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LES FORMES BIOLOGIQUEMENT ACTIVES
Le noyau ptéridinique de l’acide folique existe donc sous trois formes d’oxydation, soit totalement oxydé soit sous deux formes réduites : le 7-8 DHF et 5-6-7-8 THF. Les THF sont biologiquement actifs et majoritairement présents dans la cellule sous la forme de pentaglutamate. La fonction biochimique de l’acide folique chez les mammifères est d’accepter puis de libérer des unités monocarbonés. C’est pour cela que les formes cellulaires des folates varient selon le type d’unités carbonées transportées sur les atomes N5 et N10.
Le THF peut fixer réversiblement des radicaux monocarbonés sur ses atomes d’azote (N5 et/ou N10) et fournir ainsi les groupes monocarbonés nécessaires à diverses réactions enzymatiques. Ainsi, le 5-méthyl THF est la forme circulante chez l’homme.
Les folates subissent la méthylation ou formylation et l’attachement d’une chaîne de résidus glutamiques grâce à une liaison peptidique à l’acide L-glutamique.
On distingue de l’acide folique, l’acide folinique aussi appelé leucovorine qui est l’acide 5-formyl-tétrahydrofolique. Celui-ci est actif sans l’intervention de la dihydrofolate réductase ni de la sérine hydroxyméthyl transférase car il possède déjà un groupement mono-carboné.
L’ABSORPTION INTESTINALE
Les réserves en folates, à la différence de celles de la vitamine B12, sont faibles mais l’absorption quotidienne est importante.
Les folates sont principalement sous forme de polyglutamates, forme qui est naturellement présente dans les aliments. Dans les végétaux, ils sont sous forme ptéroylpenta (ou hepta) glutamique.
Dans le système digestif, ils sont dégradés sous l’action des protéases puis des conjuguases par lesquelles ils sont hydrolysés en monoglutamates avant leur absorption par la muqueuse intestinale. Les radicaux glutamates supplémentaires peuvent aussi être clivés lors de la cuisson, ou au cours du stockage.
C’est la seule molécule avec une chaîne gammapolyglutamate nécessitant pour son hydrolyse l’action d’une conjuguase. Celle-ci transforme les ptéroylheptaglutamates en ptéroylmonoglutamates. L’action de la conjuguase est inhibée par l’éthanol et la sulfasalazine (anti-inflammatoire intestinal).
Deux types de conjuguases interviennent, la première est issue des sécrétions pancréatiques : γ-glutamyl hydrolase et la seconde est associée à la membrane de la bordure en brosse jéjunale : glutamate carboxypeptidase IV.
L’absorption des folates monoglutamates se produit dans le jéjunum proximal par deux processus distincts : l’un actif, saturable et pH dépendant mais qui reconnait d’autres substrats présentant une parenté structurale comme le méthotrexate, et l’autre par diffusion passive (Fig. 3).
LA DISTRIBUTION
La pénétration cellulaire des folates fait appel à plusieurs modalités. Les folates, sous leur forme monoglutamates, utilisent le transporteur des folates réduits (TFR) qui assure un transport facilité et bidirectionnel des folates (forte capacité et faible affinité).
Il existe aussi un transporteur couplé à des protons, où l’entrée des folates dans la cellule se fait par internalisation de récepteurs des folates ou FR de haute affinité mais faible capacité.
Dans les tissus
Les réserves de l’organisme en folates sont d’environ 10 à 15 mg dont la moitié se situe dans le foie, le reste se répartit principalement entre le rein et le pancréas. Ces réserves sont assez faibles et épuisables en 1 à 4 mois en cas de carence.
Le foie est l’organe le plus riche en folates, présents sous diverses formes telles que : l’acide folique, dihydrofolique, tétrahydrofolique, avec ou sans groupement mono-carboné, sous forme de monoglutamates ou polyglutamates.
Dans le sang
Il y a lieu de distinguer les folates totaux, sériques (plasmatiques) et globulaires. Les teneurs plasmatiques en folates varient de 2,5 à 16 μg/L et ils sont en partie fixés à des protéines de transport. Les teneurs érythrocytaires varient de 145 à 530 μg/L de folates et se révèlent plus informatifs sur l’existence d’un déficit ou d’une carence en vitamine B9.
De façon empirique, il a été prouvé que certaines thérapeutiques (l’acide éthacrynique et le furosémide qui sont deux diurétiques) inhibent la pénétration d’un dérivé THF dans les globules rouges.
