Soutenance mémoire
Risque de cancer du sein controlatéral
Problématique, hypothèse et objectifs
Problématique
La méthylation de l’ADN, comme modification épigénétique, a été peu étudiée dans la littérature, malgré l’importance de cette dernière sur le développement et la progression du cancer. En ce qui concerne le risque du cancer du sein, seulement un petit nombre d’études ont examiné la méthylation de l’ADN surtout dans le sang, et elles ont montré que le profil de méthylation est différent chez les patientes atteintes d’un cancer du sein comparé à celui des femmes non atteintes (206, 237), mais sans identifier un marqueur spécifique. Donc, la relation entre la méthylation de l’ADN et le risque de développer un cancer du sein n’est pas encore claire.
La méthylation de l’ADN est un phénomène spécifique aux tissus étudiés. La meilleure façon d’étudier le risque de développer un CSC est de comparer les tissus normaux des femmes qui ont développé un CSC à des femmes qui n’en ont pas développé. Une disponibilité des tissus normaux suite à la chirurgie pour un CS peut être accessibles et ces tissus seront possiblement affectés de la même façon par la présence de la tumeur ce qu’on appelle l’effet de champ (voir section 4.2.1). Alors, la différence de méthylation de l’ADN entre les tissus normaux adjacents à la tumeur provenant de patientes qui ont développé un CSC pendant le suivi et celles qui n’ont pas développé permet d’étudier un vrai risque de développer un cancer du sein soit celui controlatéral en minimisant l’effet champ s’il existe.Nous proposons d’utiliser une approche génomique globale et spécifique de la méthylation de l’ADN dans une étude cas-témoins (1:1) appariée pour les facteurs identifiés comme facteurs de risques à la Section 1.3.2. Cette étude est nichée dans une cohorte de 1242 femmes avec un premier diagnostic de cancer du sein invasif non métastatique et des récepteurs œstrogènes positifs (ER+), diagnostiqués entre 2000 et 2007. Étant donné que le cancer du sein présente plusieurs sous-types, nous avons choisi pour nos analyses les femmes ayant des tumeurs ER+, car c’est le sous-type le plus répandu. Ainsi, nos résultats serviront de preuve de principe pour les autres sous-types. Cette approche permet d’identifier tous les changements dans la méthylation de l’ADN des gènes dans les tissus mammaires normaux adjacents à la tumeur associés au risque de développer un CSC.À ce jour, toutes les études qui ont évalué l’association entre la méthylation de l’ADN et le risque de cancer du sein ont été réalisées dans le sang ce qui ne reflète pas l’état exact de la méthylation dans le sein. Les études de méthylation de l’ADN dans les tissus fixés sont rares, et c’est pour cela qu’on ne trouve pas dans la littérature un protocole standard et validé pour l’extraction de l’ADN de ce type de tissu. Donc, le premier défi de notre projet était de récolter une quantité d’ADN suffisante et de qualité provenant des tissus mammaires épithéliaux normaux ayant été fixés au formol et enrobés en paraffine.
Hypothèse
L’hypothèse générale de mon projet est que les tissus mammaires épithéliaux normaux adjacents à la tumeur se caractérisent par plusieurs altérations épigénétiques et qu’ils contiennent des gènes hyper- et hypo-méthylés associés au risque de développer un CSC.
Objectifs
L’objectif général de mon projet est de regarder l’effet de la méthylation globale de l’ADN sur le risque de développer un CSC dans une étude cas-témoins nichée dans une cohorte de 1242 femmes avec cancer du sein. La différence de méthylation entre les cas et les témoins nous permettra d’identifier les gènes ainsi que les voies de signalisations affectées par ce changement de méthylation, qui sont impliqués dans l’augmentation du risque de développer un CSC.
Les objectifs spécifiques de l’étude sont :
1- L’identification des changements dans la méthylation globale de l’ADN dans les tissus mammaires normaux adjacents à la tumeur au moment du PCS entre les femmes qui ont développé un CSC (cas) et les femmes qui ne l’ont pas développé (témoins), en utilisant une approche du génome pangénomique.
2- L’identification des sites spécifiques différentiellement méthylés dans les tissus mammaires normaux adjacents à la tumeur au moment du PCS entre les femmes qui ont développé un CSC (cas) et les femmes qui ne l’ont pas développé (témoins).
