Soutenance mémoire
RESISTANCE DES BACTERIES AUX ANTIBIOTIQUES
Synthèse bibliographique
ENTEROBACTERIES
La famille des Enterobacteriaceae comprend de nombreux genres bactériens répondant à la définition suivante :
– Bacilles à Gram négatif ;
– immobiles ou mobiles grâce à une ciliature péritriche ;
– aérobies anaérobies facultatifs ;
– se développant aisément sur milieu ordinaire ;
– fermentant le glucose ;
– ne possédant pas d’oxydase ;
– possédant une catalase à l’exception de Shigella dysenterie ;
– réduisant les nitrates en nitrites (quelques exceptions parmi Erwinia)
– Non sporulés
Le nom d’entérobactéries a été donné parce que ces bactéries sont en général des hôtes normaux ou pathologiques, suivant les espèces microbiennes, du tube digestif de l’homme et des animaux. Mais ce caractère écologique n’est pas exclusif des entérobactéries pouvant proliférer en abondance dans l’environnement (sols et eaux) et participer aux grands cycles de dégradation des matières organiques.
Taxonomie
La famille des Enterobacteriaceae comprend actuellement 100 espèces répertoriées. Les espèces les plus communément isolées en bactériologie clinique appartiennent à 12 genres : Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Seratia, Shigella, Yersinia. On peut les classer selon le tableau 1.
Caractères bactériologiques
Les caractères morphologiques
Toutes les entérobactéries ont une morphologie habituellement typique de type bacilles à Gram négatif de 2-3 µ de long sur 0,6 µ de large, généralement polymorphes.
Les espèces mobiles les plus nombreuses le sont grâce à une ciliature péritriche.
Certaines sont immobiles (Klebsiella, Shigella, Yersinia pestis). La présence d’une capsule visible au microscope est habituelle chez les Klebsiella. La plupart des espèces pathogènes pour l’homme possèdent des fimbriae ou pili qui sont des facteurs d’adhésion(10, 29).
Les caractères culturaux
Les entérobactéries poussent facilement sur les milieux ordinaires en 24 heures à 37°C en aérobiose et en anaérobiose.
Leurs exigences nutritionnelles sont, en général, réduites et la plupart se multiplient en milieu synthétique avec une source de carbone simple comme le glucose(13, 31).
Les caractères biochimiques
C’est sur l’étude des caractères biochimiques que repose en pratique le diagnostic de genre et d’espèce qui ne doit être abordé qu’après que le diagnostic de famille ait été établi avec certitude(29)
ANTIBIOTIQUES
On appelle « Antibiotique » toute substance naturelle d’origine biologique élaborée par un organisme vivant, chimique produite par synthèse, ou semi synthétique obtenue par modification chimique d’une molécule de base naturelle ayant les propriétés suivantes:
– Activité antibactérienne
– Activité en milieu organique
– Une bonne absorption et bonne diffusion dans l’organisme.
Les antibiotiques ont la propriété d’interférer directement avec la prolifération des microorganismes à des concentrations tolérées par l’hôte(7).
Mode d’action
Les antibiotiques agissent à l’échelon moléculaire au niveau d’une ou de plusieurs étapes métaboliques indispensables à la vie de la bactérie.
Ils agissent par :
Toxicité sélective au niveau de la :
– Synthèse de la paroi bactérienne
– Membrane cytoplasmique
– Synthèse des protéines
– Acides nucléiques
Inhibition compétitive : dans ce cas l’antibiotique est un analogue structural, il interfère avec une fonction essentielle à la bactérie (8).
Critères de Classification
La classification des antibiotiques peut se faire selon :
L’Origine : élaboré par un organisme (naturel) ou produit par synthèse (synthétique ou semi synthétique)
Le Mode d’action : paroi, membrane cytoplasmique, synthèse des protéines, synthèse des acides nucléiques.
Le Spectre d’activité : Le spectre d’activité, antibactérien d’un antibiotique est destiné à caractériser l’activité microbiologique d’un antibiotique sur une espèce bactérienne en tenant compte des résistances naturelles et acquises(14).
La Nature chimique : très variable, elle est basée souvent sur une structure de base (ex: cycle β lactame) sur laquelle il y a hémi-synthèse(8).
