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Microsporidies et microsporidioses
Historique Les microsporidies sont des eucaryotes unicellulaires, parasites intracellulaires obligatoires, responsables chez l’hôte de pathologies appelées microsporidioses. Au milieu du XIXème siècle, elles furent la cause d’épizooties qui contribuèrent à leur découverte. La plus importante, en raison de ses conséquences économiques sur l’industrie de la soie en Europe, fut la maladie du ver à soie ou pébrine. L’agent étiologique de cette maladie, Nosema bombycis, observé pour la première fois en 1857 par Nägeli, se développe dans l’intestin de la larve du ver à soie, puis se dissémine dans tous les organes, y compris les glandes séricigènes, rendant la larve incapable de tisser son cocon. En 1882, Balbiani proposa le terme de microsporidies (Microsporidium) pour désigner les parasites de type Nosema, en raison de la taille réduite des spores (quelques µm) qui assurent leur dissémination (Balbiani, 1882). Les microsporidies constituent aujourd’hui un groupe de parasites présents chez les animaux les plus divers, appartenant à toutes les classes de vertébrés (poissons, oiseaux, mammifères) ainsi qu’à différents groupes d’invertébrés tels que les mollusques, les arthropodes, les nématodes, les annélides, les cnidaires ou les myxosporidies (Canning et Lom, 1986; Wittner et Weiss, 1999; Didier et al., 2000). Quelques espèces infectent également certains protistes unicellulaires libres (Ciliophora ou Ciliés) (Foissner et Foissner, 1995) ou parasites comme les grégarines (Apicomplexa) (Vivier, 1975). Bien que très répandus dans tout le règne animal, ces parasites sont surtout prépondérants chez les arthropodes, en particulier les insectes, et chez les poissons ; les microsporidies sont une cause d’épizooties aux conséquences économiques parfois importantes dans les domaines de la sériciculture, de l’apiculture mais aussi en aquaculture (Becnel et Andreadis, 1999; Shaw et Kent, 1999). Chez les mammifères, la première infection causée par les microsporidies fut observée en 1922 chez des lapins atteints de paralysie (Wright et Craighead, 1922). L’examen du cerveau, de la moelle épinière et des reins révéla la présence d’un grand nombre de spores microsporidiennes, identifiées comme appartenant à une nouvelle espèce, Encephalitozoon cuniculi (Levaditi et al., 1923). Cette espèce, responsable d’encéphalites généralement associées à des néphrites, fut par la suite trouvée chez un grand nombre de mammifères, tels que les carnivores (renards), les rongeurs et les primates (Canning et Hollister, 1987; Didier et al., 1998; Desplazes et al., 2000; Didier et al., 2000). Plusieurs cas de microsporidioses ont aussi été décrits chez des animaux de laboratoire, des animaux domestiques (chiens, oiseaux) ainsi que des animaux de ferme (Snowden et al., 1998; Snowden et al., 1999; Wasson et Peper, 2000). Chez l’homme, le premier cas documenté et confirmé d’infection microsporidienne fut décrit en 1959 chez un garçon âgé de 9 ans souffrant de fièvre, de vomissements, de maux de tête et de perte de connaissance (Matsubayashi et al., 1959). Auparavant, quelques publications firent état de microsporidioses humaines hypothétiques. Avant les années 1980, les microsporidioses sont rarement décrites chez l’homme et considérées comme des parasitoses accidentelles, le plus souvent consécutives à un déficit immunitaire transitoire ou irréversible du patient (Weber et al., 1994). Au début des années 1980, l’irruption etl’extension rapide du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA) ont eu pour conséquence un accroissement du nombre de cas de microsporidioses humaines et la découverte d’espèces jusqu’alors inconnues. En 1985, Desportes et al. observèrent ainsi pour la première fois la présence d’une microsporidie chez un patient atteint du SIDA présentant une diarrhée chronique (microsporidiose intestinale) ; les caractéristiques de ce parasite permirent de créer un nouveau genre et une nouvelle espèce de microsporidie : Enterocytozoon bieneusi (Desportes et al., 1985; Modigliani et al., 1985). Depuis, 9 autres nouvelles espèces ont été décrites chez des patients atteints du SIDA (Franzen et Muller, 2001) et plusieurs centaines de cas de microsporidioses chez des individus infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ont été rapportés à travers le monde entier (Bryan et Schwartz, 1999). Les microsporidies sont aujourd’hui considérées comme des pathogènes responsables d’infections opportunistes principalement chez les patients atteints de SIDA (Kotler et Orenstein, 1998; Franzen et Muller, 2001), mais aussi chez d’autres individus immunocompromis non infectés par le VIH tels que les sujets sous traitement immunosuppresseur à la suite d’une transplantation d’organes (Rabodonirina et al., 1996; Guerard et al., 1999; Metge et al., 2000; Mohindra et al., 2002). Plus récemment, quelques cas de diarrhées dues à une microsporidiose ont été rapportés chez des sujets immunocompétents non infectés par le VIH (Bryan et al., 1997; Desportes-Livage et al., 1998; Raynaud et al., 1998).
