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Biosynthèse et polymérisation de la lignine
La lignine est un polymère de molécules phénoliques, dont la structure est complexe du fait de la grande variété de métabolites pouvant être incorporés et des différentes liaisons chimiques possibles entre ces sous-unités (Boerjan et al., 2003; Boudet et al., 2003). Ce polymère a un rôle fondamental dans la paroi secondaire et lui confère une résistance mécanique, une imperméabilité ainsi qu’une résistance à la biodégradation. Du fait de ses propriétés, la lignine est résistante à la dégradation, et représente par conséquent un obstacle industriel majeur pour l’accès aux polysaccharides de la paroi. Sa présence nécessite l’emploi de prétraitements polluants et couteux, lors de la production de pâte à papier ou de biocarburants par exemple. Les enjeux économiques ont grandement encouragé l’étude des voies de biosynthèse de la lignine (Grima-Pettenati and Goffner, 1999; Boudet et al., 2003), qui se sont avérées particulièrement complexes. Les études menées ces dernières années continuent de mettre en évidence des voies alternatives dans la biosynthèse des précurseurs de la lignine (Humphreys and Chapple, 2002; Boerjan et al., 2003; Ralph et al., 2004; Vanholme et al., 2010, 2013). Si la majorité des acteurs de la biosynthèse des précurseurs sont relativement connus, les enzymes impliquées dans leur polymérisation dans la paroi restent encore à identifier pour la plupart.
La biosynthèse de la lignine débute dans la voie du shikimate, à l’origine d’une grande variété de molécules phénoliques. Dans cette voie métabolique, le chorismate sert de précurseur, notamment pour la production des acide aminés aromatiques : la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane (Knaggs et al., 2003). La biosynthèse des trois principaux alcools p-hydroxycinnamyliques (alcool p-coumarylique, coniferylique et sinapylique), se produit à travers 11 étapes enzymatiques de la voie des phénylpropanoides (Figure 10a). La voie générale des phénylpropanoides débute avec la désamination de la phénylalanine et conduit à la production d’esters d’hydroxy-cinnamoyl CoA. Les enzymes impliquées dans cette courte série de réactions sont la phenylalanine ammonia-lyase (PAL), cinnamate 4-hydroxylase (C4H) et 4-coumarateCoA ligase (4CL). Pour la production de monolignols, les esters d’hydroxy-cinnamoyl CoA subissent une succession d’hydroxylation et O-methylation de leur cycle aromatique, via l’action des 5 enzymes : shikimate O-hydroxycinnamoyl-transferase (HCT), CSE, p-coumarate 3-hydroxylase (C3H), caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase (CCoAOMT), ferulate 5-hydroxylase (F5H) et caffeate/5-hydroxyferulate O-methyl-transferase (COMT). La conversion des chaines latérales au groupement carboxyl vers un groupement alcool, est catalysée, successivement par les deux enzymes considérées spécifiques de la biosynthèse des précurseurs des monolignols : la cinnamoyl CoA reductase (CCR) et la cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) (Boerjan et al., 2003).
Mort programmée et formation du bois de cœur
Lorsque le dépôt de la paroi secondaire est terminé, les vaisseaux et fibres vont entamer un processus de mort programmée. Les vaisseaux entament le processus de mort programmée dans les jours qui suivent leur différenciation de la zone cambiale, tandis que les fibres peuvent rester en vie pendant environ 1 mois (Bollhöner et al., 2012). Il a également été constaté que le processus de mort programmée des fibres est plus long que celui observé pour les vaisseaux conducteurs. Les cellules du parenchyme radial sont les seules cellules pouvant rester en vie après la maturation du xylème. Celles-ci sont impliquées dans les échanges entre xylème et phloème, dans le stockage de molécules de réserves (amidon et lipides), dans la construction des parois secondaires des cellules adjacentes et dans la formation du bois de cœur. Le bois de cœur, ou duramen, correspond à la partie la plus interne du tronc, qui apparait souvent plus foncé que l’aubier, c’est à dire la partie la plus récente du tronc. Chez certaines espèces, l’aubier dispose de vaisseaux fonctionnels, tandis que les vaisseaux du duramen sont obstrués par des bouchons de tylose produits par les rayons adjacents. Plus généralement, le duramen est enrichi en composés phénoliques qui le rendent plus résistant. Cette accumulation de composés phénoliques est assurée par les cellules des rayons qui produisent ces composés et les libèrent dans les parois, ainsi que dans la lumière des cellules adjacentes (Déjardin et al., 2010).
La mort programmée des cellules du xylème est une étape clé dans leur processus de maturation (Bollhöner et al., 2012). Il semblerait que les acteurs moléculaires nécessaires à cette étape soient produits dès que le processus de différenciation des cellules du xylème est entamé. En effet, durant la différenciation des cellules du xylème, un large spectre de protéases, lipases et nucléases sont produites et stockées dans la vacuole. Par un signal qui reste inconnu, la rupture du tonoplaste entraine un relargage et une activation de ces enzymes dans le cytoplasme menant à l’autolyse des composants de la cellules (Courtois-Moreau et al., 2009). Les protéases à cystéine XYLEM CYSTEINE PEPTIDASE1 (AtXCP1) et AtXCP2, ainsi que la nucléase BIFUNCTIONAL NUCLEASE1 (AtBFN1) ont été associées à ce processus d’autolyse chez Arabidopsis.