Afin de procéder à ces objectifs, nous avons besoin d’une quantité suffisante d’ADN. Étant donné qu’il n’existe aucune méthode standard pour extraire de l’ADN des tissus normaux fixés au formol et enrobés en paraffine, la mise au point d’une méthode d’extraction est nécessaire pour identifier la meilleure méthode pour isoler de l’ADN de qualité et en quantité suffisante provenant d’échantillons fixés et inclus en paraffine. Cette mise au point est présentée dans le prochain chapitre.
Mise au point de la méthode d’extraction de l’ADN
Introduction
Notre question de recherche consiste à étudier l’effet de la méthylation sur le risque de développer un CSC. Afin de procéder, avec ceci, une quantité suffisante d’ADN de qualité est nécessaire. Dans la littérature, on trouve peu de protocoles d’extraction de l’ADN de tissus normaux fixés au formol et enrobés en paraffine. La majorité des protocoles existants sont efficaces pour une extraction d’ADN du sang ou bien des tissus tumoraux qui contiennent beaucoup de matériel. Alors, nous évaluerons plusieurs kits avec quelques petits changements pour trouver celui que conviendra le mieux pour nos besoins en utilisant des TMAs « tissue microarray » qui assemblent et concentrent les tissus mammaires épithéliaux normaux adjacents à la tumeur de chaque patiente.
Méthode
Construction des TMAs « tissue microarray »
L’identification des blocs de paraffine contenant des tissus épithéliaux normaux à une distance de 1 cm de la tumeur pour chaque patiente, avec une vérification microscopique des lames colorées à l’hématoxyline et l’éosine (H&E) de chaque bloc, sont réalisées pour identifier les lobules à poinçonner afin de construire les TMAs (Figure 3.1). Un TMA est réalisé avec 10 à 15 carottes de 1,5 mm pour chaque patiente prélevées de plusieurs blocs en paraffine et insérées toutes ensemble dans un nouveau bloc vierge pour avoir un bloc ou un TMA par patiente. Le TMA permet de concentrer les lobules normaux riches en épithéliums sur un même bloc. Une fois que le TMA est fait, on l’incube toute une nuit à 37 °C puis des coupes à l’aide d’un microtome sont réalisées et colorées par H&E pour valider la composition de chaque carotte. Tout TMA utilisé pour l’extraction était validé par un pathologiste.
Résultats
Préparation des échantillons
La première étape à suivre pour la mise au point du protocole pour l’extraction d’ADN est l’étape de déparaffinage des tissus parce qu’il existe plusieurs techniques, mais aucune validée pour une extraction sur de petits échantillons fixés en paraffine. La deuxième étape était la digestion par la protéinase K, parce qu’avec une extraction de faible quantité de l’ADN on peut assembler beaucoup de matériels (acide ribonucléique, protéine) qui biaiseraient la qualité. Alors, nous avons essayé les différents kits proposés dans la littérature pour l’extraction de l’ADN des tissus tumoraux/normaux pour trouver celui qui génère le rendement le plus élevé et qui nous permettra de procéder à nos analyses de méthylation (Tableau 3.1).
Nous avons avant tout, estimé le nombre de coupes de tissus et de tubes à préparer pour chaque patiente. On a donc essayé de réaliser l’extraction pour des tubes contenant 10, 20 ou 30 coupes de TMA. L’épaisseur des coupes était de 10 µm, ce qui représente l’épaisseur idéale selon la littérature (239). Après la préparation des tubes, on a remarqué que les tubes qui contiennent 20 et 30 coupes nous donnent une quantité presque nulle d’ADN, et cela peut être dû à la grande quantité de paraffine qui bouche le tube (filtre). On a essayé aussi de préparer plusieurs tubes pour chaque patiente afin de collecter la quantité la plus élevée d’ADN. Après chaque tube, une coupe avec coloration à l’H&E est réalisée afin de vérifier la composition de chaque carotte. On a remarqué qu’après le 2e tube, le pourcentage des lobules devient trop faible. Alors on a procédé à l’extraction avec 2 tubes contenant chacun 10 coupes de 10 µm pour TMA.