La spore
Unique stade extracellulaire, la spore constitue la forme de développement la plus caractéristique des microsporidies. Sa morphologie (taille, forme) varie selon les espèces, mais aussi parfois au sein d’une même espèce ; certaines microsporidies présentent ainsi différents types de spores selon le stade de leur cycle de vie. Ovoïdes, ellipsoïdes ou piriformes chez la plupart des microsporidies, les spores peuvent aussi avoir l’aspect de baguettes ou de bâtonnets. Chez les espèces pathogènes pour l’homme, elles mesurent entre 1 µm pour les plus petites (Enterocytozoon bieneusi) et 5 µm pour les plus grandes (Nosema ocularum). L’organisation de la spore est identique chez toutes les microsporidies (Figure 1). La spore est une cellule hautement spécialisée, dont la membrane plasmique est entourée d’une endospore et d’une exospore formant une paroi rigide. L’exospore, dense aux électrons, constitue la couche externe de la paroi et possède une structure très complexe de nature protéique (Bigliardi et al., 1996; Bigliardi et Sacchi, 2001). L’endospore, riche en chitine, est en contact direct avec la membrane plasmique de la spore ; son épaisseur est uniforme sur toute sa surface, excepté au niveau de l’apex (pôle antérieur) de la spore, où l’endospore est plus fine (Vavra et Larsson, 1999). La membrane plasmique délimite le contenu de la spore, à savoir le sporoplasme infectieux et l’appareil d’extrusion permettant l’infestation de la cellule hôte. Ce dernier est composé du polaroplaste, de la vacuole postérieure et du filament (ou tube) polaire, structure la plus caractéristique de la spore microsporidienne. La partie antérieure rigide et rectiligne du filament polaire est associée au disque d’ancrage, localisé sous la paroi à l’apex de la spore. Dans sa portion postérieure, le tube polaire s’enroule autour du sporoplasme et de la vacuole postérieure pour former plusieurs boucles, dont le nombre et l’arrangement (répartition en un ou deux rangs en coupe transversale) varient selon l’espèce et le genre de microsporidie (Sprague et al., 1992; Vavra et Larsson, 1999). Son diamètre peut être constant sur toute sa longueur ou variable. Des études récentes ont permis d’isoler et de caractériser les principales protéines associées au filament polaire (Delbac et al., 1998; Keohane et al., 1998; Keohane et Weiss, 1999; Weiss, 2001). Le polaroplaste désigne un ensemble organisé de membranes occupant la partie antérieure de la spore. Il comprend le polaroplaste vésiculaire, localisé dans la région médiane de la spore, et le polaroplaste lamellaire, formé de saccules membranaires aplatis qui entourent la portion rectiligne du filament polaire. Le reste de la spore est occupé par le sporoplasme, à savoir le noyau et le cytoplasme riche en ribosomes. Le noyau est unique ou présent sous la forme d’un diplocaryon (deux noyaux étroitement associés et fonctionnant comme une seule unité) selon les espèces.