Régulation de la formation du bois
La xylogenèse, est un processus complexe et dynamique influencé par de nombreux signaux endogènes et exogènes qui interviennent à plusieurs échelles. Ce mécanisme nécessite la coordination transcriptionnelle d’un grand nombre de gènes structuraux, qui est assurée, à plusieurs niveaux, par un eu d’hormones et autres molécules signal, ainsi qu’un réseau de gènes régulateurs. Malgré les progrès réalisés au cours de ces dernières années dans l’étude de la formation de la paroi secondaire, les processus impliqués dans le contrôle de l’activité cambiale et la différenciation des cellules du xylème restent encore mal connus.
Régulation de l’activité cambiale et de la différenciation des cellules du xylème
Le maintien du caractère pluripotent des cellules cambiales est indispensable pour une l’activité méristématique continue du cambium. Il a été montré, chez Arabidopsis, qu’à l’instar des méristèmes apicaux caulinaires et racinaires, le maintien et la prolifération du cambium sont contrôlés par une voie de signalisation impliquant des peptides, leur récepteur et un facteur de transcription (Fisher and Turner, 2007; Hirakawa et al., 2008; Etchells and Turner, 2010). Le peptide TDIF est produit dans le phloème à partir des protéines CLE41/CLE44. Il est perçu par le récepteur kinase TDR/PXY (TDIF RECEPTOR/PHLOEM INTERCALATED WITH XYLEM) produit dans le cambium. Cette perception va induire une voie de signalisation impliquant le FT de type WUSCHEL HOMEOBOX RELATED, AtWOX4 (Figure 11). Ce processus inhibe la différenciation des cellules cambiales et participe à maintenir leur caractère pluripotent. La mutation de AtWOX4 entraine une réduction de l’activité cambiale, ce qui indique que ce FT est également requis pour la prolifération des cellules cambiales. Un autre gène de la même famille, AtWOX14 semble occuper une fonction similaire (Etchells et al., 2013). En parallèle, la différenciation des cellules cambiales en cellules du xylème est assurée par l’activation de protéines de type GSK3 (glycogen synthase kinase 3 familly), dont BIN2 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 2), qui inactivent le facteur de transcription BES1, impliqué dans la différenciation du xylème (Figure 11) (Fukuda, 2016). Récemment, les orthologues fonctionnels des gènes AtPXY et AtCLE41, ont été caractérisés chez le peuplier (Etchells et al., 2015). Les auteurs ont montré que la surexpression ectopique de ces gènes entraine une désorganisation des tissus conducteurs et une réduction de croissance. Cependant la surexpression plus spécifique de CLE41 dans le phloème et de PXY dans le cambium entraine une forte augmentation de la croissance primaire et secondaire.
Régulation transcriptionnelle de la formation de la paroi secondaire
Les facteurs de transcription de type MYB et NAC sont des régulateurs clés
Les FT sont des protéines chargées de réguler la transcription de gènes cibles, via la reconnaissance de motifs présents dans leurs promoteurs. Prés de 60 familles de FT ont été identifiés chez Arabidopsis, le peuplier et l’Eucalyptus (Jin et al., 2017). Les FT de type MYB-R2R3 constituent une des plus grandes familles et régulent un grand nombre de processus, tels que le métabolisme primaire et secondaire, la différenciation cellulaire, le développement, et la réponse aux stress biotiques et abiotiques (Jin and Martin, 1999; Dubos et al., 2010). Les FT MYB-R2R3 sont caractérisés par la présence d’un domaine de liaison à l’ADN (MYB pour MYeloBlastosis) composé de deux répétitions adjacentes (R2R3) en N-terminal, et une région C-terminale variable portant l’activité d’activation ou répression de la transcription (passé en revue par Jin and Martin, 1999; Dubos et al., 2010). Chez Arabidopsis, l’analyse phylogénétique de cette famille et la détection de motifs dans la région C-terminale variable, a permis de définir 22 sous-groupes regroupant la majorité des gènes MYB-R2R3. Cependant, pour beaucoup d’entre eux, aucun motif conservé n’a pu être détecté (Kranz et al., 1998; Stracke et al., 2001). Des études de phylogénie ont ensuite été conduites chez d’autres espèces, telles que le riz (Oryza sativa; Jiang et al., 2004; Yanhui et al., 2006), la vigne (Vitis vinifera; Matus et al., 2008), le peuplier (Populus trichocarpa; Wilkins et al., 2009), le maïs (Zea mays; Du et al., 2012), le soja (Glycine max; Du et al., 2012b), le pommier (Malus domestica; Cao et al., 2013) et le millet (Panicum virgatum; Zhao and Bartley, 2014). Ces travaux ont révélé que la plupart des sous-groupes décrits chez Arabidopsis sont conservés. Cependant, certains sous-groupes, absents chez Arabidopsis sont détectés. Plus récemment, Soler et al., (2014) ont tiré profit de la disponibilité du génome d’E. grandis, pour réaliser une analyse phylogénétique comparative incluant des espèces ligneuse (E. grandis, V. vinifera et P. trichocarpa) et des espèces herbacées (A. thaliana et O. sativa). Ce travail a montré que les sous-groupes contenant les FT clés de la régulation de la formation de la paroi, sont conservés entre les espèces. De façon intéressante, cette étude a également révélé l’existence de trois sous-groupes enrichis en gènes d’arbres (woody-expanded subgroups, WES; S5, S6, SAtMYB5) et 5 sous-groupes préférentiellement détectés chez les arbres (woody-preferential subgroups, WPS; WPS-I à V). La diversification de ces FT permettrait d’assurer la régulation de fonctions spécifiques aux espèces pérennes. L’expression préférentielle de certains des membres de ces sous-groupes dans les tissus du bois, suggère un rôle spécifique dans la régulation de la croissance secondaire (Soler et al., 2014).
