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Rôle du burst oxydatif dans la réponse cellulaire
La génération d’un burst oxydatif est une des réponses de défense les plus précoces suivant l’infection. L’intensification d’une production latente des formes actives de l’oxygène (FAO) est une caractéristique importante des interactions hôte/pathogène. Ces composés vont avoir un effet toxique sur l’agent infectieux, mais vont également induire une cascade signalitique chez la plante.
Métabolisme des formes actives de l’oxygène
Les formes actives de l’oxygène
Les formes actives de l’oxygène regroupent l’ensemble des composés issus de la réduction de l’oxygène moléculaire, ainsi que les radicaux libres oxygénés.
L’oxygène singulet
L’oxygène moléculaire peut être transformé en formes actives de l’oxygène par transferts d’électrons ou transferts d’énergie (Figure 2). Une transformation par transfert d’énergie du dioxygène permet la production de l’oxygène singulet. Sa formation résulte généralement d’une excitation photochimique de l’oxygène. Si sa présence a été démontrée chez les plantes, il ne semble pas être un produit majoritairement formé au cours des réactions présentées en Figure 2. Son implication dans la production de FAO au cours d’interactions hôte/pathogène n’a pas été démontrée (Baker et Orlandi, 1995).
L’anion superoxyde O2·-
Le premier produit issu de la réduction de l’oxygène moléculaire est l’anion superoxyde O2·- : O2 + e- → O2·
Cette réduction à un électron nécessite un léger apport d’énergie, souvent fourni par des systèmes enzymatiques à NAD(P)H. Les étapes de réduction ultérieures ne nécessitent pas d’énergie et peuvent intervenir spontanément (Baker et Orlandi, 1995). Au pH physiologique l’anion superoxyde est peu réactif en milieu aqueux, ce qui lui permet de se déplacer assez loin de son lieu de production. En revanche sa charge électrique le rend incapable de diffuser à travers les membranes biologiques (Lamb et Dixon, 1997). Il est produit à l’extérieur de la membrane plasmique par les systèmes enzymatiques tels que les NADPH oxydases.
A pH acide il est en équilibre avec sa forme protonée HO2·, plus lipophile et donc capable de peroxyder les lipides (Baker et Orlandi, 1995) :
H+ + O2·- → HO2·
En solution aqueuse et à pH neutre où légèrement acide, tel qu’on le rencontre au niveau des parois cellulaires chez les végétaux, ces deux formes se dismutent spontanément en peroxyde d’hydrogène :
O2·- + 2H+ → H2O2
HO2· + H+ + e- → H2O2
A pH neutre cette réaction est catalysée par des superoxyde dismutases au niveau du cytosol, des chloroplastes et des mitochondries. Du fait de ces réactions, la production d’ions superoxyde s’accompagne toujours d’une production de peroxyde d’hydrogène. L’anion superoxyde est probablement peu toxique par lui-même et intervient surtout comme générateur du radical hydroxyle.
Le peroxyde d’hydrogène
Le peroxyde d’hydrogène est une forme active de l’oxygène plus stable et moins réactive que l’ion superoxyde. Il se forme soit par réduction divalente de l’oxygène moléculaire, soit par dismutation de l’anion superoxyde.
O2 + 2H+ + 2e- → H2O2
O2·- + 2H+ → H2O2
L’absence de charges électriques à sa surface le rend très lipophile et donc capable de traverser les membranes biologiques. Il peut donc atteindre des zones éloignées de son lieu de production (Wojtaszek, 1997). Le peroxyde d’hydrogène est soit dégradé en eau et dioxygène, spontanément ou par l’intermédiaire de catalases, soit utilisé par des peroxydases telles que l’ascorbate peroxydase ou la glutathion peroxydase. Dans ce dernier cas il peut engendrer la production de radicaux, dont des radicaux hydroxyles très réactifs.
Le radical hydroxyle
Le radical hydroxyle représente le plus puissant oxydant à un électron connu. Il est extrêmement réactif et interagit instantanément avec les sucres, les acides aminés, les acides nucléiques, les lipides et en particulier les phospholipides. De part sa capacité à initier des réactions radicalaires en chaîne, il est un responsable majeur de modifications irréversibles de macromolécules et de dommages aux organites (Wojtaszek, 1997). Son temps de demie vie est extrêmement court (10⁻⁹ seconde), il n’interagit donc qu’avec des molécules présentes dans son voisinage immédiat (Wojtaszek, 1997). Il peut être formé directement à partir d’ions superoxyde ou de peroxyde d’hydrogène, mais en conditions normales ces réactions sont très lentes et inefficaces pour produire des quantités suffisantes de radicaux hydroxyles. En revanche des quantités significatives peuvent être produites dans un environnement contenant des métaux tels que le fer Fe2+ ou le cuivre Cu+ .
