétales (féculents en particulier) sédimenteront aussi vite que les parasites recherchés et l’examen microscopique n’est pas toujours facile.
Technique. – 10 à 20 grammes de selles sont dilués dans 250 à 500 ml d’eau de robinet et le filtrat laissé dans un verre à pied. Après une heure, le surnageant est rejeté et le sédiment remis en suspension dans une même quantité d’eau. La même manipulation est renouvelée plusieurs fois jusqu’à obtention d’un liquide à surnageant clair. Le culot est alors examiné.
Au lieu d’attendre la sédimentation, il est possible de gagner du temps par une centrifugation douce.
Méthode de Faust et Ingalls en eau glycérinée
Avantages. – Technique de terrain employée pour rechercher les oeufs de Schistosoma mansoni mais permet aussi de trouver les oeufs d’Ascaris non fécondés et les larves d’anguillule.
Inconvénients. – Comme pour la technique précédente, l’examen microscopique peut être difficile par la présence de certains résidus.
Technique. – Cinq grammes de selles sont dilués dans 300 ml d’eau glycérolée à 0,5%, et trois sédimentations successives en verre à pied d’une durée de 1 heure, 45 minutes puis 30 minutes seront pratiquées.
Les oeufs de schistosomes seront à la superficie du sédiment mais il est recommandé d’effectuer des prélèvements à différents niveaux.
Méthodes physico-chimiques
Principe. – La concentration parasitaire résulte de trois phénomènes :
o La mise en présence de deux phases non miscibles ; l’une aqueuse, l’autre lipophile ; qui crée pour chacune des particules fécales, un coefficient de partage leur permettant de s’orienter en fonction de leur équilibre hydrophile-lipophile ;
o Action dissolvante des réactifs qui supprime certains constituants fécaux (lipides) ;
o La densité des parasites supérieure à celle de la phase aqueuse.
Les éléments sur la balance hydrophile-lipophile penchant en faveur des groupements hydrophiles se retrouvent dans la phase aqueuse et se retrouvent au fond du tube. Au contraire si la balance penche en faveur des groupements lipophiles, l’élément reste en contact de la couche d’éther et participe à la constitution de l’anneau qui se forme à l’interphase eau-éther.
Il existe également des facteurs susceptibles d’accroître l’hygrophilie des éléments parasitaires ; comme le pH (pH 5 meilleur pour la plupart des oeufs), la composition ionique des phases ainsi que la présence d’agents tensio-actifs dans la dilution fécale.
Avantage. – Simplicité et rapidité.
Inconvénients. – La quantité de selles utilisée est faible, ce qui peut conduire à des résultats faussement négatifs.
Contre-indications. – Il n’existe pas de contre-indication formelle.
Technique de Ritchie modifiée
Réactif. – Il comprend :
o Solution aqueuse à 10% de formol
o Éther
Technique. – Il faut procéder comme suit:
o Délayer 2 g de selles dans 20 ml de solution de formol à 10% ;
o Tamiser sur du gaze (compresse) dans un tube à fond conique ;
o Ajouter la phase organique à base d’éther, 1/3 du volume obtenu après tamisage ;
o Emulsionner en agitant vigoureusement le tube pendant 30 secondes ;
o Centrifuger à 2500 t/min pendant 3 à 5 min ;
o Récupérer le culot en éliminant les couches supérieures par retournement du tube. S’il reste des traces de l’anneau, nettoyer le tube avec du coton ;
o Examiner au microscope entre lame et lamelle.
Technique à l’Iodesine
C’est une méthode de concentration diphasique utilisant l’éther comme solvant organique et la solution d’Iodesine comme solvant aqueuse.
C’est une méthode de concentration et de coloration des éléments parasitaires, qui apparaissent en rose sur fond brun ou moins foncé.
Elle permet également une fixation des parasites qui apparaissent bien colorés et conservés pendant plusieurs jours.
L’éther (éther diéthylique) est le solvant de référence pour cette technique ; il permet une meilleure solubilisation des débris fécaux et l’obtention d’un culot moins volumineux nécessitant moins de montages pour l’examen microscopique.
Méthodes combinées
Chaque méthode de concentration proposée présente l’inconvénient d’éliminer des parasites et doit donc être choisie en fonction de ce que l’on recherche préférentiellement. Les méthodes les plus intéressantes pour la diversité des kystes ou oeufs concentrés laissent souvent à examiner un culot relativement important. Cependant, en combinant flottations et méthodes diphasiques, de meilleurs résultats ont été obtenus [13].