Les FT de type NAC, définis par la présence d’un domaine de liaison à l’ADN NAC (NAM, ATAF1/2 et CUC2) en N-terminal, représentent une autre grande famille de FT pour les plantes. Cette famille de FT a également fait l’objet d’une annotation et d’une étude phylogénétique chez l’Eucalyptus (Hussey et al., 2015). Cette étude montre que ces FT, qui sont impliqués dans la régulation d’un grand nombre de fonctions biologiques, pourraient jouer un rôle important dans le développement et la réponse des tissus vis à vis des stress biotiques et abiotiques.
Dans l’état actuel des connaissances, il est supposé qu’un grand nombre de ces FT, pour la plupart inconnus, s’organiseraient en un réseau de régulation complexe, impliquant des boucles de rétrocontrôle positives et négatives, qui régulent le dépôt de la paroi secondaire.
Le réseau de FT tel qu’il est connu chez la plante modèle Arabidopsis
Le dépôt de la paroi secondaire est activé lorsque la cellule a terminé son élongation, et nécessite par conséquent une coordination spatio-temporelle précise de l’expression de l’ensemble des gènes codants pour les enzymes impliquées dans la biosynthèse de ses composants. Cette activation coordonnée des gènes de biosynthèse est contrôlée par un réseau de FT hiérarchisé à plusieurs niveaux (Hussey et al., 2013) (Figure 12). Dans ce réseau, les FT NAC les plus en amont sont nécessaires et suffisants pour activer le programme de dépôt de paroi, et sont, par conséquent, considérés comme des « régulateurs maitres » (ou « Master regulators ») de la formation de la paroi secondaire. En général, leur mutation inhibe le dépôt de paroi, tandis que leur surexpression ectopique entraine une induction des gènes impliqués dans la synthèse de cellulose, lignine et xylanes, entrainant un dépôt de paroi secondaire. Par conséquent, ils constituent le premier niveau de régulateurs impliqués dans le contrôle de la formation de la paroi secondaire (Hussey et al., 2013). Malgré leur position très en amont dans le réseau, il a été montré qu’ils peuvent se lier aux promoteurs de gènes cibles codant pour des FT en aval, ou des enzymes impliquées dans la synthèse de la paroi (Zhong et Ye, 2015; Hussey et al., 2013).
Conservation du réseau de régulation du dépôt de paroi chez les espèces pérennes
Plusieurs études conduites chez des espèces pérennes telles que le peuplier et l’Eucalyptus, suggèrent que ces voies de régulation décryptées chez la plante herbacée Arabidopsis, sont conservées chez les arbres (Zhang et al., 2014). Chez le peuplier, 16 gènes sont phylogénétiquement proches des régulateurs maitres de type NAC (NST/SND/VND). Ils sont généralement nommés PtVNS (P. trichocarpa VND-, NST/SND-, SMB-related proteins) ou PtWNDs (wood-associated NAC domain). Parmi ces gènes, les orthologues d’AtSND1 chez le peuplier (PtWND2B et PtWND6B) sont capables d’induire un dépôt ectopique de paroi secondaire et complémentent le double mutant snd1 nst1 d’Arabidopsis (Zhong et al., 2011). Parmi les 8 gènes qui sont proches phylogénétiquement des AtVND, l’orthologue d’AtVND7 (PtVNS07/PtWND6A) semble réguler le dépôt de paroi secondaire chez le peuplier (Ohtani et al., 2011).
Parmi les régulateurs du niveau 2, des orthologues du gène AtMYB46 ont été décrits dans de nombreuses espèces dont des monocotylédones telles que le riz (OsMYB46) et le maïs (ZmMYB46) (Zhong et al., 2011). Les premiers orthologues d’AtMYB46 ont été caractérisés chez le pin (PtMYB4; Patzlaff et al., 2003), puis chez l’Eucalyptus (EgMYB2; Goicoechea et al., 2005). La surexpression d’EgMYB2 chez le tabac entraine une induction des gènes impliqués dans la biosynthèse de la lignine, une modification du ratio S/G, ainsi qu’une induction des gènes reliés à la biosynthèse de la cellulose et des hémicelluloses. Les auteurs ont également démontré qu’EgMYB2 est capable de se lier aux promoteurs des gènes d’Eucalyptus EgCCR et EgCAD2, impliqués dans la biosynthèse de lignine, et d’activer leur transcription (Goicoechea et al., 2005). Plus récemment, il a été démontré qu’EgMYB2 complémente le double mutant myb46 myb83 d’Arabidopsis (Zhong and Ye, 2009). La conservation du jeu de régulateurs AtMYB46/AtMYB83, chez les arbres, a à nouveau été démontrée lors de la caractérisation de leurs orthologues PtMYB2/PtMYB21 et PtMYB3/PtMYB20, qui assurent une fonction similaire chez le peuplier (McCarthy et al., 2010; Zhong et al., 2013). Toujours chez le peuplier, les orthologues fonctionnels d’AtXND1 et AtSND2/3 jouent également un rôle dans la régulation de la formation de la paroi secondaire (Grant et al., 2010).
