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Morphologie du Candida
Elle se caractérise par un polymorphisme dépendant de l’environnement qui l’entoure (le pH, la température, la richesse du milieu ou la pression immunitaire de l’hôte), en adoptant deux formes bien distinctes : la forme levure et la forme mycélienne [12].
La forme levure
C’est une levure non pigmentée, non capsulée, à bourgeonnement multilatéral, produisant sauf pour C. glabrata des filaments (Figure 1). Les colonies sont blanches et crémeuses en culture sur le milieu de Sabouraud. Elle se présente comme une ellipse mesurant de 2 à 4 µm et sa reproduction asexuée se fait par bourgeonnement à partir d’une cellule mère, appelée le blastospore, donnant lieu à une cellule fille identique à la cellule mère [13].Cette forme possède une bonne capacité d’adhérence à la paroi vaginale, mais elle est incapable de traverser la muqueuse vaginale. La forme levure est donc la forme de dissémination, de transmission et de résistance, mais elle ne provoque pas la vulvo-vaginite candidosique [12, 13, 14].
La forme mycélienne et pseudomycélienne
La forme mycélienne est, quant à elle la forme de l’invasion, de la pénétration des muqueuses et de la libération des enzymes protéolytiques. Au niveau clinique, l’expression de cette forme est synonyme de la candidose vulvo-vaginale.
Au début de la germination, le bourgeon formé par la cellule mère (le blastopore) grandit et donne naissance à une structure très allongée, à bords parallèles nommée tube germinatif. Au cours de sa croissance, il peut se diviser et se ramifier jusqu’à obtenir un aspect arborescent appelé également mycélium [13, 14] (Figure 1).
La formation de ces mycéliums confère à la levure de bonne capacité d’adhérence à la paroi vaginale [13, 14, 15].
Il est à noter que toutes les espèces de Candida ne sont pas en mesure de produire un filament vrai. Ainsi, elles produisent un pseudo-filament(ou pseudo-hyphe) [16] qui n’est en réalité qu’une association de blastospores d’aspects allongés. Cette structure qui ressemble microscopiquement à l’hyphe se distingue par l’aspect rétréci à la jonction entre les cellules [17].
Pathogénie
Pour provoquer une vulvo-vaginite, la levure Candida va d’abord coloniser le vagin en adhérant aux cellules épithéliales vaginales au moyen de ses adhésines (protéines de surface) [18]. Puis, afin de pénétrer dans l’épithélium vaginale, le blastospore germe en filament(ou pseudo-filament) qui est sa forme pathogène. Ce switch dimorphique se fait sous l’influence de certains facteurs mais son mécanisme exact n’a pas encore été parfaitement élucidé. Néanmoins, une diminution du taux de progestérone et une augmentation d’œstradiol ont été identifiées comme favorisant la transition blastospore-filament de C. albicans [12, 13, 19].
Par la suite, en libérant de nombreuses protéines cytotoxiques, le Candida va lyser les cellules vaginales et pénétrer dans les couches plus profondes de l’épithélium. L’endocytose par les cellules épithéliales favorise davantage le processus [20].
Cette phase d’invasion s’accompagne de la libération de substances inflammatoires (des bradykinines et des prostaglandines) provoquant une inflammation locale au niveau des tissus vaginaux qui se manifeste en clinique par des érythèmes et/ou un œdème et une sensation de prurit[21].
Par ailleurs, le Candida va se protéger du système immunitaire en sécrétant notamment la gliotoxine, substance immunosuppressive capable d’inhiber l’activité phagocytaire au niveau de la muqueuse vaginale et de supprimer l’immunité locale [22]. De plus, il a été rapporté que les filaments mycéliens sont capables, en se liant entre eux, de former des biofilms, aussi bien au niveau de la muqueuse vaginale que sur des dispositifs médicaux comme les implants ou les cathéters. Ceci les rend inaccessibles aux phagocytes et plus résistants aux agents antifongiques empêchant l’éradication complète du champignon et favorisant ainsi les récidives et de nouvelles infections [13, 19, 23].
Facteurs de risque de la CVV
Plusieurs éléments ont été admis comme facteurs prédisposant au développement de la CVV. Ces facteurs peuvent être retrouvés seuls ou, le plus souvent, associés. Les plus importants parmi eux sont exposés ci-dessous.
Les facteurs hormonaux : Estrogènes
Il est actuellement établi qu’une diminution du taux de progestérone et une augmentation d’estradiol favorisent le switch dimorphique de C. albicans vers la forme filamenteuse pathogène [12, 13,19] et donc le développement d’une CVV symptomatique [24].
De ce fait les circonstances favorisant l’augmentation des estrogènes comme la grossesse [25], la prise de contraceptifs oraux ou tout simplement la deuxième période du cycle menstruel [22, 26, 27] constituent des facteurs de risques au développement du Candida.