Fonctions physiologiques
L’acide folique participe au métabolisme des acides aminés (dont la synthèse de la méthionine à partir de l’homocystéine) et des acides nucléiques. Du fait de son rôle dans la synthèse de l’ADN et le développement de l’enfant, il est impliqué dans le métabolisme cérébral et nerveux et dans la synthèse des neuromédiateurs.
BIODISPONIBILITE
Pour être absorbés, les polyglutamates doivent être déconjugués par une enzyme des cellules de la partie proximale de l’intestin, au niveau du jéjunum. C’est sous la forme méthylée que le transport se fait dans le sérum. S’ensuit un cycle entéro-hépatique, qui permet une redistribution de la vitamine vers les tissus périphériques. La déméthylation est nécessaire pour permettre le cycle cellulaire des folates, ce qui ne peut se faire qu’en présence de vitamine B12. Le stock d’environ 4 mois est essentiellement hépatique, le reste des réserves est dans les globules rouges.
La biodisponibilité des folates naturels est incomplète lors de l’ingestion d’un repas varié, avec une absorption qui est estimée entre 50 et 60 %. Cependant, cette valeur est imprécise en raison du faible nombre de sujets généralement étudiés et de la variabilité des indices utilisés (taux de folates plasmatiques ou érythrocytaires, homocystéinémie). Lorsque la source alimentaire d’apport en folates est principalement constituée d’agrumes, en particulier de citrons, la biodisponibilité peut s’élever jusqu’à 60 à 90 % en comparaison à l’acide folique.
LE ROLE DES FOLATES
Synthèse des bases pyrimidiques et puriques
La synthèse de l’ADN se réalise en présence de bases puriques et pyrimidiques qui seront alors incorporées sous forme nucléotidiques triphosphates sous l’action des ADN polymérases.
Les folates interviennent dans la synthèse de l’ADN en assurant la synthèse de la déoxythymidine (une base pyrimidique) et des bases puriques.
La synthèse de déoxythymidine-mono-phosphate (dTMP) ou de thymidine-mono-phosphate (TMP) à partir du déoxyuridilate-mono-phosphate (dUMP) est catalysée par une enzyme la thymidylate synthase. Cette réaction se réalise en présence de N5-N10-méthylène-THF, donneur de groupements monocarbonés et réducteurs par sa transformation en 7-8 DHF.
Celui-ci est réduit en THF grâce à la THF réductase, puis est transformé en N5-N10-méthylène-THF sous l’action de la sérine hydroxy-méthyl-transférase et de la vitamine B6.
La thymidylate synthase est une enzyme qui détient un rôle primordial lors de la croissance cellulaire. Une déficience en folates aura des conséquences sur l’hématopoïèse.
La formation d’inosine-mono-phosphate ou IMP s’opère après dix étapes métaboliques, dont deux nécessitent du THF. L’IMP est un précurseur de la synthèse d’adénosine, AMP, ADP, ATP, de GMP, GDP, GTP, de bases puriques.
Intervention dans le métabolisme des acides amines
Reméthylation de l’homocystéine
L’homocystéine est un acide aminé soufré qui n’intervient pas dans la synthèse protéique. Elle est transformée en méthionine par reméthylation nécessitant la présence de 5-méthyl-THF, celui-ci provient de la réduction du 5,10-méthylèneTHF. La réduction est réalisée par une enzyme clé la 5,10-méthylèneTHF réductase (MTHFR).
Une fois produite, la méthionine entre dans les synthèses protéiques où elle est couplée à l’adénosine (fournie par l’adénosine triphosphate) pour former la S-adénosine-méthionine (SAM). Ce complexe SAM est un donneur majeur de radicaux méthyl qui intervient dans de très nombreuses réactions biologiques comme le montre la figure 4.
Conversion de la serine en glycine
La conversion de la sérine en glycine se réalise grâce à l’action de la sérine-hydroxy-méthyl transférase en présence de différents substrats qui sont : le pyridoxal-phosphate, l’acide lipoïque et le THF. C’est en effet en acceptant le CHOH de la sérine que le THF est transformé en CH2OH-THF.
SOURCES ALIMENTAIRES
Le terme de folates vient de folium qui signifie « feuille » en latin, car les légumes à feuilles sont particulièrement riches en folates.
Les folates sont présents principalement dans les légumes à feuilles (ce qui est plutôt connu du tout public), mais aussi dans des produits animaux (Tab.1).