Le FT de l’Eucalyptus EgMYB1, appartient au sous-groupe 4, qui est constitué de régulateurs de la voie des phénylpropanoides chez Arabidopsis (AtMYB4, AtMYB7, AtMYB32) (Soler et al., 2015). EgMYB1 a été le premier membre de ce sous-groupe à être relié à la synthèse de lignine pour la formation de la paroi secondaire (Legay et al., 2007, 2010). Il est capable de se lier aux promoteur des gènes EgCCR et EgCAD2 pour réguler négativement leur transcription (Legay et al., 2007). Sa surexpression chez Arabidopsis et le peuplier entraine une réduction de l’épaisseur de paroi associée à une plus faible accumulation de lignine dans le xylème (Legay et al., 2010). Plus récemment, il a été découvert qu’EgMYB1 interagit avec l’histone linker EgH1.3 pour inhiber l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse de lignine, ce qui suggère que cette régulation pourrait être associée à un mécanisme de remodelage de la chromatine (Soler et al., 2016). La caractérisation fonctionnelle récente des orthologues d’EgMYB1 chez le peuplier (PtMYB156/PtMYB221), a confirmé leur activité de répresseurs de la formation de la paroi secondaire (Tang et al., 2015; Yang et al., 2017). Parmi les nombreux FT du niveau 3, les paires de FT PtMYB216/170 orthologues d’AtMYB61, PtMYB92/125 orthologues d’AtMYB42, PtMYB90/167 orthologues d’AtMYB52 et PtMYB10/128 orthologues d’AtMYB103, ainsi que l’orthologue d’AtKNAT7 ont été caractérisés chez le peuplier (Li et al., 2012; Chai et al., 2014; Li et al., 2015). Ces études suggèrent que les principaux acteurs impliqués dans la régulation de la formation de la paroi secondaire dans le xylème, caractérisés chez Arabidopsis, semblent conservés chez les arbres. Cependant, certains exemples laissent penser qu’il pourrait exister des divergences entre les arbres et les plantes herbacées dans les voies de régulation de la formation de la paroi. Par exemple, le FT EgMYB1 est impliqué dans le contrôle du dépôt de lignine dans le xylème de l’Eucalyptus, tandis que son plus proche orthologue chez Arabidopsis (AtMYB4) ne semble pas impliqué dans ce processus, mais dans la régulation de la synthèse des phénylpropanoides lors de la réponse au stress UV (Jin et al., 2000; Legay et al., 2010). Il a également été constaté l’existence de sous-groupes de FT de type MYB détectés préférentiellement chez les arbres (Soler et al., 2015). Ces données laissent supposer qu’il pourrait exister des mécanismes de régulation de la formation de la paroi secondaire, spécifiques aux espèces ligneuses. Ces régulations pourraient intervenir dans la formation de la paroi dans des tissus ou des conditions spécifiques.
Plasticité de la formation du bois dans l’adaptation aux contraintes environnementales
Quelles contraintes environnementales ?
Dans leur environnement naturel, les plantes doivent faire face à une variété de stress biotiques et abiotiques. Parmi les stress abiotiques les plus fréquemment rencontrés, la sécheresse et le froid, sont responsables de très fortes réduction du rendement en agriculture (Wang et al., 2013). Dans de nombreuses régions du monde, ils représentent également une contrainte majeure affectant la croissance des plantes pérennes, y compris l’Eucalyptus (Teulieres et al., 2007). Le froid et la sécheresse étant les deux facteurs qui limitent le plus l’implantation de ce ligneux dans certaines régions du monde (Teulières et al., 2007). Par ailleurs, les espèces d’Eucalyptus les plus productives sont cultivées en zones tropicales et subtropicales, où il est prédit que les changements climatiques altéreront les régimes de précipitation et de températures, exacerbant les épisodes de sécheresse et de températures extrêmes (Wu et al., 2011).
Pour faire face aux contraintes environnementales, les plantes ont élaboré des réseaux de signalisation complexes qui consistent en (1) la perception des signaux de l’environnement, (2) l’activation des voies de transduction du signal et (3) l’induction d’une réponse génétique en modulant l’expression de gènes impliqués dans l’adaptation de la physiologie en vue de la mise en place d’un état de tolérance. Les mécanismes de perception de ces stress par la cellule ne sont pas encore clairement démontrés. Dans le cas du stress froid, il a été avancé qu’il pourrait être perçu directement au niveau de la membrane plasmique, via des changements dans les propriétés physicochimiques de celle-ci, et notamment dans sa fluidité, impliquant la réorganisation du cytosquelette et l’activation de canaux calciques (Plieth et al., 1999; Huang et al., 2012; Knight and Knight, 2012). Chez Arabidopsis, il a été proposé que le stress osmotique induit par le manque d’eau, serait perçu notamment par l’histidine kinase AtAHK1 localisée dans la membrane plasmique (Tran et al., 2007; Osakabe et al., 2014).