La mérogonie
La phase proliférative ou mérogonie débute après l’inoculation du sporoplasme infectieux dans la cellule hôte (Figure 3). Les cellules en division, désignées par le terme de mérontes, sont entourées d’une membrane et possèdent un noyau simple ou présent sous la forme d’un diplocaryon ; leur cytoplasme est riche en ribosomes libres ou associés au réticulum endoplasmique (Cali et Takvorian, 1999). Les noyaux des mérontes subissent plusieurs divisions successives. Dans certains cas, la division du noyau est immédiatement suivie de celle du cytoplasme (Encephalitozoon, Nosema, Vittaforma). Dans d’autres cas, le cytoplasme ne se divise pas et les noyaux issus de plusieurs divisions demeurent groupés au sein d’un cytoplasme commun, aboutissant à la formation d’un plasmode mérogonial (Enterocytozoon, Pleistophora, Trachipleistophora). Selon les espèces, la mérogonie se déroule soit en contact direct avec le cytoplasme de la cellule hôte (Nosema, Enterocytozoon),soit à l’intérieur d’une vacuole parasitophore formée à partir de la membrane plasmique de la cellule hôte (Encephalitozoon) ou d’une couche amorphe sécrétée par le parasite (Pleistophora, Trachipleistophora). Dans le cas du genre Vittaforma, le reticulum endoplasmique de la cellule hôte se réorganise pour entourer les mérontes en division.
Les genres Pleistophora et Trachipleistophora
Les microsporidies appartenant au genre Pleistophora sont des parasites communément rencontrés chez les insectes et surtout chez les poissons. Ils présentent la particularité de sécréter au cours de la mérogonie une couche protéique, qui isole les mérontes du cytoplasme de la cellule hôte et délimite la vacuole sporophore dans laquelle s’effectue la sporogonie (Desportes-Livage, 2000). Seuls trois cas d’infections ont été rapportés chez l’homme : deux cas chez des patients infectés par le VIH et un cas chez un patient non infecté par le VIH (Ledford et al., 1985; Chupp et al., 1993). Ces microsporidies sont responsables de myosites, qui résultent de l’infection des muscles squelettiques. Un quatrième cas de myosite, associée à une sinusite et une kératoconjonctivite, a été diagnostiqué chez un patient australien au stade SIDA. La microsporidie responsable diffère des microsporidies du genre Pleistophora, du fait de certaines particularités ultrastructurales, notamment l’absence de formation de plasmode sporogonial au cours de la sporogonie. Ces observations ont donc conduit à la création d’un nouveau genre pour ce parasite, dénommé Trachipleistophora hominis (Field et al., 1996; Hollister et al., 1996). Récemment, deux cas sévères de microsporidioses disséminées avec des parasites similaires ont été décrits chez deux individus atteints de SIDA (Yachnis et al., 1996; Orenstein et al., 1997). Bien que présentant les caractéristiques ultrastructurales du genre Trachipleistophora, cette microsporidie se distingue de T. hominis par la formation de deux types différents de vacuoles sporophores et de spores au cours de la sporogonie ; elle a donc été classée comme une nouvelle espèce Trachipleistophora antropophtera (Vavra et al., 1998). Il s’agit de l’unique espèce dimorphique de microsporidie décrite chez l’homme.
Le genre Enterocytozoon
Enterocytozoon bieneusi est la seule espèce assignée au genre Enterocytozoon. Son développement s’effectue au contact direct du cytoplasme de la cellule hôte (Figure 4) et se singularise par la formation de plasmodes plurinucléés (Cali et Owen, 1990; Cali et Takvorian, 1999). Ces derniers présentent en microscopie électronique un aspect fissuré dû à la présence de formations membranaires rectilignes et brillantes aux électrons, qui persistent tout au long du cycle de développement intracellulaire. Les plasmodes mérogoniaux sont issus de la division des stades précoces uninucléés au cours de la mérogonie. La sporogonie est caractérisée par la différenciation du filament polaire et de ses annexes avant la formation des sporoblastes. Elle débute avec l’accumulation autour de chaque noyau d’inclusions denses aux électrons, structures précurseurs du filament polaire et du disque d’ancrage. Les plasmodes sporogoniaux se fragmentent ensuite en sporoblastes par invagination de la membrane qui les délimitent. Simultanément, un matériel dense aux électrons se dépose à la surface de celle-ci pour donner naissance à l’exospore. L’apparition tardive de ce matériel, sécrété dès le début de la sporogonie et avant la formation du filament polaire chez les autres microsporidies, est typique du développement d’E. bieneusi. La maturation des sporoblastes aboutit à la production de petites spores ovales (1,1 à 1,6 µm sur 0,6 à 0,9 µm), dont le filament polaire forme autour du noyau unique une double spirale comprenant 5 à 7 tours de spires (Vávra et Larsson, 1999).
