Régulation des complexes respiratoires par la phosphorylation chez Saccharomyces cerevisiae

Les substrats de Saccharomyces cerevisiae

a) Substrats fermentaires
Glucose (Ozcan and Johnston 1999) : La présence du glucose extracellulaire est détectée par des protéines de la membrane plasmique : Snf3 et Rgt2 (cf Figures 4 et 5). En absence de glucose, Snf3 et Rgt2 ne transmettent pas de signal intracellulaire : l’absence de signal et l’action du répresseur Rgt1 inhibent la transcription des gènes codant pour les transporteurs d’hexoses (HXT). Le répresseur est représenté en rouge (Rgt1) et les activateurs sont en vert (Snf3, Rgt2). Lorsque le glucose est introduit dans le milieu, plusieurs mécanismes induisent l’expression des gènes HXT :
– Grr1 inhibe le répresseur Rgt1, autorisant l’expression des gènes HXT
– SNF3 et RGT2 sont transcrits et le glucose se fixe sur ces récepteurs. Ils changent alors de conformation ce qui engendre une cascade de signalisation qui entraîne finalement l’expression des transporteurs d’hexoses. L’expression de ces récepteurs dépend de la concentration extracellulaire en glucose : SNF3 et RGT2 sont tous deux exprimés en faible concentration de sucre mais SNF3 est réprimé lorsque la concentration augmente. Le répresseur est représenté en rouge (Rgt1) et les activateurs sont en vert (Snf3, Rgt2). Les transporteurs d’hexoses codés par les gènes HXT permettent l’import du glucose dans la cellule. Ils sont au nombre de 20 mais 7 seulement sont reconnus pour un transport efficace du glucose dans la cellule. Ils peuvent être séparés en deux groupes : les transporteurs présentant une forte affinité pour le glucose, et ceux présentant une faible affinité pour le glucose. A faible concentration en glucose, ce sont les transporteurs à forte affinité pour le glucose (HXT2, HXT3, HXT4, HXT6 et HXT7) qui sont induits grâce à l’action de Grr1, Snf3 et Rgt2. A forte concentration en glucose, l’expression de HXT1, transporteur à faible affinité pour le glucose, est induite par Rgt2 et Grr1. Son expression augmente encore via d’autres mécanismes encore méconnus. D’autre part, les transporteurs à forte affinité pour le glucose (HXT2, HXT4, HXT6 et dans une moindre mesure HXT3) sont réprimés via Mig1 quand la concentration extracellulaire en glucose est forte.
Galactose (Timson 2007) : L’import du galactose dans la cellule se fait via des transporteurs d’hexoses, principalement Gal2p. Le gène à l’origine de la protéine est réprimé en présence de glucose via Mig1 et un processus de dégradation se met en place; il est fortement induit en présence de galactose. Suite à son entrée dans la cellule, le galactose est converti en glucose-6-phosphate, substrat de la glycolyse. La voie métabolique de dégradation du galactose se nomme la voie de Leloir, en référence au biochimiste l’ayant élucidé (cf Figure 6). Elle requiert l’activité des enzymes Gal1p, Gal7p, Gal10p, Pgm1p/Pgm2p, codées par les gènes GAL. La transcription des gènes GAL est réprimée par Mig1 en présence de glucose, et activée via Gal4p en présence de galactose.
Extrait de Timson (Timson 2007) : L’activité de Gal4p est elle-même régulée par les protéines Gal80p et Gal3p (cf Figure 7). En l’absence de galactose, Gal4p est déphosphorylée et forme un complexe avec Gal80p : Gal4p est inactive. En présence de galactose, Gal3p se lie au galactose et à l’ATP et interagit avec Gal80p. Gal4p se dissocie alors de Gal80p et se fixe à d’autres protéines notamment le facteur de transcription Gal11p : la transcription des gènes GAL est activée. La forme active de Gal4p possède 3 sites de phosphorylation, notamment la Ser699 dont l’état phosphorylé est requis pour l’activation de Gal4p.
b) Substrats respiratoires : exemple du lactate : Des sources carbonées, comme l’éthanol, le glycérol ou le lactate, n’entraînent pas la répression catabolique des protéines du cycle TCA et de la phosphorylation oxydative. Elles sont introduites dans la cellule puis converties en substrats de la respiration. Par exemple le symport du lactate à travers la membrane plasmique nécessite la protéine codée par le gène JEN1 (Casal et al. 1999). Le lactate est ensuite oxydé en pyruvate : la protéine Cyb2p codée par le gène CYB2 est responsable de l’oxydation du (L)-lactate (Guiard 1985) tandis que la protéine issue de la traduction de DLD1 est responsable de celle du (D)-Lactate (Lodi and Ferrero 1993). L’oxydation du lactate est couplée à la réduction du cytochrome c. JEN1, à l’origine de la protéine impliquée dans le symport du lactate, est réprimé en glucose par l’intermédiaire des répresseurs Mig1 et Mig2 (Bojunga and Entian 1999). Sa dérepression en milieu non-fermentaire comme l’éthanol ou le lactate est induite par les facteurs de transcription Cat8, le complexe Hap2/3/4/5 et la kinase Snf1. D’autre part, la transcription de JEN1 nécessite la présence d’O2 (Lodi, Fontanesi, and Guiard 2002). Les deux gènes impliqués dans l’oxydation du lactate (CYB2 et DLD1) sont également réprimés en glucose et en anaérobiose. Leur dérepression en milieu non-fermentaire est induite par les activateurs Hap1 et le complexe Hap2/3/4/5 (Guiard 1985; Lodi and Guiard 1991; Ramil et al. 2000; Lodi et al. 1999).