En aval de ces mécanismes de perception, les FT de type DREB (drought-responsive element binding) qui appartiennent à la famille AP2/ERF (Apetala 2/ethylene-responsive factor), ont pour rôle de réguler l’expression des gènes impliqués dans la protection (Licausi et al., 2013). Ils sont caractérisés par un domaine de liaison à l’ADN conservé de type AP2, pour la liaison aux éléments cis de type DRE/CRT (C-repeat factor) dans le promoteur des gènes cibles (Stockinger et al., 1997; Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 2005). Chez Arabidopsis, les FT de type DREB2 sont principalement impliqués dans la mise en place de la tolérance à la déshydratation ou aux fortes températures (Xu et al. 2011). Le deuxième groupe, les FT DREB1 ou CBF (C-repeat binding factor), sont impliqués dans la tolérance au gel (Miller et al., 2006; Lata and Prasad, 2011; Dhillon and Stockinger, 2013; Motomura et al., 2013; Park et al., 2015). Dans le cas de l’Eucalyptus, 17 gènes composent la famille CBF, ce qui est beaucoup plus que chez Arabidopsis, et seulement 6 gènes à la famille DREB2 (Cao et al., 2015; Nguyen et al., 2017). La surexpression ectopique d’un des EgCBF, entraine des modifications de la croissance similaires à celles observées lors d’une acclimatation au froid, dont : une augmentation de la résistance au froid associée à une réduction de la croissance (Navarro et al., 2011). Un effet similaire a été observé dans d’autres espèces pérennes (Benedict et al., 2006; Siddiqua and Nassuth, 2011; Tillett et al., 2012; Artlip et al., 2013; Wisniewski et al., 2015). Ceci suggère que ces FT induisent des mécanismes de protection, mais également des régulations dans les processus développementaux. Ce contrôle de la croissance par les CBFs pourrait être contrôlée par la régulations des voies de signalisation des gibbérellines et des cytokinines (Achard et al., 2006, 2008; Huang et al., 2009). Bien que les CBFs soient principalement induits en réponse au froid et les DREB2 principalement induits en réponse au stress osmotique, un nombre croissant d’études mettent en évidence des régulations croisées entre ces deux voies de réponse (Lata and Prasad, 2011; Huang et al., 2012; Yoshida et al., 2014). Chez l’Eucalyptus, des membres des deux groupes sont induits en réponse au froid et à la sécheresse, suggérant que certaines adaptations sont similaires entre ces deux stress (Nguyen et al., 2017).
Impact de ces stress sur la formation du bois
Dans les nombreuses études menées sur la réponse des plantes aux stress abiotiques, la paroi a reçu moins d’attention que les réponses moléculaires impliquées dans la préservation des processus biologiques cellulaires. De nombreuses études s’accordent à dire que la paroi joue également un rôle dans la mise en place de la résistance à des stress tels que la sécheresse ou le froid (Moura et al., 2010; Cabane et al., 2012; Gall et al., 2015).
Le plus souvent, l’exposition au froid ou au manque d’eau, semble activer les voies de biosynthèse de la paroi dans des organes tels que les feuilles et les racines. Pour la paroi primaire, une augmentation de la synthèse des hémicelluloses, et parfois de cellulose, est observée. Généralement, les auteurs relient ce phénomène à des changements de potentiel osmotique et des ajustements dans la croissance (Gall et al., 2015). Les études de l’adaptation de la paroi secondaire des cellules du système vasculaire sont plus rares, et suggèrent le plus souvent une augmentation de la biosynthèse de lignine en réponse aux stress (Moura et al., 2010; Cabane et al., 2012). Ceci est généralement interprété comme une stratégie consistant à rigidifier et imperméabiliser la paroi des cellules du système vasculaire pour résister au manque d’eau et au gel.
Dans le cas de l’exposition au froid, la majorité de ces observations sont parcellaires, parfois contradictoires, et reposent sur l’analyse de quelques paramètres isolés comme l’expression de quelques gènes potentiellement reliés à la biosynthèse de la lignine, la quantification de l’activité de certaines enzymes de la voie des phénylpropanoides (Hausman et al., 2000; Moura et al., 2010; Cabane et al., 2012; Domon et al., 2013). En ce qui concerne la réponse à la sécheresse dans le xylème, la majorité des études conduites chez les espèces pérennes se sont concentrées sur les modifications structurales du système conducteur (Vander Willigen and Pammenter, 1997; Awad et al., 2010; Plavcová and Hacke, 2012; Pattathil et al., 2016; Fonti et al., 2013; Eldhuset et al., 2013), et suggèrent le plus souvent une activation de la biosynthèse de paroi (Arend and Fromm, 2007). Cependant, très peu de données sont disponibles quant à l’impact de la sécheresse sur la régulation transcriptionnelle de la biosynthèse de paroi secondaire (Gall et al., 2015).
Par ailleurs, un nombre croissant d’études mettent en lien l’adaptation au manque d’eau et le régime de fertilisation minérale (Wang et al., 2013). Le potassium notamment est connu pour être un ion essentiel dans le développement du bois (Fromm, 2010), mais également dans les processus d’adaptation des plantes aux stress (Cakmak, 2005; Wang et al., 2013). Il a récemment été montré que sa disponibilité impacte la croissance de l’Eucalyptus, et son adaptation au manque d’eau (Laclau et al., 2009; Battie-Laclau et al., 2014, 2016). Mais les régulations transcriptionnelles induites dans le développement du xylème secondaire d’arbres fertilisés et soumis au manque d’eau n’ont pas été étudiées.
Des gènes impliqués à la fois dans le contrôle de la tolérance aux stress abiotiques et de la formation de la paroi secondaire commencent à être identifiés. Par exemple, la surexpression de MYB46 chez le bouleau, impacte à la fois la tolérance et le dépôt de paroi secondaire (Guo et al., 2017). De même, les lignées d’Eucalyptus surexprimant un CBF, présentent des modifications de l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse de la paroi secondaire ainsi qu’une meilleure résistance aux stress (Navarro et al., 2011).