Le diabète
Les patientes diabétiques sont davantage sujettes aux infections vulvo-vaginales, en particulier celles dont le diabète est mal équilibré. En effet, la présence de glucose dans les sécrétions vaginales constitue une source nutritive pour les levures et favorise leur adhérence, leur croissance et l’expression de leurs facteurs de virulence. L’hyperglycémie a également un impact sur l’immunité, en inhibant l’action des polynucléaires neutrophiles notamment en diminuant leur capacité à phagocyter les agents pathogènes et à éliminer les levures [24].
Les facteurs génétiques
Selon certaines études [28, 29, 30] il y aurait une prédisposition génétique à l’apparition de candidose vaginale et à la fréquence des récurrences. En effet, deux caractéristiques génétiques sont suspectées [24]:
une mutation au niveau du gène codant pour le MBL (Mannose Binding Lectin), une protéine intervenant au niveau de l’immunité innée ;
le groupe sanguin ABO-Lewis non sécréteur.
Antibiothérapie à large spectre
Par leur action bactéricide, les antibiotiques administrés par voie locale ou systémique entraînent une diminution, voire une éradication des lactobacilles vaginaux. Cette situation est favorable au développement de micro-organismes opportunistes comme le Candida.
Le risque de survenue d’une CVV après une antibiothérapie est d’autant plus important que le spectre de l’antibiotique est large et que la durée du traitement est longue.
On estime autour de 30% (28%-33%) le pourcentage des mycoses vaginales qui font suite à une prise d’un antibiotique [22, 24, 31].
États d’immunodépression
Les femmes atteintes du syndrome d’immunodéficience acquise sont plus fréquemment touchées par la CVV. La pathologie infectieuse est également plus persistante mais les symptômes ne sont pas plus sévères [2].On sait également que d’autres formes d’immunodépression ainsi qu’une altération de l’état général sont des facteurs pouvant potentialiser le risque de CVV [22, 24].
Il est également à noter que les traitements immunosuppresseurs, dont la corticothérapie, diminuent les défenses de l’organisme contre le pathogène. La chimiothérapie et la radiothérapie sont également considérées comme favorisant l’apparition de mycoses vaginales [22].
Facteurs associés au comportement
Le défaut d’hygiène de la région ano-génitale, associé à la transpiration et à la macération, crée un environnement chaud et humide favorable au développement du Candida [32, 33]. Le port de vêtements serrés et de sous-vêtements synthétiques gênant l’aération favorisent davantage développement du Candida.
Toutefois une hygiène intime excessive ou inadaptée (toilette intimes multiple, usage de savon antiseptiques, douches vaginales, …) n’en est pas moins nuisible. Ces pratiques peuvent entrainer l’altération de l’épithélium et de son revêtement, la modification du pH local et le déséquilibre de la flore physiologique générant ainsi le risque accru d’une colonisation par des bactéries ou des champignons [32, 33].
Outre ces facteurs, le port régulier de protège slip semble également accroître le risque de développer une infection vaginale [34].
Contraception mécanique
Les diaphragmes et dispositifs intra-utérins (DIU) favoriseraient également le risque de survenue de candidose vulvo-vaginale, grâce à un mécanisme d’adhésion et de production d’un biofilm à la surface du DIU qui permet aux levures de ne plus être soumises aux mécanismes de l’immunité [22, 24].
Manifestation clinique de la candidose vulvo-vaginale
Les levures du genre Candida sont des germes opportunistes de la muqueuse vaginale, dont la principale source semble être le tractus digestif. La transmission sexuelle n’est en effet retrouvée que dans 25% des cas, ce qui a permis d’exclure la CVV des infections sexuellement transmissibles (IST) [35].
Suite à une perturbation de l’équilibre entre le système immunitaire de l’hôte au niveau de la muqueuse vaginale et la levure, celle-ci peut passer de l’état commensal à l’état pathogène en exprimant ses facteurs de virulence et en colonisant la muqueuse vaginale [24].
Un épisode de candidose vulvo-vaginales est communément caractérisé par [22, 26]:
Un prurit vaginal et/ou vulvaire intense ;
Une sensation de brûlures vaginales et/ou vulvaires ;
Des leucorrhées inhabituelles blanchâtres, épaisses, en grains ou en mottes, adhérant aux parois de la muqueuse ;
+/- une dysurie ;
+/- une dyspareunie (douleurs lors des rapports sexuels) ;
une gêne/inconfort aggravée par la marche ou le port de pantalon serré ;
des symptômes d’ordre psychologiques : la crainte d’un nouvel épisode ou l’inconfort général ont un impact psychologique important et handicapant pour les femmes, pouvant aller jusqu’à générer un sentiment de honte.