Complexe I ou NADH déshydrogénases

               La chaîne respiratoire des mammifères et de levure S.cerevisiae diffèrent au niveau de la première enzyme impliquée dans le transfert d’électrons: les mammifères possèdent un complexe multi-protéique tandis que la levure se caractérise par la présence de NADH déshydrogénases interne et externe (Luzikov 2009). Le complexe I bovin est constitué de 45 sous-unités dont 7 sont codées par le génome mitochondrial (Carroll et al. 2006). Ces 45 sous-unités s’assemblent en trois domaines distincts: un domaine matriciel (22 sous-unités) et deux domaines membranaires localisés dans la membrane mitochondriale interne (13 et 8 sous-unités respectivement). Saccharomyces cerevisiae possède deux NADH déshydrogénases dans la membrane interne mitochondriale: une NADH déshydrogénase externe, tournée vers l’espace inter-membranaire, et constituée des sous-unités Nde1p et Nde2p (Luttik et al. 1998); une NADH déshydrogénase interne tournée vers la matrice et constituée d’une seule sous-unité Ndi1p (Marres, de Vries, and Grivell 1991). Elles permettent de régénérer le NAD+ consommé dans le cytosol par la glycolyse (NADH déshydrogénase externe), et le NAD+ consommé dans la matrice mitochondriale notamment par le cycle TCA (NADH déshydrogénase interne).

Supercomplexes III+IV

                  Dans la levure, les supercomplexes majeurs identifiés sont formés du complexe III sous forme dimérique et du complexe IV sous forme monomérique ou dimérique: III2IV1 et III2IV2. Dans les mitochondries de mammifères, le complexe I est aussi présent dans les supercomplexes, et la stœchiométrie du complexe IV est différente par rapport à la levure: I1III2IV2 ou I1III2IV4 (Schägger and Pfeiffer 2000). Les structures des supercomplexes III2IV2 de la levure (Mileykovskaya et al. 2012) et I1III2IV1 du bovin (Althoff et al. 2011) ont été résolus par cryo-microscopie électronique et mettent en évidence des différences de structure entre les deux organismes.
– Dans le supercomplexe III2IV2 de levure, un monomère de CIV est situé de chaque côté du dimère CIII (cf Figure 23). Une terminologie plus adéquate du supercomplexe serait IV1III2IV1. L’interface CIII-CIV faisant intervenir les sous-unités Qcr6p et Cox5ap respectivement; les deux CIV impliqués dans le supercomplexe ne sont pas en interaction. Chacun des complexes a été localisé dans la structure cryo-EM: le complexe IV est en rose et le complexe III en bleu Extrait de Mileykovskova (Mileykovskaya et al. 2012)
– Dans le supercomplexe I1III2IV1 du bœuf, le complexe IV est à la périphérie de l’interface CIIICIII et l’interface CIII-CIV fait intervenir la protéine Rieske et le cytochrome b d’une part, et les sous-unités III et VIa d’autre part (les homologues chez la levure sont Cox3p et Cox13p). La structure du supercomplexe III2IV2 du bœuf n’a pas été résolue : l’interface d’interaction entre les deux complexes IV n’est pas identifiée. D’autre part, l’ubiquinone et le cytochrome c ont été identifiés dans la structure supramoléculaire des mitochondries de cœur de boeuf: les sites de fixation des transporteurs sur les deux complexes impliqués (CI et CIII pour l’ubiquinone ainsi que CIII et CIV pour le cytochrome c) se font face (Althoff et al. 2011).

