Soutenance mémoire
Rôle des arthropodes piqueurs
Culture et isolement de souches
Intérêt de la culture de souches de Besnoitia besnoiti
La culture de parasites, in vitro comme in vivo a plusieurs applications. Cela permet l’étude du parasite (morphologie, immunologie, pharmacologie, diagnostic, production de vaccin…) notamment pour éclaircir ce que l’on n’arrive pas à voir en conditions naturelles (stades de développement chez l’hôte définitif, stades de reproduction asexuée…).
Type de cellule utilisé
Pour les cultures in vitro, la majeure partie des équipes utilise les cellules Véro (Cellules de rein de singe vert) mais des essais ont été fait par l’équipe de Shkap avec d’autres cellules de mammifère (Fibroblastes de souris L929, Madin Darby adult kidney cells MDBK, lymphoblastes bovins infectés avec des schizontes de Theileria annulata BL) ainsi qu’avec des cellules d’arthropodes (différentes espèces de tiques) .Le parasite se multiplie aussi bien dans des cellules de singe, de bovin ou de souris, ce qui montre une faible spécificité d’espèce, de plus, le taux de multiplication est identique qu’il s’agisse de cellules épithéliales ou de cellules fibroblastiques .Il est possible de cultiver ces parasites sur des cellules de tiques même si la multiplication est moindre qu’avec des cellules Véro. Par contre, les cellules parasitaires ont alors tendance à perdre leur forme allongée ou en banane (donc leur polarité) pour prendre une forme ronde. Aucun test d’infection avec ces parasites cultivés sur cellules de tiques n’a été fait sur des animaux de laboratoire pour savoir si les parasites restaient infectants . Ces essais sur cellules de tiques ont été faits en raison de l’hypothèse de Pols .Pouvoir multiplier les parasites sur ces cellules de tiques a un autre intérêt. Le vaccin pour Besnoitia besnoiti est un vaccin vivant atténué 7. Or il est produit sur cellules de mammifères,il y a donc un risque de contamination par d’autres agents infectieux comme ça a été le cas pour certains vaccins pour bovins et pour humains . Le fait de produire ce vaccin avec des cellules d’arthropode est plus sécuritaire au niveau sanitaire car il y a moins de risque de contamination par un autre agent infectieux porté par les cellules de mammifères mais il existe des risques d’allergisation et de très faibles risques de contamination.
Conditions optimales
Les paramètres physiques et chimiques pour obtenir une croissance optimale des parasites ont été étudiés par Shkap sur des cellules Véro .Le milieu de culture dans lequel les parasites se sont le plus multipliés est le milieu ML, une combinaison à volume égal de milieu de McCoy et de milieu de Leibovitz additionné de sérum de bovin. Ce milieu contient des acides aminés et des vitamines (L-Alanine, L asparagine, Glycine, B12, Biotine, Acide ascorbique) qui sont peut-être importants pour la croissance des endozoïtes.L’atmosphère doit contenir de l’oxygène et doit être humide.L’âge des cellules est aussi un facteur important. En effet, des cellules jeunes sont plus permissives que des cellules âgées, il en est de même pour les cultures de Toxoplasma gondii.La taille de l’inoculum initial influe également sur la multiplication des parasites. Connaître les paramètres de croissance optimale est indispensable pour la production du vaccin vivant atténué.
Les infections expérimentales
Rongeurs et lagomorphes
De nombreux rongeurs de laboratoire comme les gerbilles (7), les lapins (85), les souris, les cobayes et les hamsters sont sensibles à l’infection ce qui permet d’étudier la besnoitiose aigue expérimentale. Par contre, ils développent des symptômes de différents types. Les cobayes et hamsters développent des signes nerveux alors que les souris ont un exsudat péritonéal avec un très grand nombre d’endozoïtes .Les lapins sont sensibles à l’infection artificielle avec des bradyzoïtes ou des tachyzoïtes. Ils développent des lésions similaires à celles des bovins en condition d’infestation naturelle avec d’abord une phase fébrile, puis des œdèmes et enfin des lésions cutanées .
Ruminants
Les moutons et les chèvres sont sensibles à l’infection expérimentale par voie parentérale. Les ovins développent uniquement un syndrome fébrile ; par contre, les caprins, outre le syndrome fébrile, présentent des œdèmes du cou et du museau, un épiphora et écoulement nasal, et des kystes cutanés sont trouvés à l’examen histologique .Lorsqu’on infecte des bovins, on observe en général une forme subaigüe avec un syndrome fébrile et l’apparition de kystes cutanés et oculaires, généralement sans phase d’œdème et sans sclérodermie.
Résistances aux agents physiques, chimiques et biologiques
Il est important de connaître la durée de vie des parasites dans les différents tissus et dans différents milieux de prélèvement pour optimiser les infestations expérimentales mais aussi pour optimiser les conditions de transport du matériel contaminé à des fins diagnostiques.