Radicaux libres organiques
Les radicaux libres sont caractérisés par une grande réactivité chimique et une courte durée de vie. L’oxygène est à l’origine de la plupart des radicaux libres formés dans l’organisme. Les radicaux libres de l’oxygène comportent un ou plusieurs atomes d’oxygène et se trouvent soit sous forme de radical libre, soit sous forme protonée. Les radicaux peroxyles ROO· sont formés par l’addition d’oxygène moléculaire sur des radicaux libres de carbone. Ils sont peu réactifs mais capables de diffuser à travers les membranes biologiques. Les hydroperoxydes organiques ROOH sont les formes protonées des radicaux peroxyles. Ils sont très réactifs et se redécomposent en radicaux peroxyles ou en radicaux alcoxyles. Les radicaux alcoxyles RO· sont formés lors de la dégradation des peroxydes organiques. Ils sont très réactifs avec une demie vie de 10⁻⁶ seconde.
Production basale des FAO
Les formes actives de l’oxygène sont produites de façon continue à l’intérieur de la cellule, en tant que sous-produits du métabolisme cellulaire (Figure 3).
Les chloroplastes
Les métabolismes aérobies tels que la respiration et la photosynthèse conduisent inévitablement à la production de FAO, au niveau des chloroplastes, des mitochondries et des peroxisomes. Chez les plantes supérieures, les FAO sont produites de façon continue, majoritairement dans les chloroplastes. Les différents types de processus liés à cette production sont étroitement associés à la photosynthèse. Ils font intervenir le photosystème I qui permet la photoréduction directe de l’oxygène moléculaire, ainsi que les réactions liées au cycle photorespiratoire et faisant intervenir la Rubisco. Les radicaux superoxyde ainsi générés au niveau du chloroplaste sont rapidement convertis en peroxyde d’hydrogène par les CuZn-superoxyde dismutases. Enfin durant la photosynthèse, l’oxygène singulet est continuellement produit par le photosystème II. Au cours de stress lumineux entraînant la photoinhibition du photosystème II, la production de l’oxygène singulet augmente de façon drastique (Apel et Hirt, 2004).
Respiration mitochondriale
La réduction de l’oxygène moléculaire par les cytochromes respiratoires s’accompagne d’une formation parallèle d’environ 2 % d’ions superoxyde, de peroxyde d’hydrogène et éventuellement de radicaux HO·. La production mitochondriale de FAO dépend fort logiquement de la disponibilité en oxygène. Chez les mammifères les mitochondries sont la source majeure de FAO dans la cellule. Leur contribution chez les plantes supérieures est très faible, sans doute grâce à la présence de l’alternative oxydase (AOX). Celle-ci catalyse la réduction de l’oxygène moléculaire par l’ubiquinone, et entre de ce fait en compétition avec les cytochromes pour la consommation d’électrons. L’hypothèse de l’implication de l’alternative oxydase dans la réduction de la production de FAO par les mitochondries est notamment supportée par le fait que le peroxyde d’hydrogène induit l’expression de ces enzymes (Apel et Hirt, 2004).
Métabolisme cytosolique
Diverses réactions enzymatiques peuvent produire des radicaux superoxyde et du peroxyde d’hydrogène. Chez les organismes aérobies, l’anion superoxyde et le peroxyde d’hydrogène sont formés par la voie des pentoses phosphates, ainsi que dans le catabolisme des acides aminés et des acides gras. Le monoxyde d’azote est lui synthétisé à partir de l’arginine. D’une manière générale toute réaction biochimique faisant intervenir de l’oxygène moléculaire est susceptible d’être à l’origine d’une production de FAO. Chez les mammifères les peroxydes organiques sont des intermédiaires dans la synthèse des prostaglandines, des leucotriènes et des thromboxanes.
Interaction avec des agents étrangers
Au-delà du métabolisme cellulaire normal, l’organisme doit faire face aux agressions présentes dans son environnement, qu’elles soient d’ordre biologique, chimique ou physique. Les biotransformations enzymatiques de composés xénobiotiques, qui impliquent généralement des cytochromes P450 situées au niveau des microsomes, vont s’accompagner d’une production de radicaux libres par activation de l’oxygène. De la même façon d’autres enzymes vont produire des radicaux libres lors de processus de défense tels que la phagocytose chez les mammifères. Dans ce cadre la NADPH oxydase membranaire joue un rôle majeur dans la propriété bactéricide des neutrophiles par la génération d’un burst oxydatif.