Implications dans le stress oxydatif

               D’autre part, un élément majeur de la chaîne respiratoire est la production de ROS: en effet, des intermédiaires réduits sont générés au cours du transfert d’électrons et le transfert de leurs électrons à O2 peut induire des espèces radicalaires. La production de ces espèces radicalaires doit être contrôlée car elle peut entraîner des dommages pour la cellule. La formation de supercomplexes permettrait de limiter la production de ROS: si l’association du complexe I en structures supramoléculaires diminue, la quantité de ROS augmente (Acin-Perez and Enriquez 2014). La structure des complexes isolés a été résolue par rayons X; celle des supercomplexes a été résolue par Cryo-EM. La comparaison des deux structures a montré un changement conformationnel des complexes selon leur état (isolé ou associé aux autres complexes respiratoires) (Althoff et al. 2011). Ce changement de conformation pourrait expliquer une optimisation du transfert d’électrons (la diffusion latérale des transporteurs d’électrons est limitée) et la diminution de ROS générés (les intermédiaires réduits sont présents moins longtemps et sont moins accessibles à O2) (Genova and Lenaz 2014). La formation des supercomplexes n’est pas spécifique de la chaîne respiratoire mitochondriale. Notamment, les protéines de l’appareil photosynthétique s’organisent en structures supramoléculaires. Chez Chlamydomonas reinhardtii, on observe par exemple le supercomplexe constitué du complexe PSII et des antennes collectrices de lumière LHCII, ou celui constitué du complexe PSI et des antennes collectrices de lumière LHCI et LHCII. C’est l’état de phosphorylation de LHCII qui détermine sa migration vers PSII ou PSI et entraîne la formation d’un des supercomplexes (Takahashi et al. 2006). La phosphorylation régule de nombreux aspects de la vie cellulaire et pourrait être un élément impliqué dans la régulation des supercomplexes mitochondriaux.