La CVV prend la deuxième position en matière de fréquence avec environs 30% des infections génitales basses chez la femme. A côté il y’a la vaginose bactérienne qui vient en première position avec 50% des cas puis les infections à Trichomonas avec environs 20% des cas [36].
Dans sa forme typique la CVV peut facilement être distinguée des deux autres infections notamment par l’aspect typique caillebotté des leucorrhées et l’absence d’odeur suspecte ou de saignements. Cependant il arrive que la symptomatologie ne soit pas aussi évidente, notamment en cas de co-infection, d’où l’importance d’un diagnostic biologique spécifique complémentaire [24, 36].
Diagnostic biologique de la CVV
Le diagnostic biologique de la CVV est essentiellement microbiologique avec une démarche mycologique faisant appel à des tests parfois immunologiques, biochimiques ou moléculaires.
Prélèvement
Certaines conditions pré-analytiques doivent être respectées :
abstinence sexuelle pour les 48h précédent le prélèvement ; pas de toilette intime le jour du prélèvement.
Le prélèvement peut être réalisé par le clinicien, la sage-femme ou au laboratoire par un personnel expérimenté.
Le préleveur procèdera d’abord à l’examen clinique de la vulve dont il notera l’aspect, la présence ou non de lésions de grattage ainsi que l’éventuelle présence d’un enduit blanchâtre recouvrant les grandes lèvres (Figure 2).
Par la suite, pour les patientes vierges, les sécrétions seront prélevées à l’écouvillon au niveau de la vulve à l’aide d’un écouvillon.
Pour les patientes non vierges, un spéculum non lubrifié sera placé en douceur dans le vagin. Le préleveur notera d’éventuelle inflammation du vagin ainsi que la présence de pseudomembranes à l’aspect de « lait caillé ». Puis il raclera à l’écouvillon les parois vaginales et le cul de sac postérieur en ramenant les leucorrhées. Au retrait du spéculum, le pH vaginal peut être mesuré en déposant un bout de papier pH sur les sécrétions recouvrant le dispositif. Le pH demeure normal en cas de CVV et supérieur à 4,5 en cas de trichomonose et de vaginose à Gardnerella vaginalis [37].
Galeries d’identification par méthodes biochimiques
Il s’agit de galeries contenant des substrats carbonés à l’état déshydraté. Le principe de ces tests repose sur la croissance de la levure après 24 à 48h suite à l’assimilation d’un substrat donné, visualisée par le virage d’un indicateur coloré inclus dans la cupule [38].
La galerie API 20C Aux® (bioMérieux). – Cette galerie comporte 19 tests d’assimilation et un témoin négatif (lecture par turbidimétrie) ; 43 taxons peuvent être identifiés [45, 46]. Cette galerie présente l’inconvénient d’imposer en parallèle, de faire le test de chlamydosporulation dont les résultats sont intégrés dans le système de codage [45].
La galerie ID 32C® (bioMérieux). – Cette galerie comporte 29 tests d’assimilation, 1 test de sensibilité à la cycloheximide, 1 test colorimétrique de détection de l’esculine et un témoin négatif (lecture visuelle ou automatique par turbidimétrie) ; 63 taxons peuvent être identifiés. Cette galerie présente d’excellentes performances d’identification à 72h d’incubation [43, 47, 48](figure 7).
La galerie Auxacolor® (BioRad Pasteur). – Cette galerie comporte 13 tests d’assimilation, 1 test de sensibilité à la cycloheximide et 1 test de détection de l’activité phénol-oxydasique ; 26 taxons peuvent être identifiés. La lecture est rendue plus aisée et plus rapide grâce à la présence d’un indicateur coloré (bromocrésol pourpre) qui révèle l’acidification liée à la croissance fongique [45, 47].
Désorption-Ionisation
Un laser UV (337 nm de longueur d’onde) d’azote (N2) est pulsé en direction de la cible. La matrice ayant une grande réactivité pour l’absorption de la lumière UV absorbe l’énergie du laser protégeant ainsi les molécules protéiniques de la dégradation. L’énergie du laser produit deux phénomènes : tout d’abord, la matrice se vaporise libérant les peptides (désorption), ensuite, elle transfère ses protons à l’analyte qui s’ionise [57].
Les ions peuvent être chargés positivement ou négativement selon leur nature. Les protéines et peptides ont des groupements accepteurs de protons et sont ionisés positivement. Les oligonucléotides et les saccharides ont des groupements qui perdent un proton et sont ionisés négativement.