Cas du bois de réaction
La formation du bois de réaction en réponse à une contrainte mécanique, est l’exemple le plus marquant et le mieux caractérisé de l’impact d’un stress abiotique sur la formation du bois. Le bois de réaction est généralement formé en réponse à une orientation non verticale de la tige, inclinaison qui peut être causée par différents facteurs externes. Dans le processus de développement, ce type de bois est produit dans le but réorienter la tige pour une croissance verticale. Chez les angiospermes il est caractérisé par une croissance excentrique dans la zone de la tige maintenue en tension, par la stimulation de l’activité cambiale sur la face supérieure (bois de tension) et l’inhibition de la croissance sur la face inferieure (bois de compression) (Hellgren et al., 2004). Chez de nombreux angiospermes tels que l’Eucalyptus et le peuplier, le bois de tension se distingue du bois normal, par des changements drastiques dans sa composition et sa structure (Jourez et al., 2001; Toghraie et al., 2006). Lors de sa mise en place, la modulation de l’activité cambiale est accompagnée d’une réduction de la production de nouveaux vaisseaux au profit des fibres, et des changements dans leur morphologie (Jourez et al., 2001). Le bois de tension est caractérisé par des modifications importantes dans le programme de biosynthèse de la paroi secondaire des cellules qui le composent. Les changements les plus remarquables sont une réduction de l’épaisseur des différentes couches de la paroi secondaire, une réduction de l’angle des microfibrilles de cellulose et le remplacement de la couche S3 par une couche G (Jourez et al., 2001; Pilate et al., 2004; Mellerowicz and Sundberg, 2008). La couche G est mise en place par les fibres et représente un volume conséquent qui peut occuper une grande part de la lumière de ces cellules. Elle est composée exclusivement de polysaccharides, dont principalement de la cellulose ayant un angle faible par rapport à l’axe longitudinal de la cellule, et qui est responsable de la mise en tension du xylème secondaire (Jourez et al., 2001).
Dans l’étude de la réponse du xylème secondaire aux contraintes environnementales, la formation du bois de tension est la réponse la mieux caractérisée au niveau anatomique et mais également moléculaire. Bien que les mécanismes de perception qui en sont à l’origine restent mal connus, les régulations transcriptionnelles et métaboliques induites ont largement été étudiées (Pilate et al., 2004; Paux et al., 2005; Mellerowicz et al., 2006; Mizrachi et al., 2015). Ces études ont mis en évidence une reprogrammation du processus de dépôt de paroi en réponse à ce stress. Avec notamment des régulations négatives d’un ensemble de gènes impliqués dans la biosynthèse de lignine et des hémicelluloses. Par ailleurs, les analyses transcriptomiques effectuées sur le bois de tension, ont permis l’identification de nombreux gènes impliqués dans la formation et la réorganisation de la paroi chez le peuplier. Certains de ces gènes semblent spécifiquement impliqués dans la réorganisation de la paroi dans la réponse à ce type de stress (Andersson-Gunnerås et al., 2006; Mizrachi et al., 2015).
L’étude de la formation du bois chez l’Eucalyptus est un enjeu stratégique
L’Eucalyptus est le feuillu le plus planté au monde
Le genre Eucalyptus est natif d’Australie et Nouvelle Guinée où la plupart des climats sont représentés. Ils sont implantés naturellement du niveau de la mer jusqu’en altitude, dans des zones humides, tempérées et semi-arides (Eldridge, 1994). Avec environ 700 espèces, ce genre présente une adaptabilité remarquable à une variété de climats. L’Australie ayant un climat globalement chaud, la majorité des espèces ont une bonne tolérance aux conditions arides, mais ne sont pas résistantes aux conditions gélives. Hormis quelques espèces d’altitude, l’Eucalyptus n’est pas adapté au froid intense. Bien que ses mécanismes d’acclimatation apparaissent très efficaces (Keller et al.; Nguyen et al., 2017), sa croissance opportuniste du fait de l’absence d’endodormance et la persistance de ses feuilles en hiver, le rendent très vulnérable aux gelées hivernales. Par ailleurs, le fait qu’il dispose d’un lignotuber, lui donne la possibilité de produire des rejets de la souche suite à la coupe, ce qui le rend adéquat pour la culture en taillis.
Cette grande diversité a permis l’introduction de l’Eucalyptus dans plus de cent pays aux climats très variés. Il représente actuellement environ 8% des forêts plantées dans le monde, avec une implantation en constante progression (Rockwood et al., 2008). Ceci en fait le feuillu le plus planté avec plus de 20 millions d’hectares de plantations (Food and Agriculture Organization of the United Nations., 2011; Myburg et al., 2014). Quatre espèces, E. camaldulensis, E. grandis, E. urophylla, E. globulus, et leurs hybrides, représentent 80% de ces plantations (Teulières et al., 2007). L’Eucalyptus grandis et des hybrides E. grandis x E. urophylla, sont les plus plantés dans des régions tropicales et subtropicales d’Amérique du sud, d’Afrique et d’Asie. Eucalyptus globulus est l’espèce la plus plantée en régions tempérées, autour du bassin méditerranéen, au Portugal, Espagne, Chili et Australie, tandis qu’Eucalyptus camaldulensis est principalement planté dans des zones semi-arides à arides (Afrique du nord par exemple). Dans des régions froides d’Europe, telles que la France, ou d’Amérique du Nord, Eucalyptus gunnii est cultivé en tant qu’espèce pure ou utilisé pour l’introgression de la tolérance au gel dans des espèces à plus forte productivité telles qu’E. dalrympleana (hybrides E. gunnii x E. dalrympleana, souvent nommé E. gundal).