Dans l’alimentation, les folates ont une biodisponibilité comprise entre 50 et 70 %. Celle-ci est très variable selon l’aliment, en raison de l’inhibition par certains composés acides et selon les conditions de traitements des produits alimentaires.
Les folates sont présents dans une multitude d’aliments: végétaux et animaux, mais cependant en très faible concentration. Ce qui explique la présence de déficiences en folates chez de nombreuses personnes, notamment les femmes enceintes.
Le produit animal le plus riche en folates est la levure, elle contient 3900 μg de folates pour 100 g. De nombreux produits végétaux sont également riches en folates mais avec un rapport plus de 10 fois inférieur, comme les lentilles, les épinards.
Le foie est également un aliment très riche en folates. Cependant, il est déconseillé aux femmes enceintes d’en consommer durant leur grossesse car très riche en vitamine A, il pourrait générer un risque tératogène.
Risques potentiels de masquage du déficit en vitamine B12
En dehors des rares carences d’apport, quasi-exclusivement rencontrées chez les végétariens stricts, les déficits en vitamine B12 sont majoritairement secondaires à des défauts d’absorption. La forme classique est représentée par la maladie de Biermer : gastrite atrophique d’origine auto-immune entraînant la quasi absence de sécrétion d’acide chlorhydrique et de facteur intrinsèque. Dans cette pathologie, en raison de la quasi absence de facteur intrinsèque ; l’absorption active au niveau de l’iléon terminal est impossible, car elle nécessite impérativement la formation d’un complexe vitamine B12/facteur intrinsèque. Seule une absorption passive le long de l’intestin grêle est possible mais celle-ci ne concerne qu’environ 1% de la vitamine B12 ingérée. Chez les sujets âgés, la forme la plus habituelle de déficit en B12 n’est pas due à une absence totale de facteur intrinsèque mais à une moindre aptitude à libérer les molécules de vitamine B12 des protéines alimentaires. Cette B12 liée ne peut alors que partiellement être absorbée, activement ou passivement. Cette situation est directement en rapport avec l’hypo-achlorydrie gastrique fréquemment observée chez les sujets âgés22. Il semble que cette pathologie, bien que décrite de longue date, a été longtemps sous-estimée ; elle pourrait concerner jusqu’à 20 % des populations vieillissantes.
Un programme d’enrichissement en acide folique des farines peut créer potentiellement un effet adverse chez les sujets préalablement porteurs d’une hypovitaminose B12. En effet, en cas de déficit en vitamine B12, l’apport d’acide folique peut masquer les signes hématologiques de déficit en B12 (la macrocytose et l’anémie), les signes hématologiques du déficit en vitamines B9 et B12 étant similaires, alors que les signes neurologiques continueraient de progresser jusqu’à un stade irréversible des lésions. De rares observations de cas de patients traités avec des doses supra-physiologiques d’acide folique, de l’ordre de 5 à 15 mg/j, corroborent ce type de résultats. Par ailleurs, il n’existe pas, à notre connaissance, de données signalant des cas de masquage de signes hématologiques pour des doses < 5 mg/j d’acide folique. Bien que cet effet adverse soit plus hypothétique que réellement démontré, il semble qu’il pourrait exister dès que la consommation en acide folique dépasserait le milligramme par jour pour certains ou que l’apport additionnel d’acide folique, en plus de l’alimentation, dépasserait 1 milligramme pour d’autres.
Interaction avec les anticonvulsivants et l’épilepsie
Chez l’animal, des doses élevées d’acide folique sont épileptogènes.
Au plan clinique, de fortes doses d’acide folique, de l’ordre de 7 mg, administrées par voie intraveineuse, augmentent la fréquence des crises d’épilepsie chez certains malades traités par les antiépileptiques, alors que, chez d’autres sujets, la perfusion intraveineuse de 75 mg d’acide folique était sans effet. Ces doses sont 30 à 300 fois supérieures aux doses de type nutritionnel.