BETA-LACTAMINES
Depuis leur première utilisation en 1942, les Bêtalactamines représentent la famille d’antibiotiques la plus largement développée et la plus diversifiée dans le monde. Cette utilisation est due à leur large spectre d’action, leur faible toxicité, leur efficacité et le faible coût de certaines molécules (15).
Mécanisme d’action
Le mécanisme d’action est le même pour toutes les molécules de la famille des βêta-lactamines.Les β-lactamines sont des inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne (synthèse du peptidoglycane) par inactivation des principales enzymes impliquées dans cette construction et regroupées sous le terme de PLP (Protéines Liant les Pénicillines)
• Transpeptidases
• Endo-peptidases
• Carboxypeptidases
En mimant la structure tridimensionnelle de la séquence D-Ala-D-Ala, les betâlactamines se comportent comme des inhibiteurs de la transpeptidase, enzyme essentielle à la synthèse de la paroi bactérienne. Elles forment un lien covalent avec l’enzyme et empêchent donc toute activité de celui-ci, les bêta-lactamines sont des substrats-suicides.
Ceci-dit, la liaison des β-lactamines aux PLP et l’arrêt de croissance qui s’en suit (effet bactériosptatique) ne suffisent pas à engendrer la mort cellulaire, l’effet bactéricide des β-lactamines résulte de l’activation d’enzymes lytiques bactériennes (auto lysine) suite à l’altération du peptidoglycane (Effet bactéricide)
RESISTANCE DES BACTERIES AUX ANTIBIOTIQUES
Définition de la résistance
Une souche est dite « résistante» lorsque la concentration d’antibiotique qu’elle est capable de supporter est notablement plus élevée que la concentration atteignable in vivo(19).
Mécanismes de résistances aux antibiotiques
Les principaux mécanismes de résistances des germes aux antibiotiques sont de trois ordres (38) :
1. L’antibiotique ne peut pas atteindre sa cible, soit par imperméabilité de la paroi (exemple : résistance à l’imipenème par défaut d’expression de la porine), soit par un mécanisme d’efflux (pompage actif de l’antibiotique hors de la cellule bactérienne).
2. L’antibiotique ne peut se fixer sur sa cible il peut y avoir une cible supplémentaire ou une baisse de l’affinité par modification de la cible.
3. L’antibiotique peut être inactivé avant d’atteindre sa cible : il s’agit alors le plus souvent d’un mécanisme enzymatique avec notamment les bêta-lactamases, et il s’agit dans ce cas d’un mécanisme de résistance majoritaire universellement répandu à travers de très nombreux genres bactériens.
PORTAGE INTESTINAL DES BETA-LACTAMASES A SPECTRE ELARGI
Epidémiologie
La majorité des BLSE dérive des enzymes TEM ou SHV. Il existe maintenant plus de 90 bêta-lactamases de type TEM et plus de 25 bêta-lactamases de type SHV. TEM et SHV sont le plus souvent retrouvés chez Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae, d’ailleurs la 1ère bêta-lactamase (TEM-1) a été décrite chez E. Coli à partir d’une hémoculture d’un patient qui s’appelait TEMONIERA en Grèce, d’où la désignation TEM, mais ceci n’exclut pas le fait qu’on les retrouve aussi chez Proteus, Providencia et d’autres genres de la famille des Enterobactériaceae. Si les plus classiques des BLSE appartiennent aux familles TEM et SHV il en existe aujourd’hui de nouvelles très différentes sur le plan génétique notamment les CTX-M(39).
Identification biochimique des isolats
L’identification des isolats sélectionnés a été faite par des galeries Api 20E.
Principe
La galerie Api 20E comporte 20 puits (micro tubes) contenant des substrats sous forme déshydratée. Les tests sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la période d’incubation se traduisent par des virages colorés spontanées ou révélés par l’addition de réactifs.
Techniques
• Préparation de la galerie :
Réunir fond et couvercle d’une boîte d’incubation et répartir de l’eau dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide. Déposer stérilement la galerie dans la boîte d’incubation.
• Préparation de l’inoculum :
Faire une suspension bactérienne, dans une ampoule de Suspension Medium ou dans un tube d’eau distillée stérile, d’opacité légère avec une seule colonie prélevée sur un milieu gélosé.