Choix de kit
Le premier kit essayé est le GeneJet FFPE DNA purification kit de Thermo Scientific. Plusieurs essais de ce kit selon les instructions du fabricant ont été réalisés (5 essais). Comme dans tout kit d’extraction, l’échantillon est mélangé avec un tampon de lyse qui permet de rompre les membranes des cellules, puis ce mélange est déposé dans une colonne contenant une membrane de silicate qui permet de fixer l’ADN. Seul l’ADN se lie à cette membrane, les protéines et autres impuretés sont éliminées grâce à deux lavages. L’ADN est ensuite récupéré par centrifugation, grâce à un tampon d’élution de pH basique et de faible concentration ionique, dans un tube stérile. Le rendement des purifications avec GeneJet FFPE DNA purification kit était assez faible de 10 ng/µl dans 60 µl tandis que nous visions 30 ng/µl pour le même volume. Des essais d’augmentation du nombre des carottes dans le TMA pour arriver à 30 carottes/TMA ont été réalisés, mais le rendement n’a pas vraiment augmenté. Nous avons dû faire quelques petites modifications au protocole pour essayer d’augmenter le rendement. Par exemple, nous avons donc augmenté la durée de déparaffinage à 90 °C de 3 min à 6 min (pour bien déparaffiner) ainsi que la durée de digestion (incubation de protéinase K) à 56 °C de 50 min à 90 min (en supposant que la membrane soit bouchée), mais le rendement était toujours faible, donc nous n’avons pas réussi à avoir plus que 15ng/µl dans 60 µl. Alors, nous avons essayé un autre kit. Pour tenter d’améliorer l’extraction
et le rendement, nous avons cherché dans la littérature et on a trouvé deux kits : le GeneRead DNA FFPE de Qiagen pour l’extraction de l’ADN du sang/ tissus et le kit QIAamp DNA FFPE tissue de Qiagen pour l’extraction de l’ADN des tissus. Ces deux kits diffèrent par une simple solution, la solution AL (lysis buffer) du kit GeneRead DNA FFPE de Qiagen qui est remplacée par la solution ATL (tissu lysis buffer), car selon Qiagen : « Le tissu est plus difficile à lyser que les cellules dans un échantillon ». Par conséquent, une étape d’incubation supplémentaire dans le tampon ATL contenant de la protéinase K est incluse dans le protocole pour tissus afin d’obtenir une lyse complète des échantillons. Alors, nous avons procédé à la mise au point avec ces deux kits, pour arriver à obtenir l’ADN nécessaire pour notre étude de méthylation.
Déparaffinage des tissus
Pour commencer la mise au point du protocole d’extraction, plusieurs techniques pour le déparaffinage sont proposées dans la littérature. Un déparaffinage par xylène/toluène est une technique qui permet l’élimination de paraffine suivie d’une réhydratation des tissus avec l’éthanol. Cette technique est la technique la plus utilisée pour l’extraction de l’ADN des tissus tumoraux, car elle permet d’avoir une quantité suffisante d’ADN avec un rendement élevé. La deuxième technique était un simple déparaffinage avec la solution de déparaffinage. Nous travaillons avec des tissus mammaires normaux adjacents à la tumeur qui présentent un petit nombre de lobules et on ne s’attend pas à extraits une grande quantité d’ADN. Nous avons essayé les deux types de déparaffinage, et après plusieurs essais, un déparaffinage par le xylène en utilisant le kit GeneRead DNA FFPE nous a donné 12 ng/µl dans 50 µl tandis qu’une quantité de 20 ng/µl était obtenue avec la solution de déparaffinage. Pour le kit QIAamp DNA FFPE tissus, un déparaffinage par le xylène donne un rendement de 25 ng/µl dans 50 µl tandis qu’un rendement de 45 ng/µl était obtenu pour le même kit avec la solution de déparaffinage selon les instructions du fabricant. Donc, le déparaffinage avec le xylène nous fait perdre presque la moitié de nos ADN et la meilleure quantité était obtenue par le kit QIAamp DNA FFPE tissus. En ce qui concerne la qualité des échantillons déparaffinés, le ratio de 260/230 (qui doit être entre 1,50 et 2,00 pour un état pur de l’ADN) était de 1,00 pour un déparaffinage avec le xylène en utilisant le kit GeneRead DNA FFPE, ce qui représente un faible état de pureté. Cependant, l’incubation avec la solution de déparaffinage à 56 °C pour 3 minutes nous a donné une qualité plus élevée avec un ratio de 1,20 pour le même kit et ces résultats étaient similaires pour le kit QIAamp DNA FFPE tissus (un ratio de 1,00 pour le xylène et 1,20 pour la solution de déparaffinage). Malgré que la pureté de l’ADN (ratio 260/230) n’était pas parfaite pour les deux types de déparaffinage, la solution de déparaffinage nous a tout de même donné une quantité suffisante de matériel et un niveau de pureté plus élevé.