Interaction avec les traitements antagonistes des folates
De nombreux médicaments sont impliqués dans le métabolisme des folates. On peut citer le méthotrexate, le trimethoprime, la colchicine ou la pyrimethamine, qui sont des molécules d’usage relativement courant. Les effets d’inhibition de leur efficacité ont été rapportés pour des doses d’acide folique > 27 mg/semaine, et sur des petites séries de patients. Ainsi, de la même façon, il existe peu d’information disponible décrivant des effets négatifs pour des doses d’acide folique < 5 mg/j. Notons tout de même un article récent faisant état de la nécessité de prescription de doses discrètement plus élevées de méthotrexate, en présence de supplémentation concomitante en acide folique à 1 mg/j, pour obtenir le même effet thérapeutique chez des sujets porteurs de rhumatisme inflammatoire. Dans le domaine de la cancérologie, certaines études fondamentales laissent supposer une moindre efficacité de certaines chimiothérapies antifoliques en présence d’administration concomitante d’acide folique.
CARENCE EN ACIDE FOLIQUE
Une carence en folates est évoquée lorsque la concentration érythrocytaire de folates est inférieure à 100 μg/L. Une déficience modérée quant à elle est mise en avant quand les folates érythrocytaires sont compris entre 100 et 200 μg/L.
Les réserves en folates étant faibles, les carences sont multiples et sont retrouvées chez des patients malnutris, éthyliques, vieillards, mais aussi chez des patients qui ont un cancer, ou une anémie hémolytique chronique ou bien encore lors de la grossesse.
FLUORESCENCE ET PHOSPHORESCENCE
Beaucoup de composés, lorsqu’ils sont excités par une source lumineuse du domaine du visible ou du proche ultraviolet, absorbent de l’énergie pour la restituer par la suite sous forme d’un rayonnement. Certains présentent la faculté plus ou moins prononcée de réémettre quasi-instantanément à une longueur d’onde plus grande que celle de la lumière d’origine. Ils sont dits fluorescents (fig. 6). Lorsqu’on éteint la source, l’intensité lumineuse diminue extrêmement rapidement en suivant une loi exponentielle.
L’expression 1 relie l’intensité de fluorescence If (t) et le temps écoulé t après l’excitation : If (t) = If (0) · exp [−kt] (1).
Cette loi de décroissance s’applique aussi à la phosphorescence. La différence tient à la valeur de la constante k qui est beaucoup plus grande pour la fluorescence que pour la phosphorescence car celle-ci décroît beaucoup plus lentement. La durée de vie de fluorescence t0 est définie à partir de k par t0 = 1/k. t
À l’instant t0, l’intensité If(t) vaut, d’après 1, 36,8 % de l’intensité de départ If(0). Autrement dit, un composé fluorescent correspond à l’échelle microscopique à une population d’espèces individuelles dont 63,2 % sont revenues à un état non émissif après ce temps. t0 est de l’ordre de quelques nanosecondes.
Pour faciliter les mesures de fluorescence, les instruments courants opèrent en régime stationnaire, c’est-à-dire en maintenant la source d’excitation allumée, avec, en contrepartie l’obligation évidente de différentier la lumière de la source et celle de fluorescence.
La figure 5 illustre par exemple l’apparente symétrie en miroir des spectres d’absorbance et de fluorescence de nombreux composés. Pour obtenir cette représentation on réunit sur le même graphe avec une double échelle, le spectre en absorbance et celui en émittance.
VALIDATION D’UNE METHODE D’ANALYSE [2, 4, 10, 30]
OBJECTIF ET BUT DE LA VALIDATION
La validation est l’ensemble des opérations effectuées en vue de prouver qu’une procédure est suffisamment exacte et fiable pour avoir confiance dans les résultats fournis pour l’usage prévu (de la méthode de dosage).
La validation d’une méthode d’analyse correspond à une reconnaissance de son aptitude à satisfaire à l’usage attendu en routine. Elle s’effectue en confrontant des valeurs observées de ses caractéristiques de performance avec les valeurs des critères de validation pour les conditions dans lesquelles la méthode est utilisée. Le cas échéant, les caractéristiques de mise en oeuvre pourront également être prises en compte pour la validation d’une méthode.
L’objectif de la validation d’une méthode d’analytique est de donner au laboratoire et aux autorités les garanties suffisantes que chacune des mesures qui seront réalisées en routine avec la méthode d’analyse sera suffisamment proche de la «vrai valeur ».
Le but de la validation d’une procédure analytique est de démontrer qu’elle correspond à l’usage pour lequel elle est prévue.
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE A DETERMINER SELON LE TYPE DE METHODE
Les caractéristiques de performance des méthodes qualitatives et quantitatives sont résumées dans le tableau 4. Ces caractéristiques ne doivent pas être systématiquement étudiées et documentées mais l’absence d’une ou plusieurs caractéristiques doit être justifiée dans le rapport de caractérisation et de validation de méthode d’analyse.