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Table des matières
Chapitre I –Introduction
I. Introduction générale : de la survie en milieu hostile !
II. Rôle du burst oxydatif dans la réponse cellulaire
II.1 Métabolisme des formes actives de l’oxygène
II.1.1 Les formes actives de l’oxygène
II.1.1.1 Nature
II.1.1.2 Production basale des FAO
II.1.1.3 Rupture de l’équilibre : burst oxydatif
II.1.2 Effets sur les systèmes biologiques
II.1.2.1 Toxicité directe
II.1.2.2 Effets protecteurs des FAO produits par la plante
II.1.2.3 La réaction hypersensible
II.1.3 Enzymes impliquées dans la production de formes actives de l’oxygène
II.2 La NADPH oxydase
II.2.1 Mécanisme du burst oxydatif
II.2.1.1 Réaction catalysée
II.2.1.2 Cinétique du burst oxydatif
II.2.2 Structure de la NADPH oxydase
II.2.2.1 Structure du complexe actif chez les neutrophiles
II.2.2.2 Homologues à la NADPH oxydase chez les cellules non-phagocytaires
II.2.2.3 Structure de la NADPH oxydase chez les plantes
II.2.3 Parenté avec les ferriques réductases membranaires
II.2.3.1 Nature des ferriques réductases membranaires
II.2.3.2 Homologie de séquence
II.2.3.3 Homologie catalytique
II.3 Les peroxydases
II.3.1 Le groupe très diversifié des peroxydases
II.3.2 Les peroxydases animales à hème
II.3.2.1 Structure et biosynthèse des myéloperoxydases
II.3.2.2 Rôle des myéloperoxydases dans le burst oxydatif
II.3.3 Les haloperoxydases chez les algues
II.3.3.1 Les composés halogénés.
II.3.3.2 Les haloperoxydases
II.3.3.3 Rôles biologiques des vHPO
III. Les voies précoces de défense
III.1 Mécanisme de prévention
III.1.1 Piégeage des métaux
III.1.2 Molécules anti-oxydantes
III.1.3 Réactions enzymatiques
III.1.3.1 La glutathion peroxydase
III.1.3.2 La peroxiredoxine : glutathion peroxydase sélénium-indépendante
III.2 La voie des phénylpropanoïdes chez les plantes supérieures
III.3 Les voie des oxylipines : jasmonates et prostaglandines
III.3.1 Définition
III.3.2 Biosynthèse des oxylipines chez les mammifères
III.3.3 Biosynthèse des oxylipines chez les plantes supérieures
IV. Détoxication active de composés xénobiotiques
IV.1 Le métabolisme de phase I
IV.1.1 Réactions mises en jeu
IV.1.1.1 Les réactions d’oxydation
IV.1.1.2 Réactions de réduction et d’hydrolyse
IV.1.2 Les cytochromes P450
IV.1.2.1 Fonction biologique
IV.1.2.2 Localisation cellulaire et structure du complexe
IV.1.2.3 Nomenclature
IV.2 Le métabolisme de phase II : conjugaisons
IV.2.1 Réactions et enzymes mises en jeu.
IV.2.2 Les glutathion S-transférases
IV.2.2.1 Nature et fonctions biologiques
IV.2.2.2 Classification
IV.2.2.3 Régulation de l’expression des gènes
IV.3 Le métabolisme de phase III : élimination
Chapitre II -Problématique
I. Modèle d’étude : Chondrus crispus
I.1 Position phylogénétique
I.2 Cycle biologique
I.3 Valorisations
II. Stress oxydatif et protection cellulaire chez C. crispus
II.1 Burst oxydatif chez C. crispus
II.2 Les haloperoxydases
II.3 La voie des phénylpropanoïdes
II.4 Coexistence des deux voies de synthèse d’oxylipines
III. Vers une meilleure compréhension des voies de défense chez C. crispus
Chapitre III -Matériel et méthodes
I. Préparation du matériel végétal et traitement
I.1 Matières premières
I.1.1 Matériel végétal
I.1.2 Réactifs
I.2 Elicitation des gamétophytes de C. crispus
I.2.1 Expériences d’infection
I.2.2 Traitements chimiques
I.3 Mesure du burst oxydatif
II. Analyses de biologie moléculaire
II.1 Extraction des ARN et de l’ADN génomique
II.1.1 Extraction des ARN
II.1.2 Extraction de l’ADN génomique
II.2 Clonage et séquençage des acides nucléiques d’intérêt
II.2.1 Clonage et séquençage de la NADPH oxydase
II.2.2 Identification des séquences génomiques des glutathion S-transférases
II.3 Southern blotting
II.4 Analyses transcriptionnelles
II.4.1 Northern blotting
II.4.2 RT-PCR quantitative
III. Analyses bioinformatiques des séquences
III.1 Banques de données publiques
III.2 Alignements
III.3 Profils d’hydropathie
III.4 Phylogénie
III.5 Prédiction de la structure tridimensionnelle de CcGST1
IV. Analyses biochimiques
IV.1 Analyse de protéines sauvages
IV.1.1 Extraction des protéines de C. crispus
IV.1.2 Dosage de protéines
IV.1.3 Electrophorèses PAGE et PAGE-SDS
IV.1.4 Immunodétection de la NADPH oxydase chez C. crispus
IV.1.4.1 Obtention des anticorps primaires
IV.1.4.2 Obtention des protoplastes
IV.1.4.3 Western-blotting et détection
IV.2 Expression hétérologue et caractérisation de protéines recombinantes
IV.2.1 Expression hétérologue
IV.2.2 Purification sur colonne de nickel et dialyse
IV.2.3 Chromatographie d’exclusion de taille
IV.2.4 Tests enzymatiques pour les activités transférases et peroxydases
IV.2.5 Effets du pH et de la température
IV.2.6 Détermination des paramètres cinétiques
IV.3 Etudes cristallographiques de la protéine CcGST2 recombinante
Chapitre IV -Conclusion
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