La plus grande part des plantations d’Eucalyptus se trouvent en zones tropicales et sub-tropicales où l’E. grandis (W. Hill ex Maiden) assure des rendements de production records dépassant les 70m3.ha-1.an-1 sur des plantations à temps de rotation courts (6 à 8 ans) (Rockwood et al., 2008). Au Brésil, sur les 170 millions de m3 de bois consommés, environ 80% correspondent à du bois d’Eucalyptus. Ce bois est utilisé principalement pour la production de pâte à papier (36.1%), comme source d’énergie par combustion directe (26.3%) ou production de charbon (10%), et comme bois d’œuvre ou d’ameublement (26.2%) (Gonçalves et al., 2013). Ces très fortes productions et les propriétés exceptionnelles du bois de certaines espèces, font de l’Eucalyptus une excellente source de biomasse pour la production de bioénergie. Que ce soit par combustion ou pour la production de produits dérivés de la cellulose tels que les biocarburants de seconde génération, la production de bioénergie représente un enjeu économique considérable dans une période où la demande d’énergie à l’échelle mondiale explose (Rockwood et al., 2008; Carroll and Somerville, 2009; Mizrachi et al., 2012). Par conséquent, on observe une forte implication des entreprises privées dans les programmes de sélection variétale, ainsi que dans les approches de biotechnologies qui ont pour but d’optimiser la qualité de la biomasse ainsi que les processus industriels de transformation.
Différents outils pour l’amélioration génétique sont disponibles
De par sa très large implantation au niveau mondial et son mode de culture en temps de rotation courts, il est de plus en plus désigné comme une espèce de grande culture ligneuse (Hinchee et al., 2009). À ce titre, il bénéficie de programmes d’amélioration génétique initiés depuis une trentaine d’années (Sederoff et al., 2009). Par des approches de génétique classique, plusieurs régions du génome, ou QTLs (quantitative trait loci), ont été associées à la croissance (Grattapaglia et al., 2009). Par exemple, la propagation de l’Eucalyptus se faisant généralement par bouturage, des QTLs pour la capacité à enraciner, à rejeter et pour la croissance de la tige, ont été détectés chez plusieurs espèces d’Eucalyptus (E. grandis, E. globulus notamment) (Grattapaglia et al., 1995; Marques et al., 1999). Des QTLs ont également été décrits pour la croissance et la qualité du bois chez E. grandis (Grattapaglia et al., 1996; Kirst et al., 2004). L’accès aux phénotypes moléculaires comme la quantification des transcrits des gènes par exemple, apportent des informations complémentaires aux données obtenues par des approches de génétique classique. Les données génomiques peuvent alors être analysées comme des traits moléculaires quantitatifs. Ce qui permet d’identifier des loci qui contribuent à la variation de l’expression de certains gènes, nommés QTL d’expression ou eQTL. Ces données peuvent ensuite être intégrées dans un modèle en prenant en compte des interactions avec a priori (appartenance à des voies métaboliques, interactions protéine-protéine ou sens de régulation) et des traits phénotypiques (croissance, qualité du bois) (Mizrachi and Myburg, 2016; Mizrachi et al., 2017).