Première méthode de Junod
Technique. – Concentration diphasique (MIF Concentration ou Bailenger) en utilisant peu d’éther et en agitant modérément pour obtenir volontairement un culot important (première centrifugation). Le culot est remis en suspension dans une solution de sulfate de zinc à saturation. On pratique alors une deuxième centrifugation pendant 30 secondes à faible vitesse ce qui permet d’obtenir un surnageant et un culot (deuxième centrifugation). Ce surnageant est dilué au quart avec de l’eau distillée et centrifugé (troisième centrifugation); le culot est examiné.
Le culot de la deuxième centrifugation est repris dans une solution d’iodomercurate de potassium de densité 1,5 et la suspension est de nouveau centrifugée (quatrième centrifugation). Le surnageant est repris et dilué. Ce dernier diluât est centrifugé (cinquième centrifugation) et le culot est examiné.
Avantage. – Elle regroupe l’exigence de différentes techniques permettant de trouver des parasites de densités différentes.
Inconvénients. – Cette technique nécessite cinq centrifugations et demande un temps assez long. D’autre part l’utilisation d’une solution d’iodomercurate présente les inconvénients déjà signalés pour la méthode de Janeckso et Urbanyl (solution toxique et corrosive).
Deuxième méthode de Junod (Junod modifié)
Technique. – Il faut procéder comme suit :
o Mettre en suspension environ 8 g de selles dans 50 ml de solution de NaCl à 8,5 ‰, éventuellement formulée à 8 % ;
o Tamiser, centrifuger à 1200 tours/minute pendant une minute ;
o Eliminer le surnageant et faire une préparation d’une microgoutte du culot ;
o Examiner et remettre en suspension le reste du culot dans 20 ml d’une solution isotonique formolée (solution acéto-acétique formolée).
Remarque : quand cette méthode combinée intervient en complément d’une technique polyvalente usuelle, cette première centrifugation peut être supprimée.
o Ajouter 5 à 7 ml d’éther éthylique, agiter modérément, centrifuger à 1200 tours/minute pendant une minute et conserver le culot ;
o Remettre le culot en suspension dans 4 à 6 ml de solution d’iodomercurate (solution de densité 1,4 : liqueur de Thoulet : 1 volume – eau : 4,42 volumes) et centrifuger à 1200 tours/minute pendant deux minutes;
o Evacuer le surnageant et examiner le culot en totalité au microscope.
Avantage. – C. Junod considère que sa technique simplifiée donne autant de bons résultats que la technique complète.
Inconvénients. – Quoique simplifiée, la technique impose encore quatre centrifugations et l’emploi d’une solution d’iodomercurate.
Méthode de sédimentation-flottation pour oeufs et larves
Technique. Il faut procéder comme suit :
o Centrifuger, à 1200 tours/minute pendant une minute, la suspension fécale à 8,5 % de NaCl;
o Conserver le culot et le remettre en suspension dans 20 ml de solution acéto-acétique formulée sans adjonction d’éther ;
o Centrifuger à 1200 tours/minute pendant une minute, aspirer le surnageant et la partie superficielle du culot ;
o Remettre en suspension le culot dans 5 à 7 ml de solution d’iodomercurate de potassium de densité 1,35 et centrifuger à 1200 tours/minute pendant une minute ;
o Transférer par décantation le surnageant dans un autre tube conique, ajouter 20 ml d’eau et centrifuger à 1200 tours/minute pendant deux minutes ;
o Examiner le culot
Avantage. – Pour une recherche spécifique d’oeufs ou de larves, Junod considère que c’est la méthode la plus productive.
Inconvénients. – Quand la teneur des selles en lipides est anormalement élevée, les concentrations sans éther sont encombrées de graisses neutres, savons et acides gras.
Kit PARA-SELLES®PLUS-IODESINE/Kop-color II®
Ce kit intervient aussi bien niveau de la phase d’examen direct avec la coloration au Kop-color II® qu’au niveau de la phase de concentration.
Examen microscopique après coloration au Kop-color II®
Le Kop-color II® est un mélange d’agents colorants, facilitant la détection des éléments parasitaires. Il fait partie intégrante du kit PARA-SELLES®PLUS.
– Après avoir homogénéisé les selles, une faible quantité (300 mg) est prélevée et mise dans 1 ml d’eau physiologique pour réaliser une suspension homogène ;
– 25 μL de cette suspension sont déposés sur une lame avec 10 μL de kop-color II® ; cette préparation est bien mélangée recouverte par une lamelle puis observée au microscope.
La lecture des lames se fait d’abord au faible grossissement (x 100) pour déceler les oeufs et larves d’helminthes puis au grossissement moyen (x 400) pour rechercher les formes végétatives et kystiques des protozoaires.