VALIDATION PAR LE PROFIL D’EXACTITUDE
Le profil d’exactitude ne s’applique qu’aux méthodes complètement développées et mises au point. En particulier, la sélectivité/spécificité doit avoir été étudiée ainsi que le domaine d’application de la méthode à valider, en termes de types de matrice et de niveaux de concentrations. Le domaine d’application du profil d’exactitude s’inspire directement de la norme ISO 17025:2005 qui propose que :
« Le laboratoire doit valider les méthodes non normalisées, les méthodes conçues/développées par le laboratoire, les méthodes normalisées employées en dehors de leur domaine d’application prévu, ainsi que les amplifications ou les modifications de méthodes normalisées, afin de confirmer que les méthodes sont aptes à l’emploi prévu. La validation doit être aussi étendue que l’impose la réponse aux besoins pour l’application ou le domaine d’application donné ».
Principe de la méthode de validation par le profil d’exactitude
Le profil d’exactitude est basé sur l’utilisation de l’erreur totale qui est la somme de l’erreur aléatoire (justesse) et l’erreur systématique (fidélité). Une bonne méthode signifie que le résultat fournie ne s’écarte pas trop de la vraie valeur.
Profil d’exactitude en 10 étapes
Définir la quantité mesurée
Préciser des objectifs de la validation
Sélectionner les échantillons de validation
Planifier les essais de validation
Planifier l’étalonnage (pour les méthodes indirectes)
Réaliser les essais
Calculer les concentrations prédites inverses [méthodes indirectes]
Calculer les critères de validation
Construire le profil d’exactitude
Interpréter le profil d’exactitude pour la validation
MODE OPERATOIRE
PREPARATION DE LA SOLUTION TAMPON D’ACETATE DE SODIUM
Nous avons préparé une solution tampon d’acétate de sodium pH 5,5 comme suit :
Nous avons pesé une quantité de 150 mg d’acétate de sodium que nous avons mis dans une fiole jaugée de 25 mL à laquelle nous avons ajouté de l’eau ultrapure jusqu’au trait de jauge et nous avons ultrasonné pendant 10 minutes.
Nous avons prélevé un volume de 58 μL d’acide acétique que nous avons mis dans une fiole jaugée de 10 mL, nous avons ajouté de l’eau ultrapure jusqu’au trait de jauge et nous avons ultrasonné pendant 10 minutes.
A l’aide d’un pH-mètre, nous avons ramené la solution d’acétate de sodium à un pH de 5,5 avec la solution d’acide acétique.
PREPARATION DE LA SOLUTION MERE D’ACIDE FOLIQUE
Nous avons préparé une solution mère d’acide folique de concentration 10-3 mol/L comme suit :
Nous avons pesé une quantité de 0,0044 g de notre standard que nous avons mis dans une fiole jaugé de 10 mL et nous avons rempli jusqu’au trait de jauge avec de l’eau ultra pure. Nous avons ultrasonné pendant 10 minutes.
De la même manière, nous avons préparé une autre solution mère avec un tampon d’acétate de sodium/acide acétique au pH 5,5.
Ces deux solutions mères nous ont permis de préparer de nombreuses solutions filles.
PREPARATION DES SOLUTIONS FILLES D’ACIDES FOLIQUES
Les solutions filles ont été préparées par dilution successive à partir des solutions mères.
Nous avons prélevé des quantités suffisantes de chaque solution mère pour préparer des solutions filles correspondantes de concentration 1.10-5, 8.10-6, 6.10-6, 4.10-6, 2.10-6, 1.10-6, 8.10-7, 6.10-7, 4.10-7, 2.10-7, 1.10-7et 8.10-8 mol/L.
PREPARATION DES SOLUTIONS D’EXTRACTIONS
Nous avons préparé deux solutions d’extraction de l’acide folique dans la farine enrichie a base phosphate dibasique de sodium (pH=7,5) et de phosphate dibasique de potassium (pH=9) comme suivent.
Pour la solution d’extraction à base de phosphate dibasique de sodium (pH=7.5, concentration 0,1 mol/L), nous avons prélevé 0.71 g de poudre de phosphate dibasique de sodium que nous avons mis dans une fiole de 50 mL et nous avons remplis jusqu’au trait de jauge avec de l’eau ultrapure. nous avons ajusté le pH à l’aide d’une solution d’acide chloridrique (concentration 0,2 mol/L).