Peptides : R-NH2 + H+ → R-NH3+ (ionisation positive)
Saccharides : Acides carboxyliques R-CO2H → R-CO2- (ionisation négative)
Fonction alcoolique R-OH → R-O- (ionisation négative)
La spectrométrie à temps de vol (TOF)
La spectrométrie à temps de vol est une technique séparant les substances ionisées en fonction de leur charge et de leur poids moléculaire. La séparation se fait entre une anode et une cathode dirigeant ainsi les molécules ionisées vers l’électrode portant la charge inverse des ions à analyser. Les ions passent ensuite à travers un champ électrique de force connue accélérant leur progression. Le spectromètre mesure le temps que mettent les différents ions à atteindre le détecteur. Les grosses molécules mettent plus de temps à atteindre le détecteur que les petites molécules. Elles sont ainsi séparées en fonction de leur rapport masse/charge.
Le détecteur envoie ensuite les informations enregistrées à l’analyseur qui va traiter les données et les présenter sous forme de spectre [57].
Le spectre
Les données enregistrées sont calculées afin de transposer les résultats dans un spectre où chaque pic correspond à un type de molécule. L’axe des ordonnées représente l’intensité relative du signal et l’axe des abscisses indique la taille de la molécule en Daltons. L’appareil intègre les différents pics enregistrés et recherche dans la base de données l’identification du germe correspondant (Figure 9).
Applications
Les applications de la spectrométrie de masse MALDI TOF MS sont très nombreuses et touchent divers domaines [58]:
en biotechnologies pour l’analyse des peptides ou oligonucléotides ; en pharmacologie pour le dosage de médicaments ;
dans le domaine de l’environnement pour l’analyse de l’eau ; en toxicologie pour la recherche de drogues ;
en microbiologie pour l’identification des microorganismes cultivables in vitro tels que les Candida.
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Table des matières
REMERCIEMENTS
DEDICACES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
ABREVIATIONS
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
1. La candidose vulvo-vaginale
1.1 Définition et épidémiologie
1.2. Les agents pathogènes
1.2.1. Taxonomie et classifications
1.2.2. Morphologie du Candida
1.2.2.1 La forme levure
1.2.2.2 La forme mycélienne et pseudomycélienne
1.2.3 Pathogénie
1.3. Facteurs de risque de la CVV
1. 3.1. Les facteurs hormonaux : Estrogènes
1. 3.2. Le diabète
1. 3.3. Les facteurs génétiques
1. 3.4. Antibiothérapie à large spectre
1. 3.5 États d’immunodépression
1. 3.6. Facteurs associés au comportement
1. 3.7 Contraception mécanique
1. 4. Manifestation clinique de la candidose vulvo-vaginale
1. 5. Diagnostic biologique de la CVV
1.5.1. Prélèvement
1.5.2. Culture
1.5.3. Examen direct
1.5.4. Identification
1. 5.4.1 Tests physiologiques
1. 5.4.2 Galeries d’identification par méthodes biochimiques
1. 5.4.3 Culture sur milieux chromogènes
1. 5.4.4. Techniques immunologiques
1. 5.4.5. Biologie moléculaire
1. 5.4.6. Spectrométrie de masse :
1. 6. Traitement de la CVV
2. Le MALDI-TOF MS
2.1. Principe
2.2. Appareillage
2.3. Fonctionnement
2.3.1. La matrice
2.3.2. Désorption-Ionisation
2.3.3. La spectrométrie à temps de vol (TOF)
2.3.4. Le spectre
2.4. Applications
DEUXIEME PARTIE :TRAVAIL EXPERIMENTAL
METHODOLOGIE
1. Cadre d’étude
2. Type et période d’étude
3. Population d’étude
3.1 Critères d’inclusion
3.2 Critères de non inclusion
4. Matériel et méthodes de l’étude
4.1. Matériel d’étude
4.1.1. Matériel classiques
4.1.2 Matériel du MALDI TOF MS
4.2. Méthodes d’études
4.2.1 Prélèvement
4.2.2. Examen direct et Culture
4.2.3. Examen des cultures positives
4.2.4. Identification des colonies
4.2.4.1 Test de blastèse
4.2.4.2 Identification par le MALDI TOF MS
a. Calibration
b. Préparation des échantillons
c. Lecture et interprétation des résultats
4.3. Diagnostic mycologique et statistiques
RESULTATS
1. Résultats généraux
2. Distribution des CVV en fonction de l’âge
3. Répartition des cas de CVV en fonction des facteurs de risques
4. Répartition des patientes atteintes de CVV selon les symptômes cliniques
5. Répartition des cas de CVV en fonction du type de flore
6. Résultats mycologiques
6.1. Résultat de l’examen direct
6.2. Résultats de la culture sur Sabouraud-Chloramphénicol
6.3. Résultats du test de filamentation (TF)
6.4. Résultats de l’identification par MALDI-TOF MS
6.5. Évaluation de l’examen direct versus la culture dans le diagnostic de la CVV :
DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
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