Digestion par protéinase K
Après plusieurs essais de déparaffinage de l’ADN soit avec la solution de déparaffinage ou avec le xylène (environ 20 échantillons), la pureté des échantillons n’était pas optimale donc nous avons dû modifier le protocole pour améliorer la digestion afin d’augmenter la pureté (ratio 260/230) de nos échantillons. La digestion des échantillons est faite en utilisant la protéinase K. Le rôle de la protéine K est de digérer les cellules et les nucléases. Nous avons essayé d’augmenter le temps d’incubation avec la protéinase K pour les 2 types de déparaffinage, afin d’augmenter la pureté de nos échantillons. En ce qui concerne le déparaffinage par xylène, aucune amélioration de la pureté n’a été remarquée contrairement aux résultats obtenus avec la solution de déparaffinage. En approfondissant nos recherches, nous avons trouvé des études récentes qui ont testé l’effet de l’incubation de la protéinase K à différents intervalles de temps (3h, 24h, 48h et 72h) sur la pureté de l’ADN des échantillons extrait (240-242), tout en ajoutant la protéinase K à chaque 24h lorsque possible. Nous avons testé ces différents temps sur plusieurs échantillons (5 patientes avec 4 tubes chacune) et chacun de ces tubes était incubé à un de ces intervalles de temps avec la solution de déparaffinage. Après ces essais nous avons trouvé qu’une incubation de 3 h donne un ratio 260/230 de 1,20. Pour celles de 24h et 48h le ratio monte à 1,40 et 1,60 respectivement, mais la meilleure qualité a été obtenue avec une incubation de 72h dont le ratio de 260/230 est de 1,70. Alors, nous avons remarqué que la pureté des échantillons est proportionnelle au temps d’incubation avec la protéinase K.
Conclusion
Protocole d’extraction
Après avoir mis au point toutes les différentes étapes de l’extraction de l’ADN, nous avons choisi d’alterner entre les 2 kits de Qiagen. Dans un premier temps, le kit GeneRead DNA FFPE pour le déparaffinage avec la solution de déparaffinage, puis ensuit le kit QIAamp DNA FFPE tissue pour l’incubation de la protéinase K pendant 3 jours dans la solution ATL, avec lequel nous avons poursuivi le reste du protocole en suivant les instructions du fabricant.
Nos échantillons ont par la suite été envoyés à Génome Québec pour étudier la méthylation de l’ADN, qui a été réalisée selon le protocole suivant :
En utilisant les TMAs de chaque patiente, deux tubes contenant 10 coupes de 10 µm ont été préparés. Des coupes colorées à l’H&E entre chaque tube ont été faites et les composantes cellulaires des carottes étaient vérifiées par une pathologiste (éligibilité selon nos critères et l’absence de la tumeur). L’extraction de l’ADN a débuté par le déparaffinage de tissus avec 160 µl de solution de déparaffinage (Qiagen) et les tubes incubés à 56 degrés pour 3 min (GeneRead DNA FFPE). Ce processus a été répété deux fois afin d’éliminer toute la paraffine. Ensuite, nous avons ajouté 180 µl du tampon ATL (Qiagen) avec 20 µl de la protéinase K (Qiagen) ajoutée toutes les 24h (240), les tubes ont été incubés avec ce mélange pendant 3 jours à 56 degrés (afin d’augmenter la digestion des protéines et d’avoir une qualité plus élevée de l’ADN). Une fois cette première étape réalisée, nous avons incubé les tubes à 90 degrés pour 1h, ensuite, nous avons séparé les deux phases obtenues, déposé la phase claire (ADN+ ATL+ Protéinase K) dans un nouveau tube et nous avons jeté la phase bleue (paraffine et solution de déparaffinage). Par la suite, nous avons poursuivi le protocole du kit QiAamp DNA FFPE tissus de Qiagen selon les instructions du fabricant, en réalisant toutes les étapes, y compris les deux lavages. Nous avons élué les échantillons d’ADN deux fois avec 50 µl d’eau exempte de nucléase pour atteindre un volume d’élution final de 100 µl/ tube. Une concentration des échantillons d’ADN de 60 ng/µl pour 20 µl était nécessaire afin de réaliser l’analyse de méthylation. Pour cela, quelques ADN extraits ont été concentrés par speedVac et ensuite suspendus dans l’eau exempte de nucléase pour obtenir la quantité minimale nécessaire de 1200 ng totaux d’ADN mesuré par nanodrop 2000.