Pour la solution d’extraction à base de phosphate dibasique de potassium (pH=9, concentration 0.1mol/L), nous avons prélevé 0.87 g de poudre de phosphate dibasique de potassium que nous avons mis dans une fiole jaugé de 50 mL et nous avons rempli jusqu’au trait de jauge avec de l’eau ultrapure. nous avons ajusté le pH à l’aide d’une solution d’acide chloridrique (concentration 0,2 mol/L).
PREPARATION DE L’ECHANTILLON DE FARINE
Nous avons pesé 1 g de farine de blé enrichie (2 fois) que nous avons mis chacune dans des fioles jaugés de 50 mL et nous avons ajouté dans chacune des fioles une solution d’extraction précédemment préparée. Nous avons agité à l’aide d’un agitateur magnétique pendant 30 min ensuite nous avons centrifugé nos mélanges à 3000 tr/min pendant 30 min à une température de 25°c. Nous avons recueilli le surnageant que nous avons filtré à l’aide d’un filtre a cartouche de 45 μm de porosité.
LECTURE AU SPECTROMETRE UV
A partir de la solution mère précédemment préparée, nous avons préparé une solution fille de concentration 10-5 mol/L dans une fiole jaugée de 3 mL en prélevant 30 μL de la solution mère que nous avons complété avec 2970 μL d’eau ultra pure.
La lecture au spectromètre UV a pour but de fixer les longueurs d’ondes d’absorption de l’acide folique.
LECTURE SUR L’APPAREIL
A partir de la solution mère précédemment préparée, nous avons préparé une solution fille de concentration 10-5 mol/L dans une fiole jaugée de 3 mL en prélevant 30 μL de la solution mère que nous avons complété avec 2970 μL d’eau ultra pure.
La lecture au spectrofluorimètre a pour but de fixer les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission de l’acide folique.
A l’allumage de l’appareil, le logiciel FL WINLAB déroule un menu qui nous permettra de fixer les longueurs d’ondes d’émissions et d’excitations de l’acide folique. Il est possible de fixer également le nombre de lecture souhaité.
La quantification se fera à partir de l’intensité de fluorescence de l’acide folique qui sera proportionnelle à sa concentration.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE I : GENERALITE SUR L’ACIDE FOLIQUE [7, 33, 34]
I-1 L’ACIDE FOLIQUE OU VITAMINE B9
I-2 STRUCTURE ET PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
I-3 LES FORMES BIOLOGIQUEMENT ACTIVES
I-4 L’ABSORPTION INTESTINALE
I-5 LA DISTRIBUTION
I-6 METABOLISME
I-7 BIODISPONIBILITE
I-8 L’EXCRETION
I-9 LE ROLE DES FOLATES
I-10 SOURCES ALIMENTAIRES
I-11 INNOCUITE
I-12 CARENCE EN ACIDE FOLIQUE
CHAPITRE II : LA FLUORIMETRIE [17,23,30, 37]
II-1 FLUORESCENCE ET PHOSPHORESCENCE
II-2 ORIGINE DE LA FLUORESCENCE
II-3 RELATION ENTRE FLUORESCENCE ET CONCENTRATION
II-4 DIFFUSION RAYLEIGH ET DIFFUSION RAMAN
II-5 INSTRUMENTATION
CHAPITRE III : VALIDATION D’UNE METHODE D’ANALYSE [2, 4, 10, 30]
III-1 OBJECTIF ET BUT DE LA VALIDATION
III-2 CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE A DETERMINER SELON LE TYPE DE METHODE
III-3 MODALITES PRATIQUES DE CARACTERISATION
III-4 VALIDATION PAR LE PROFIL D’EXACTITUDE
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
CHAPITRE I : CADRE D’ETUDE, MATERIELS ET METHODE
I-1 OBJECTIFS DE L’ETUDE
I-2- CADRE DE L’ETUDE
I-3- MATERIELS ET REACTIFS
I-4- MODE OPERATOIRE
I-5- VALIDATION PROPREMENT DITE
I-6- ANALYSE ET TRAITEMENT DES DONNEES
CHAPITRE II : RESULTATS
II-1- LECTURE AU SPECTROMETRE UV ET AU SPECTROFLUORIMETRE
II-2- DEVELOPPEMENT DE LA METHODE
II-3- VALIDATION PROPREMENT DITE
CHAPITRE III : DISCUSSIONS
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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