Le rôle de la phosphorylation dans la mitochondrie

               En 1969, le premier cas de régulation d’une protéine mitochondriale par la phosphorylation a été mis en évidence (Linn, Pettit, and Reed 1969). La protéine mitochondriale en question est une sous-unité du complexe protéique de la pyruvate déshydrogénase. Depuis, de nombreuses études ont élucidé ce mécanisme et ont notamment mis en évidence les kinases et phosphatases responsables. La phosphorylation du complexe pyruvate déshydrogénase sur la sous-unité E1, en condition fermentaire, inhibe son activité: le complexe multi-protéique n’est alors plus capable d’assurer la liaison entre la glycolyse et le cycle TCA (Holness and Sugden 2003). Chez l’humain, 4 kinases et 2 phosphatases ont été identifiées comme impliquées dans ce processus (Patel et al. 2014). Cependant, un nombre croissant de phosphoprotéines mitochondriales ont été identifiées ces dernières années, suggérant que la régulation du complexe pyruvate déshydrogénase par la phosphorylation n’est pas un cas isolé. En particulier, le complexe TOM est phosphorylé par deux kinases distinctes, ce qui module l’import des protéines mitochondriales: la phosphorylation de Tom22p et Mim1p par la kinase CK2 induit leur biogenèse, puis celle des autres sous-unités TOM; la phosphorylation du récepteur Tom70p par PKA en condition fermentaire, inhibe son activité et donc l’import de certaines protéines mitochondriales (Schmidt et al. 2011). Un des rôles majeurs de la phosphorylation mitochondriale semble être la réponse au stress. Cette modification post-traductionnelle régule différents processus : la fission, par la phosphorylation de Drp1p ; la mitophagie, par l’activité de la kinase PINK1 ; la necroptose, par les kinases RIP1 et RIP3 et l’apoptose (Kanamaru et al. 2012). En particulier, ce dernier processus est très régulé par la phosphorylation : la phosphorylation de la protéine pro-apoptotique BAD, pouvant intervenir sur 3 sérines, inactive cette dernière et induit la survie cellulaire. Différentes kinases peuvent être impliquées dans ce processus (Harada et al. 1999; Datta et al. 2000; Harada et al. 2001). Cependant, la phosphorylation de BAD sur une quatrième serine entraîne au contraire l’apoptose. D’autres protéines peuvent être phosphorylées et réguler l’apoptose : la kinase ASK-1 dans son état phosphorylé engendre une cascade de signalisation entraînant l’apoptose (Madan et al. 2013) ; les protéines Bcl2 phosphorylées sont également pro apoptotiques. D’autres rôles de la phosphorylation mitochondriale ont été mis en évidence de façon plus singulière. La phosphorylation peut favoriser les interactions protéine/protéine, par exemple entre les enzymes PFK-2 et FBPase-2 (Langer et al. 2012) ou encore entre les protéines Atg11-Atg32 (Aoki et al. 2011). Dans le cas de l’interaction Atg11-Atg32, le rôle de la phosphorylation est plus global puisque l’interaction entre les deux protéines initie la mitophagie. La phosphorylation peut aussi être impliquée au niveau de l’activité d’une enzyme ou d’une protéine : par exemple, la phosphorylation d’ANT1 bloque l’échange ADP/ATP nécessaire pour la respiration (Feng et al. 2010); la phosphorylation de Coq7, impliquée dans la biogenèse de CoQ6 diminue son activité, réduisant ainsi la synthèse de CoQ6 (Martín-Montalvo et al. 2011).

Enrichissement en phosphopeptides par SCX-IMAC

               Avant l’étape d’enrichissement en phosphopeptides par IMAC, le mélange peptidique issu des 3 échantillons est fractionné. Ceci permet d’augmenter la sensibilité de l’IMAC. Le fractionnement se fait par une chromatographie échangeuse de cations, SCX. La colonne est équilibrée puis le mélange peptidique solubilisé dans le tampon C (30%ACN, 0.5% acide formique dans H2O milli-Q) est chargé sur la colonne. Les peptides sont progressivement élués au cours de la chromatographie, grâce à un gradient de sel dû au gradient de tampon D (30%ACN, 0.5% acide formique, 50 mM formate d’ammonium dans H2O milli-Q). En sortie de colonne, l’échantillon est collecté sur une plaque à 96 puits. Un détecteur mesure l’absorbance UV à 280nm au cours de la chromatographie, ce qui nous permet d’estimer la quantité de protéines dans chaque puits. Les puits sont réunis en 12 fractions. Chaque fraction est séchée au speed vac puis est enrichie en phosphopeptides par une chromatographie d’affinité IMAC. Le principe de la chromatographie d’affinité IMAC réside dans l’interaction entre des peptides chargés négativement (contenant des résidus phosphorylés ou des acides aminés acides) et une résine chargée positivement. La résine est constituée de cations tel Ga3+ ou Fe3+, liés à des agents chélatants immobilisés sur une colonne. Ces caractéristiques permettent l’enrichissement des échantillons en phosphopeptides. La résine, initialement en suspension dans le glycérol, est rincée 4 fois avec le tampon d’équilibration (30% ACN, 250 mM acide acétique dans H2O milli-Q) puis mise en suspension dans ce même tampon. Les 12 fractions issues de la chromatographie SCX sont reprises par 300 µL de tampon d’équilibration. Elles sont chacune mises à incuber 2h sur une roue, avec 80 µL de résine. Le mélange fraction + résine est introduit dans une spin colonne placée sur un tube de collecte, puis l’ensemble est brièvement centrifugé à 5 000 g. Trois étapes de lavage ont lieu successivement: les deux premiers lavages sont réalisés avec le tampon d’équilibration, le troisième avec H2O milli-Q; 200 µL de tampon d’équilibration ou d’H2O milli-Q sont introduits dans la spin colonne placée sur un tube de collecte, puis l’ensemble est brièvement centrifugé à 5 000 g. Enfin, ce qui est enrichi en phosphopeptides est élué: 30 µL de tampon d’élution sont introduits dans la spin colonne placée sur un tube de collecte, puis l’ensemble est brièvement centrifugé à 2 000 g. Cette étape est répétée, en centrifugeant brièvement à 14 000 g. Les 12 fractions IMAC sont séchées au speed vac puis sont reprises dans 20µL de solvant de chargement (0.1% acide formique, 2% acétonitrile dans H2O milli-Q).