La microscopie optique
Le diagnostic des microsporidioses intestinales humaines en microscopie optique a longtemps été handicapé par la faible taille des spores et leurs propriétés tinctoriales particulières et variables. En effet, les colorations classiques utilisées en cytologie (Gram, Giemsa) ou en histologie (hématoxyline-éosine, Gram) ne permettent pas de distinguer facilement les microsporidies des autres éléments présents dans les préparations, souvent en raison d’un manque de contraste. Cependant, la mise au point ces dernières années, de nouvelles techniques de coloration a permis d’améliorer grandement la détection des spores en microscopie optique (Franzen et Muller, 2001; Garcia, 2002). Ces nouvelles colorations sont basées sur l’utilisation d’agents chromotropes comme le chromotrope 2R (« trichrome de Weber »), ou de fluorochromes tels que l’Uvitex 2B ou le Calcofluor. La technique du trichrome développée par Weber et al. permet une détection spécifique des spores, mais la réalisation de cette coloration est longue et délicate (Weber et al., 1992a). Les colorations à l’Uvitex 2B ou au Calcofluor sont plus simples et plus rapides, mais elles nécessitent un microscope à fluorescence équipé de filtres particuliers pour l’observation des échantillons(Van Gool et al., 1993; Conteas et al., 1996). De plus, l’inconvénient majeur de cette méthode est le manque de spécificité des fluorochromes, qui réagissent non seulement avec la chitine de la paroi des spores, mais aussi avec celle présente dans la paroi des bactéries et des champignons (levures) contenus dans les selles des patients. Quelque soit la technique de coloration utilisée, la microscopie optique ne permet pas de déterminer avec certitude le genre et l’espèce de la microsporidie observée lors du diagnostic.
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Table des matières
Liste des abréviations
Résumé
INTRODUCTION
A- Microsporidies et microsporidioses
A-1 Historique
A-2 Taxinomie
A-2.1 Classification
A-2.2 Phylogénie
A-3 Cycle parasitaire
A-3.1 La spore
A-3.2 L’infestation
A-3.3 La mérogonie
A-3.4 La sporogonie
A-4 Les microsporidioses humaines
A-4.1 Les genres Pleistophora et Tracheipleistophora
A-4.2 Le genre Nosema
A-4.3 Le genre Vittaforma
A-4.4 Le genre Brachiola
A-4.5 Le genre Enterocytozoon
A-4.6 Le genre Encephalitozoon
A-5 Les microsporidioses intestinales humaines
A-5.1 Manifestations cliniques
A-5.2 Epidémiologie et transmission
A-5.3 Diagnostic
A-5.3.1 La microscopie électronique
A-5.3.2 La microscopie optique
A-5.3.3 Les anticorps polyclonaux et monoclonaux
A-5.3.4 La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
A-5.4 Traitement
B- L’immunité anti-microsporidienne
B-1 L’immunité à médiation humorale
B-2 L’immunité à médiation cellulaire
B-2.1 Rôle des lymphocytes T CD4+ et T CD8+
B-2.2 Rôle des cytokines
B-2.3 Rôle de l’activité cytotoxique des lymphocytes T CD8+
B-2.4 Rôle des cellules « natural killer » et des lymphocytes T TCRγδ+
B-2.4.1 Les cellules « natural killer » (NK)
B-2.4.2 Les lymphocytes T TCRγδ+
C- Chimiokines et réponse immunitaire
C-1 Définition et classification des chimiokines
C-2 Rôles des chimiokines dans la réponse immunitaire
D- L’immunité de la muqueuse intestinale
D-1 Les entérocytes
D-1.1 Les entérocytes, sources de chimiokines et de cytokines
D-1.2 Les entérocytes, cellules présentatrices d’antigènes