Examen microscopique après concentration
Principe
La concentration par Iodésine est une technique reposant sur le principe des méthodes de concentration diphasiques. Elle utilise comme phase organique l’éther, et comme phase aqueuse la solution ʺbase pour Iodésineʺ ne contenant ni formaldéhyde, ni dérivé mercuriel, de manière à améliorer la sécurité au niveau du poste de travail.
Technique
– 3 Ŕ 4 g de selles sont délayés dans un tube de base pour Iodesine et triturées à l’aide d’une spatule jusqu’à l’obtention d’une suspension homogène ;
– 200 μl de lugol sont ajoutés à la suspension, qui est encore homogénéisée et laissée reposer pendant 2 Ŕ 3 minutes pour la sédimentation des gros débris ;
– 5 ml du surnageant sont versés dans un tube conique de 10 ml et 3 ml d’éther y sont ajoutés ;
– Le tube est vigoureusement agité pour émulsionner et centrifugé à 1500 tours / min pendant 3 minutes ;
– Le surnageant est éliminé par retournement du tube, et le culot est repris dans 1 ou 2 gouttes d’eau physiologique ;
Une goutte (25 Ŕ 35 μl) est déposée sur lame et lue au microscope au faible grossissement (x 100) puis au grossissement moyen (x 400).
NB : L’éther est le solvant de référence pour la technique Iodésine, il permet une solubilisation plus facile de certains débris, et l’obtention d’un culot moins volumineux contenant moins d’éléments non parasitaires.
|
Table des matières
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I. L’EXAMEN PARASITOLOGIQUE DES SELLES
I.1. Indications de l’EPS
I.2. Limites de l’EPS
I.3. Recueil des selles
I.3.1. Préparation
I.3.2. Réalisation
I.3.3. Cas particuliers
II. CONDUITE DES EXAMENS
II.1. Examen macroscopique
II.2. Examen microscopique standard
II.2.1. Examen direct en solution salée isotonique
II.2.1.1. Selles glaireuses, muqueuses ou muco-sanguinolentes
II.2.1.2. Selles liquides ou en bouse
II.2.1.3. Selles moulées
II.2.2. Examen en solution de lugol
II.3. Examen microscopique direct après colorations spéciales
II.3.1. Coloration au Merthiolate Iode Formol
II.3.2. Autres techniques de coloration
II.4. Examen microscopique après concentration
II.4.1. Méthodes physiques
II.4.1.1. Concentration par sédimentation ou centrifugation
II.4.1.2. Concentration par flottation
II.4.2. Méthodes physico-chimiques
II.4.2.1. Technique de Bailenger
II.4.2.2. Technique au Mercurothiolate-Iode-Formol
II.4.2.3. Technique de Ritchie modifiée
II.4.2.4. Technique à l’IODESINE
II.4.3. Méthodes combinées
II.4.3.1. Première méthode de Junod
II.4.3.2. Deuxième méthode de Junod (Junodmodifié)
II.4.3.3. Méthode de sédimentation-flottation pour oeufs et larves
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PROSPECTIF
I. CADRE, PERIODE ET TYPE D’ETUDE
I.1. Cadre d’étude
I.2. Type et période de l’étude
I.3. Echantillons de l’étude
I.3.1. Critères d’inclusion
I.3.2. Critères de non inclusion
I.4. Matériels et méthode de l’étude
I.4.1. Matériels et réactifs
I.4.2. Méthodes de l’étude
I.4.2.1. Recueil des selles
I.4.2.2. Examen macroscopique
I.4.2.3. Examen microscopique
I.4.2.3.1. Kit Copro-Duo® (RAL)
I.4.2.3.2. Kit PARA-SELLES®PLUS-IODESINE / Kop-color II®
I.4.2.3.3. Contrôle qualité interne des méthodes d’enrichissement
I.5. Analyse statistique
II. RESULTATS
II.1. Caractéristiques des échantillons de selles
II.2. Résultats globaux
II.2.1. Distribution des protozoaires
II.2.2. Distribution des helminthes
II.3. Taux de positivé de la recherche des parasites selon les méthodes utilisées
II.3.1. Examen direct à l’état frais et après coloration au lugol
II.3.2. Examen direct après coloration au Kop-color II®
II.3.3. Examen après concentration par Copro-Duo®
II.3.4. Examen après concentration par PARA-SELLES®PLUS IODESINE
II.4. Comparaison de la qualité de concentration par l’utilisation des particules
II.4.1. Kit COPRO-DUO®
II.4.2. Kit PARA-SELLES®PLUS-IODESINE
III. DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES
Télécharger le rapport complet
