Rhéomètre à cellule unique : mesurer les propriétés viscoélastiques de cellules non adhérentes

Rhéomètre à cellule unique

Le rhéomètre à cellule unique est un outil basé sur l’utilisation de micropipettes. Une micropipette rigide permet de maintenir une cellule et de lui présenter un objet qui est ici une bille de polystyrène de 20 µm de diamètre couverte d’anticorps. Cette bille est maintenue par une micropipette flexible . La micropipette rigide est reliée à un réservoir d’eau qui permet de contrôler la pression d’aspiration (∆p) à l’intérieur de la micropipette. La pression d’aspiration est de nature hydrostatique et la différence de pression s’écrit : ∆p = ρg∆h où ρ est la masse volumique de l’eau, g l’accélération de la pesanteur et ∆h la différence de hauteur de la colonne d’eau par rapport à la valeur d’équilibre (le « zéro de pression ») où la cellule n’est ni poussée ni aspirée par le fluide de la micropipette. Pour mesurer cette pression d’aspiration avec laquelle la cellule sera aspirée, nous mettons d’abord le réservoir à une hauteur h où ∆p est nulle (où une cellule n’est ni aspirée ni soufflée de l’extrémité de la pipette). Nous pouvons ensuite abaisser le niveau du réservoir d’eau pour appliquer une pression d’aspiration contrôlée. Une cellule est aspirée dans la micropipette rigide avec un ∆p de 20 Pa, ce qui revient à diminuer de 2 mm (∆h=2mm, moyennant g∼10 m.s−2 ) la hauteur du réservoir d’eau par rapport à la valeur d’équilibre (figure 1.1 page ci-contre). La pression d’aspiration de la micropipette flexible est appliquée par un microinjecteur qui détend un volume d’air en amont du liquide qui remplit l’extrémité de la micropipette flexible par montée capillaire. Cette pression d’aspiration n’est pas finement contrôlée, et est très largement supérieure à 20 Pa (de l’ordre de plusieurs kPa [Basu et al., 2016]). Cette forte pression d’aspiration évite que la bille ne soit arrachée par la cellule quand celle-ci commence à s’étaler sur la bille. Une fois ces ajustements de pression d’aspiration réalisés, nous aspirons une cellule avec la micropipette rigide et une bille avec la micropipette flexible.

Fabrication des micropipettes

Pour fabriquer une micropipette, nous partons d’un capillaire en verre borosilicate de 1.0 mm de diamètre extérieur et de 0.78 mm de diamètre intérieur (Harvard Apparatus). Nous plaçons ce capillaire dans une étireuse (P-97, Sutter Instruments). Dans l’étireuse, le capillaire passe dans un filament qui va chauffer et faire entrer le verre borosilicate en fusion pendant un temps contrôlé pour ensuite tirer le capillaire à ses extrémités avec une vitesse également contrôlée. L’étireuse fonctionne avec un programme qui fixe différents paramètres (température de chauffe, vitesse de traction etc.) et permet d’obtenir des pipettes de profil désiré et reproductible.

Micropipettes rigides

À partir d’un capillaire étiré, nous utilisons une microforge (MF-200, World Precision Instruments) pour contrôler le diamètre de l’extrémité de la micropipette qui va servir à aspirer la cellule. La microforge est équipée d’une bille de silice placée sur un filament . Quand un courant électrique passe dans ce filament, la bille de silice est chauffée. Pour contrôler le diamètre de l’extrémité de la micropipette, nous plaçons un capillaire étiré dans cette bille silice chauffée. Le verre borosilicate de la micropipette a une température de fusion supérieure à celle de la silice. Le verre de silice à l’état liquide rentre dans la micropipette. L’arrêt du chauffage du filament de la microforge fait solidifier très rapidement le verre de silice. Grâce à une translation micrométrique, la séparation mécanique de la micropipette et de la bille de silice fait casser l’extrémité de la micropipette à l’endroit où le verre de silice a formé un ménisque à l’intérieur de la micropipette. Nous mesurons le diamètre de la micropipette (3 à 5 µm) à l’aide d’une mire placée dans un oculaire de la microforge.

Micropipettes flexibles 

Deux types de micropipettes flexibles Ces micropipettes peuvent être ouvertes à leur extrémité pour pouvoir aspirer une bille (figure 1.5a page suivante), ou terminées par une bille de verre et sont alors appelées microindenteurs [Guillou et al., 2016a, Sawicka et al., 2017]. Dans les deux cas, un objet sphérique se trouve à l’extrémité de ces micropipettes flexibles. La sphère se trouvant à l’extrémité de ces micropipettes sert à indenter la cellule.

Fabrication d’un microindenteur Pour fabriquer un microindenteur, nous utilisons la microforge qui nous sert à couper l’extrémité des micropipettes. La micropipette flexible est doucement insérée dans la bille de silice en fusion de la microforge puis en est retirée alors que la bille est encore en fusion. Du verre provenant de la bille en fusion est alors entraîné avec la miropipette flexible et se refroidit une fois sorti de la bille en fusion. En réchauffant la bille de silice, nous refaisons fondre le verre se trouvant à l’extrémité de la micropipette flexible. Sous l’effet de la tension de surface du verre, une goutte (quasi-)sphérique se forme à l’extrémité de la micropipette .

Calibration d’un microindenteur

Nous calibrons chaque microindenteur (c’est-à-dire que nous mesurons sa raideur en flexion k) pour pouvoir mesurer la force que le celui-ci va exercer sur la cellule. Pour cela, Julien Husson et ses collègues ont développé un dispositif contrôlant le mouvement de la platine piezoélectrique [Guillou et al., 2016a, Basu et al., 2016, Sawicka et al., 2017]. Ce dispositif nous permet de calibrer avec précision la raideur d’une pipette flexible.

Nous utilisons une sonde de force commerciale qui a une raideur en flexion connue (Aurora Scientific, modèle 406A) qui nous permet de calibrer des microindenteurs de référence d’une raideur élevée. Avec un microindenteur de référence nous calibrons un microindenteur de deuxième génération d’une raideur moins élevée (d’environ 1 nN/µm). La raideur de ces microindenteurs de seconde génération est beaucoup plus faible que celle du microindenteur de référence et est notée kstd. Notre microindenteur à calibrer a une raideur kind. Les deux extrémités des microindenteurs sont placées l’une contre l’autre et se trouvent à la position 0  . Le microindenteur à calibrer est translaté d’une distance x sur l’axe de translation de la platine piezoélectrique (perpendiculairement au corps des deux microindenteurs).

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Table des matières

Introduction générale
1 Rhéomètre à cellule unique : mesurer les propriétés viscoélastiques de cellules non adhérentes
1 Introduction
2 Rhéomètre à cellule unique
3 Quantifier les propriétés viscoélastiques de cellules non adhérentes
4 Différentes configurations du rhéomètre
2 Mécanique de la phagocytose
1 Introduction
2 Résultats
3 Discussion
4 Matériel et Méthodes
3 Single-cell immuno-mechanics : large cell-type-specific viscoelastic changes during white blood cell activation
1 Introduction
2 Discussion
3 Materials and Methods
4 Supplementary Material
Conclusion générale
Discussion générale
Liste des symboles
Bibliographie

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