Résistance des formes prolifératives dans le sang
Travaux de Cuillé, Chelle et Berlureau en 1936
Pour leurs tests, ces auteurs ont utilisé du sang de bovin en phase fébrile qu’ils ont inoculé à des bovins issus de zone où la besnoitiose n’existait pas. Une partie du sang a été injectée par voie intraveineuse immédiatement après le prélèvement, une autre partie a été citratée et stockée soit cinq heures, soit vingt-quatre heures avant d’être injectée par voie intraveineuse. L’apparition d’un cortège de symptômes typiques a été utilisée comme critère de réussite de l’infestation et donc de viabilité de l’agent infectieux. La conclusion a été que les parasites pouvaient survivre cinq heures dans du sang citraté. Il est important de noter qu’il n’y a pas eu de recherche d’infections inapparentes ou subcliniques.
Travaux de Pols en 1960
Une étude préliminaire de Pols utilisant le protocole de Cuillé, Chelle et Berlureau a effectivement montré que les infestations étaient possibles avec du sang citraté stocké plus de cinq heures car des kystes cutanés ont été retrouvés
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Epidémiologie descriptive
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Table des matières
Introduction et historique
1. Epidémiologie descriptive
a. Répartition géographique
i. Histoire des foyers français
ii. Répartition mondiale
b. Animaux atteints
i. Espèces
ii. Age
iii. Sexe
iv. Mode d’élevage
c. Saison
d. Besnoitiose maladie/portage asymptomatique
2. Epidémiologie analytique
a. Transmission lors de cohabitation
b. Transmission iatrogène
c. Rôle des arthropodes piqueurs
i. Mouche tsétsé (Glossina brevipalpis)
ii. Tabanidés
iii. Stomoxes (Stomoxis calcitrans)
iv. Culex et autres moustiques
v. Conclusion partielle sur les arthropodes
d. Autres type de transmission
e. Transmission par ingestion d’oocystes
i. Travaux de Peteshev
1. Première expérience
2. Deuxième expérience
3. Troisième expérience
ii. Travaux de Diesing
iii. Conclusion partielle
3. Epidémiologie synthétique
a. Le cycle primaire
b. Le cycle secondaire
Etude du parasite
1. Place dans la classification
a. Classification à partir de critères phénotypiques
b. Classification à partir de critères moléculaires
c. Besnoitia besnoiti et Besnoitia caprae
d. Besnoitia besnoiti souche bovine et Besnoitia besnoiti souche sauvage
2. Morphologie
a. Le kyste
b. Les zoïtes
i. Le cytosquelette
ii. Le complexe apical
iii. Les membranes
iv. Organelles
v. Les bradyzoïtes
vi. Les tachyzoïtes, forme proliférative
vii. Les oocystes
3. Culture et isolement de souches
a. Intérêt de la culture de souches de Besnoitia besnoiti
b. Type de cellule utilisé
c. Conditions optimales
d. Les infections expérimentales
i. Rongeurs et lagomorphes
ii. Ruminants
4. Résistances aux agents physiques, chimiques et biologiques
a. Résistance des formes prolifératives dans le sang
i. Travaux de Cuillé, Chelle et Berlureau en 1936
ii. Travaux de Pols en 1960
b. Résistance dans les kystes_
5. Physiopathologie (à partir de différents apicomplexa)
a. Le déplacement des parasites extracellulaires
b. Le mode d’invasion des cellules hôtes
c. La formation des pseudokystes et des kystes
d. La reproduction asexuée (sur cultures cellulaires)
e. La reproduction sexuée
Symptômes et lésions
1. Symptômes
a. Phase fébrile
b. Phase des œdèmes
c. Phase de sclérodermie
d. Atteinte de l’appareil reproducteur
i. Chez le mâle
ii. Chez la femelle
2. Lésions
a. Lésions macroscopiques
b. Lésions microscopiques
i. Phase fébrile et phase des œdèmes
ii. Phase de sclérodermie
Diagnostic
1. Suspicion épidémiologique
2. Diagnostic clinique
a. A partir des symptômes généraux
b. A partir des symptômes cutanés et oculaires
3. Diagnostic différentiel
a. Symptômes généraux
b. Symptômes cutanés
4. Diagnostic expérimental
a. Diagnostic direct au microscope
a. Histologie
b. Cytologie
b. Diagnostic biologique
a. Les différentes méthodes existantes
i. Le SFT (Sabin Feldman Dye Test)
ii. La fixation du complément
iii. L’immunodiffusion en gel
iv. L’immunofluorescence indirecte (IFT, IFAT)
v. L’ELISA: Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay
vi. Le Western Blot 2
vii. Les PCR
b. Les comparaisons des méthodes de diagnostic
c. Conclusion partielle
Traitement
1. Diurétiques et saignées
2. Formol et Lugol
3. Anti-infectieux
a. Travaux de Pols en 1960
b. Travaux de Shkap en 1985 et 1987
i. In vivo sur des gerbilles et in vitro
ii. Sur des lapins
c. Travaux de Cortes en 2007
4. Sur le terrain en France
a. Traitement en phase aigue ou en phase des œdèmes
b. Traitements en phase de sclérodermie
Prophylaxie
1. Prophylaxie médicale
a. Développement d’un vaccin vivant
b. Pistes de recherche d’un vaccin inactivé
2. Prophylaxie sanitaire
a. En zone indemne
b. En zone d’enzootie
1. Elimination des sujets porteurs de parasites
2. Contrôle des arthropodes piqueurs
i. Lutte contre les mouches adultes sur les bovins
ii. Lutte contre les mouches dans le milieu extérieur
Conclusion
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