• Inoculation de la galerie :
Remplir les tubes et les cupules des tests : CIT, VP, GEL avec la suspension bactérienne. Remplir uniquement les tubes des autres tests. Créer une anaérobiose dans les tests : ADH, LDC, ODC, URE, H2S en remplissant leurs cupules d’huile de paraffine. Refermer la boîte d’incubation et la placer à 35-37°C pendant 18 à 24 heures.
• Détermination de l’espèce bactérienne :
Cette détermination est faite en faisant appel à un catalogue Api 20 E
Etude de la sensibilité aux Antibiotiques
Les souches isolées sont soumises à une identification des profils de résistance grâce à un antibiogramme par méthode de diffusion des disques imprégnés d’antibiotiques en mesurant leurs diamètres d’inhibition.
Principe
L’antibiogramme consiste à utiliser différents disques imprégnés d’antibiotiques (Oxoid) que nous avons déposés sur une gélose Mueller-Hinton (Annexe 4) ensemencée par la bactérie à étudier. Après 18 à 24h d’incubation à 37°C, la zone d’inhibition de croissance bactérienne est mesurée à l’aide d’une règle, et les diamètres d’inhibitions sont traduits en sensible (S), intermédiaire (I) ou résistante (R) selon les recommandations du Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie CA-SFM, 2013.
Préparation de l’inoculum
Nous avons prélevé une colonie d’une bactérie que nous avons transvasée dans un tube contenant 3 ml d’eau physiologique stérile. Nous avons ajusté la densité de l’inoculum à celle de l’étalon, c’est-à-dire, à 0,5 Mac Farland en y ajoutant soit un fragment de colonie soit de l’eau physiologique.
Ensemencement des boîtes :
Nous avons trempé un écouvillon stérile sec dans l’inoculum et éliminé l’excès par essorage, puis nous avons ensemencé par stries toute la surface de la boîte à gélose Mueller-Hinton (Annexe 1). Enfin nous avons laissé sécher la boîte pendant quelques minutes à température ambiante avec le couvercle fermé.
Le choix des ATB est fait selon leur classification : β-lactamines, aminosides, quinolones, macrolides… Permettant ainsi l’interprétation de l’antibiogramme.
antibiotiques ont été testés.
L’antibiotique AMC, formé de l’Amoxicilline combiné à l’Acide Clavulanique qui est un inhibiteur des β-lactamases, est placé entre deux C3G (Céfotaxime « CTX » ,Ceftazidime « CAZ »), une C4G, (Cefepime« FEP »), un Monobactame (Azetronam «ATM») pour visualiser une éventuelle présence de synergie entre l’AMC, la CTX, la CAZ ,la FEP, dite en bouchon de champagne. Un Carabpénèmes, un Ertapénèmes « ETP », et un Fluoroquinolone (Ciprofloxacine « CIP»). La disposition des disques d’ATB est faite à l’aide d’une pince stérile.
Lecture
Après une incubation de 18-24h à 37°C en atmosphère ambiante, nous avons mesuré le diamètre de chaque zone d’inhibition en millimètre. Les résultats sont interprétés en fonction des diamètres critiques figurant dans des tableaux d’interprétation fournis par le fabricant de disque.
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Table des matières
PRESENTATION DE LA STRUCTURE D’ACCUEIL
INTRODUCTION
PARTIE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. ENTEROBACTERIES
II. ANTIBIOTIQUES
III. BETA-LACTAMINES
VI. RESISTANCE DES BACTERIES AUX ANTIBIOTIQUES
V. PORTAGE INTESTINAL DES BETA-LACTAMASES A SPECTRE ELARGI
PARTIE II : MATERIEL & METHODES
I. PRELEVEMENTS
II. PRIMO-CULTURE
III. CULTURE ET ISOLEMENT
IV. CARACTERISATION DES GERMES
V. IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE DES ISOLATS
VI. ETUDE DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
VII. TEST DE SYNERGIE
PARTIE III : RESULTATS & DISCUSSION
I. RESULTATS
II. DISCUSSION
CONCLUSION & PERSPECTIVES
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