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Table des matières
Chapitre 1. Introduction
1.1 Le cancer
1.2 Cancer du sein
1.2.1 Épidémiologie
1.2.2 Étiologie
1.2.2.1. L’origine du cancer du sein
1.2.3 Facteurs de risque du cancer du sein
1.2.4 Traitement du cancer du sein
1.3 Cancer du sein controlatéral
1.3.1 Épidémiologie
1.3.2 Facteurs de risque de cancer du sein controlatéral
1.4 Épigénétique
1.4.1 Historique
1.4.2 Modifications covalentes des histones
1.4.3 Le positionnement des nucléosomes
1.4.4 L’expression de l’ARNs non-codants
1.4.5 La méthylation de l’ADN
1.4.5.1 Historique
1.4.5.2 Mécanisme de méthylation
1.4.5.3 Rôle de la méthylation dans le développement cellulaire
1.4.5.4 Implication de la méthylation de l’ADN dans le cancer
1.4.5.5 Thérapie épigénétique
1.4.6 La méthylation de l’ADN dans le cancer du sein
1.4.6.1 Méthylation des gènes spécifiques dans les tissus mammaires normaux
1.4.6.2 Méthylation globale de l’ADN
1.5.1.1 Enzymes de restriction
1.5.1.2 LUMA : « LUminometric Methylation Assay »
1.5.2 Les techniques non enzymatiques
1.5.2.1 Immunoprécipitation de l’ADN méthylé (MeDIP)
1.5.2.4 Clonage et séquençage
1.5.2.5 Pyroséquençage
1.6 Différents types d’échantillons pour la recherche
Chapitre 2. Problématique, hypothèse et objectifs
2.2 Hypothèse
Chapitre 3. Mise au point de la méthode d’extraction de l’ADN
3.1 Introduction
3.2 Méthode
3.3 Résultats
3.3.1 Préparation des échantillons
3.3.2 Choix de kit
3.3.3 Déparaffinage des tissus
3.3.4 Digestion par protéinase K
3.4 Conclusion
Chapitre 4. Matériels et Méthodes
4.1 Sélection des groupes
4.1.1 Collecte d’échantillons
4.2 Sélection des tissus
4.2.1 Effet de champ
4.3 Extraction de l’ADN
4.4 Contrôle de qualité
4.5 Conversion de bisulfite
4.6 Restauration de l’ADN
4.7 Illumina infinium 450k
4.8 Analyse bio-informatique et statistique
Chapitre 5 : Résultats
5.1 Méthylation de l’ADN et cancer du sein controlatéral
5.1.1 Caractéristiques de la population pour l’étude principale
5.1.2 Méthylation globale de l’ADN et le risque de cancer du sein controlatéral
5.1.3 Différence de la méthylation globale de l’ADN selon la localisation des CpGs
5.1.4 Identification des sites différentiellement méthylés reliés au développement du cancer du sein controlatéral
5.1.5 Identification des régions différentiellement méthylées reliées au développement du cancer du sein controlatéral
5.2 Méthylation de l’ADN et cancer du sein
5.2.1 Caractéristiques de la population pour l’étude secondaire
5.2.2 Méthylation globale de l’ADN et le risque de cancer du sein
5.2.3 Différence de la méthylation globale de l’ADN selon la localisation des CpGs 76
5.2.4 Identification des sites différentiellement méthylés reliés au développement du cancer du sein
5.2.5 Identification des régions différentiellement méthylées reliées au développement du cancer du sein
5.3 Identification des gènes impliqués dans le développement d’un cancer du sein primaire et controlatéral par chevauchement des résultats entre les deux études.
Chapitre 6. Discussion et conclusion
6.1 Discussion
6.2 Conclusion
6.3 Perspective
Bibliographies
Annexe
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