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
I. METABOLISME DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE 
1. METABOLISME ENERGETIQUE
2. REGULATION DE L’EXPRESSION DES PROTEINES EN PRESENCE DE SUCRES
3. LES SUBSTRATS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE
II. LA MITOCHONDRIE 
1. STRUCTURE DE LA MITOCHONDRIE
2. ORIGINES DES PROTEINES MITOCHONDRIALES (ADN MITOCHONDRIAL/IMPORT DES PROTEINES MITOCHONDRIALES CODEES PAR LE GENOME NUCLEAIRE)
3. FONCTIONNEMENT DE LA CHAINE RESPIRATOIRE
III. LES COMPLEXES RESPIRATOIRES, STRUCTURE, ASSEMBLAGE ET FONCTION 
1. COMPLEXE I OU NADH DESHYDROGENASES
2. COMPLEXE II : SUCCINATE UBIQUINONE REDUCTASE
3. COMPLEXE III : UBIQUINOL CYTOCHROME C REDUCTASE
4. COMPLEXE IV : CYTOCHROME C OXIDASE
5. COMPLEXE V : ATP SYNTHASE
6. AUTRES ACTEURS DE LA PHOSPHORYLATION OXYDATIVE
7. REGULATION DES COMPLEXES RESPIRATOIRES
IV. ORGANISATION SUPRAMOLECULAIRE DE LA CHAINE RESPIRATOIRE
1. 2 MODELES EXTREMES : FLUIDE OU SOLIDE
2. NATURE DES SUPERCOMPLEXES
3. MODULATION DES SUPERCOMPLEXES
4. REGULATION DES SUPERCOMPLEXES
5. CONSEQUENCES POUR LA CHAINE RESPIRATOIRE
V. LA PHOSPHORYLATION MITOCHONDRIALE 
1. ANALYSE PHOSPHOPROTEOMIQUE
2. REGULATION DES PHOSPHORYLATIONS : KINASES ET PHOSPHATASES
3. ANALYSE FONCTIONNELLE DE LA PHOSPHORYLATION
VI. IMPLICATION DE LA MITOCHONDRIE DANS DES PATHOLOGIES
1. PATHOLOGIES MITOCHONDRIALES
2. MALADIES NEURODEGENERATIVES
3. CANCER
4. IMPLICATION DE LA PHOSPHORYLATION DANS LES PATHOLOGIES ?
MATERIELS ET METHODES 
I. SOUCHES ET MILIEUX DE CULTURE 
1. SOUCHES
2. MILIEUX DE CULTURE
3. TEST DES MARQUEURS D’AUXOTROPHIE
4. CULTURE
II. TECHNIQUES BIOCHIMIQUES 
1. PREPARATION DE MITOCHONDRIES
2. DOSAGE DE PROTEINES: ADAPTE DE LA METHODE DE LOWRY
3. DOSAGE DE PROTEINES: 2D-QUANT KIT
4. ELECTROPHORESE EN CONDITIONS DENATURANTES (SDS-PAGE)
5. ELECTROPHORESE EN CONDITIONS NATIVES (BN-PAGE)
6. ELECTROPHORESE 2D
7. TRANSFERT SUR NITROCELLULOSE
8. TEST IMMUNOLOGIQUES
9. COLORATION DES GELS AU BLEU COLLOÏDAL (DONG ET AL. 2011)
10. DETECTION DE L’ACTIVITE DU COMPLEXE IV « IN GEL »
III. REACTIONS ENZYMATIQUES : ACTIVITE IN-VITRO DU COMPLEXE IV
1. REDUCTION DU CYTOCHROME C