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Table des matières
Introduction générale
Introduction générale
1. Le système vasculaire
1.1. Formation du système vasculaire lors de la croissance primaire
1.2. La croissance secondaire
1.2.1. Le phloème secondaire
1.2.2. Le xylème secondaire ou bois
2. Les mécanismes moléculaires assurant la formation du bois
2.1. Les différents modèles pour l’étude de la formation du bois
2.1.1. Les cultures cellulaires de Zinnia et Arabidopsis
2.1.2. Les plantes herbacées
2.1.3. Les plantes pérennes
2.2. Le processus de formation du bois
2.2.1. Différenciation à partir du cambium, expansion et dépôt de la paroi primaire
2.2.2. Formation de la paroi secondaire
2.2.2.1. Biosynthèse des polysaccharides
2.2.2.2. Biosynthèse et polymérisation de la lignine
2.2.3. Mort programmée et formation du bois de coeur
3. Régulation de la formation du bois
3.1. Régulation de l’activité cambiale et de la différenciation des cellules du xylème
3.2. Régulation transcriptionnelle de la formation de la paroi secondaire
3.2.1. Les facteurs de transcription de type MYB et NAC sont des régulateurs clés
3.2.2. Le réseau de FT tel qu’il est connu chez la plante modèle Arabidopsis
3.2.3. Conservation du réseau de régulation du dépôt de paroi chez les espèces pérennes
4. Plasticité de la formation du bois dans l’adaptation aux contraintes environnementales
4.1. Quelles contraintes environnementales ?
4.2. Impact de ces stress sur la formation du bois
4.3. Cas du bois de réaction
5. L’étude de la formation du bois chez l’Eucalyptus est un enjeu stratégique
5.1. L’Eucalyptus est le feuillu le plus planté au monde
5.2. Différents outils pour l’amélioration génétique sont disponibles
6. Hypothèses et objectifs de la thèse
6.1. Analyse des réseaux de régulation impliqués dans le contrôle de la formation du bois en conditions de stress abiotiques
6.1.1. Caractérisation de l’effet du froid sur la formation du bois chez E. gundal
6.1.2. Caractérisation de l’effet de la sécheresse combinée à différents régimes nutritifs sur la formation du bois chez E. grandis
6.2. Caractérisation fonctionnelle de facteurs de transcription impliqués dans la régulation de la formation du bois en condition de stress abiotiques
7. Références
CHAPITRE I : Long cold exposure induces transcriptional and biochemical remodelling of xylem secondary cell wall in Eucalyptus
Abstract
Résumé
Préambule
1. Introduction
2. Materials and Methods
2.1. Plant material and cold treatment
2.2. RNA isolation
2.3. Quantitative RT-PCR
2.4. Biochemical analyses of SCWs
2.5. Microscopy and histochemistry
2.6. Co-expression network analyses
3. Results
3.1. Analyses of xylem structure in plants submitted to low temperatures
3.2. Effects of cold on lignin content in differentiating xylem
3.3. Transcriptional regulation of genes related to SCW biosynthesis
3.4. Xylem SCW transcriptional regulators induced by cold
4. Discussion
5. Acknowledgements:
6. References
7. Supplementary data
CHAPITRE II : Water deficiency and potassium supply trigger interconnected signals to modulate wood formation in Eucalytpus grandis xylem
Abstract
Résumé
Préambule
1. Introduction
2. Materials and Methods
2.1. Plant material and sampling
2.2. Ecophysiological data
2.3. RNA isolation
2.4. RNA sequencing
2.5. Validation by quantitative RT-PCR
2.6. Metabolite extraction and LC-MS analysis
2.7. Metabolite extraction and GC-MS analysis
2.8. Biochemical analyses of SCW
2.9. Microscopy and histochemistry
2.10. Statistical analyses and data integration
2.11. Sequence isolation and cloning
2.12. Plant transformation and sampling
2.13. GUS assay
3. Results
3.1. Gene expression are regulated by K supply and water availability in xylem
3.2. Soluble metabolites are regulated by K supply and water availability in xylem
3.3. Transcriptomic and metabolomic data integration through correlation network analyses126
3.4. Correlation between wood properties and network modules
3.5. Identification of TFs related to wood formation in response to water exclusion and potassium fertilization
3.6. Characterization of EgMYB137 as a key player in xylem formation in Eucalyptus
4. Discussion
4.1. H2O availability and K fertilization trigger interconnected regulations in xylem
4.2. SCW formation is at the heart of xylem response to water and nutrition
4.3. Key regulatory genes and metabolite markers of SCW biosynthesis highlighted by coregulation network
5. References
6. Supplemental data
CHAPITRE III : Caractérisation fonctionnelle de quatre nouveaux facteurs MYBs potentiellement impliqués dans la régulation de la xylogenèse chez l’Eucalyptus
Abstract
Résumé
Préambule
1. Introduction
2. Materiel et méthodes
2.1. Analyse phylogénétique
2.2. Isolement des séquences et clonage
2.3. Transformation des plantes
2.4. Extraction des ARN et analyses d’expression par RT-PCR quantitative
2.5. Analyses biochimiques de la paroi
2.6. Analyses GUS
2.7. Microscopie et histochimie
3. Caractérisation fonctionnelle d’EgMYB36, membre du sous-groupe 5 « Woody-Expanded »
3.1. Résultats – EgMYB36
3.1.1. EgMYB36 est membre du sous-groupe 5
3.1.2. La surexpression d’EgMYB36 augmente faiblement la teneur en lignine des tiges des peupliers
3.1.3. La surexpression d’EgMYB36 chez le peuplier modifie l’expression des gènes de biosynthèse des parois et des métabolites secondaires
3.1.4. Régulation des gènes impliqués dans le contrôle du développement du xylème et du dépôt de paroi dans les peupliers 35S:EgMYB36
3.2. Discussion – EgMYB36
4. Caractérisation fonctionnelle de trois R2R3-MYBs, membres des sous-groupes « Woody- Preferential » WPS-II et WPS-III
4.1. Résultats – EgMYB20
4.1.1. EgMYB20 est un membre du sous-groupe WPS-III
4.1.2. La surexpression d’EgMYB20 chez le peuplier induit une réduction de croissance et une augmentation de la teneur en lignine
4.1.3. La surexpression d’EgMYB20 induit une forte réduction du niveau des transcrits codant des enzymes impliquées dans la biosynthèse des polysaccharides pariétaux.
4.1.4. Effets de la surexpression d’EgMYB20 sur les gènes régulateurs contrôlant le développement du xylème et le dépôt de paroi secondaire
4.2. Discussion – EgMYB20
4.3. Résultats – EgMYB64/EgMYB68
4.3.1. EgMYB64 et EgMYB68 d’Eucalyptus appartiennent au sous-groupe WPS-II
4.3.2. EgMYB64 et EgMYB68 ont des profils d’expression distincts
4.3.3. Chez le peuplier, la surexpression d’EgMYB68 affecte la formation du bois tandis qu’aucun phénotype n’est détecté pour la surexpression d’EgMYB64
4.3.4. La surexpression d’EgMYB68 induit une augmentation des transcrits des gènes impliqués dans la biosynthèse de la paroi secondaire chez le peuplier
4.3.5. La surexpression d’EgMYB64 induit des modifications dans la composition des racines
d’E. grandis
4.4. Discussion – EgMYB68
4.5. Discussion – EgMYB64
5. Discussion – Chapitre III
6. Références
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