D-1.3 Rôle des entérocytes dans la réponse humorale intestinale
D-2 Les lymphocytes intraépithéliaux (LIEs)
D-2.1 Phénotype
D-2.2 Développement et origine des LIEs
D-2.3 Propriétés fonctionnelles des LIEs
D-2.4 Rôle des LIEs dans l’immunité anti-parasitaire
OBJECTIFS
MATÉRIELS ET MÉTHODES
A- Culture cellulaire
A-1 Les cellules RK13
A-2 Les entérocytes de la lignée Mode-K
A-2.1 Description de la lignée
A-2.2 Entretien de la lignée
B- Production et purification des spores du parasite
C- Lignées murines
C-1 Description des lignées utilisées
C-2 Protocole d’infection
D- Histologie
E- Préparation de suspension de cellules lymphoïdes à partir d’organes ou de tissus
E-1 Préparation des lymphocytes de la rate et des ganglions mésentériques
E-2 Purification des lymphocytes intraépithéliaux
F- Cytométrie de flux (FACS)
F-1 Analyse phénotypique des populations lymphocytaires
F-2 Détection des cytokines intracellulaires
G- Méthodes d’extraction des acides nucléiques
G-1 Extraction de l’ADN génomique
G-2 Extraction des ARN totaux
H- PCR en temps réel (« real-time PCR »)
H-1 Principe de la technique
H-2 Quantification de la charge parasitaire 8
H-3 Quantification de l’expression des ARNm par PCR en temps réel après transcription inverse (RT-PCR)
H-3.1 Synthèse des ADNc
H-3.2 Quantification des ADNc par PCR en temps réel
I- Test de cytotoxicité in vitro
I-1 Préparation, infection et marquage des macrophages péritonéaux
I-2 Séparation des lymphocytes intraépithéliaux CD8α+
I-3 Mesure de la cytotoxicité
J- Dosage des nitrites par la réaction de Griess
K- Analyse statistique des résultats
RÉSULTATS
A- Données parasitologiques et histologiques
B- Etude de la réponse immune cellulaire locale suite à l’infection orale par Encephalitozoon intestinalis
B-1 Evolution du nombre de lymphocytes intraépithéliaux et de leur phénotype
B-2 Activité cytotoxique in vitro des lymphocytes intraépithéliaux
B-3 Analyse de l’expression duodénale des ARNm spécifiques des cytokines et des chimiokines
ARTICLE : Role of gamma interferon in cytokine and chemokine expression in the duodenum of mice after oral infection with the microsporidium Encephalitozoon intestinalis
RÉSULTATS COMPLÉMENTAIRES
C- Etude de la réponse immune cellulaire au niveau systémique suite à l’infection orale par Encephalitozoon intestinalis
C-1 Analyse de la réponse immune cellulaire au niveau des ganglions mésentériques
C-1.1 Evolution du nombre de lymphocytes des ganglions mésentériques et de leur phénotype
C-1.2 Cinétique d’expression des ARNm spécifiques des cytokines au niveau des ganglions mésentériques
C-2 Analyse de la réponse immune cellulaire au niveau de la rate suite à l’infection orale avec E. intestinalis
C-2.1 Cinétique d’expression des cytokines au niveau de la rate
Annexe n°2 : Effets de composes anti-mitotiques sur la multiplication et le développement d’Encephalitozoon intestinalis en culture cellulaire in vitro
ARTICLE : In vitro activity of antimitotic compounds against the microsporidian Encephalitozoon intestinalis
Annexe n°3 : Mise au point d’une nouvelle méthode ELISA pour évaluer la multiplication des microsporidies en culture cellulaire in vitro
ARTICLE : A new monoclonal enzyme-linked immunosorbent assay to measure in vitro multiplication of the microsporidium Encephalitozoon intestinalis
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