2. MESURE DE LA CONCENTRATION DE CYTOCHROME C REDUIT
3. MESURE DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE IN-VITRO
IV. SPECTRES D’ABSORPTION DES CYTOCHROMES 
V. BIOLOGIE MOLECULAIRE : MUTATION ET SUREXPRESSION D’IF1 
1. GENERATION D’ADN PLASMIDIQUE MUTE
2. SUREXPRESSION D’IF1 DANS UNE BACTERIE
3. PURIFICATION D’IF1
VI. ENRICHISSEMENT EN PHOSPHOPEPTIDES EN AMONT DE LA LC-MS/MS 
1. DIGESTION TRYPSIQUE
2. MARQUAGE ISOTOPIQUE PAR LA METHODE DU « DIMETHYL ISOTOPE LABELING » : ANALYSE TRIPLEX (BOERSEMA ET AL. 2009)
3. ENRICHISSEMENT EN PHOSPHOPEPTIDES PAR SCX-IMAC
4. LC-MS/MS
RESULTATS ET DISCUSSION 
RESULTATS ET DISCUSSION – PARTIE A 
I. OBJECTIF DU PROJET
II. RESUME DES RESULTATS OBTENUS 
III. ARTICLE JOURNAL OF PROTEOMICS (2014) 
IV. DISCUSSION SUR LE NIVEAU D’ACCUMULATION DES PROTEINES MITOCHONDRIALES SELON LE SUBSTRAT CARBONE 
1. COMPARAISON LACTATE/ GLUCOSE : LE GLUCOSE EST UN SUBSTRAT FERMENTAIRE
2. COMPARAISON GALACTOSE/ LACTATE-GLUCOSE : QUEL EST LE METABOLISME ENERGETIQUE EN GALACTOSE : FERMENTAIRE ? RESPIRATOIRE ? RESPIRO-FERMENTAIRE ?
V. STATISTIQUES GENERALES SUR LA PHOSPHORYLATION MITOCHONDRIALE 
1. QUEL ROLE PEUT AVOIR LA PHOSPHORYLATION MITOCHONDRIALE?
2. QUELLES KINASES POURRAIENT ETRE RESPONSABLES DE LA PHOSPHORYLATION MITOCHONDRIALE?
VI. PHOSPHORYLATION DE LA CHAINE RESPIRATOIRE 
1. QUEL PEUT ETRE LE ROLE DE LA PHOSPHORYLATION DE LA CHAINE RESPIRATOIRE?
2. LES SITES DE PHOSPHORYLATION DE LA CHAINE RESPIRATOIRE SONT-ILS ACCESSIBLES AUX KINASES?
VII. BILAN 
RESULTATS ET DISCUSSION – PARTIE B 
I. OBJECTIF DU PROJET 
II. ANALYSE DU COMPLEXE CYTOCHROME C OXYDASE PAR BN-PAGE ET SPECTROMETRIE DE MASSE 
III. QUEL EST LE ROLE DE COX12P ET DE COX13P DANS LE COMPLEXE IV ET LA CHAINE RESPIRATOIRE? 
1. RESULTATS
2. DISCUSSION
3. BILAN
IV. MUTANTS DE PHOSPHORYLATION 
1. PHOSPHORYLATION DE LA SER7
2. PHOSPHORYLATION DE LA SER82
3. CONSEQUENCES DE LA PHOSPHORYLATION DE LA SER7 ET DE LA SER82
4. DISCUSSION
5. BILAN
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES 
I. CONCLUSION 
II. PERSPECTIVES 
1. ROLE DE LA PHOSPHORYLATION D’IF1
2. ROLE DE LA PHOSPHORYLATION DE RIP1P
RÉFÉRENCES
ANNEXES

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