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RAPPELS SUR LES FLAVIVIRUS ZIKA ET DENGUE
Classification
Les VZIK et VDEN appartiennent au genre flavivirus de la famille des Flaviviridae (figure 1) (Kuno & Chang, 2005, 2007). Ce genre compte plus de 70 espèces virales parmi lesquelles le virus de la fièvre jaune, de l’encéphalite japonaise ou des encéphalites à tiques. Le VDEN existe sous forme de 4 sérotypes appelés DEN-1 à DEN-4 (Russell et al., 1967). L’infection par un sérotype entraîne une immunité durable contre ce sérotype, mais il n’y a pas d’immunité croisée entre les sérotypes. Pour le VZIK, un seul sérotype a été décrit à ce jour.
Cycle écologique
Vecteurs
Après un repas sanguin du moustique femelle sur un hôte virémique, les VZIK et VDEN subissent une phase d’éclipse d’au moins 8 à 10 h qui correspond au franchissement de l’épithélium intestinal et à leur diffusion par l’hémolymphe. Les virus gagnent ensuite les glandes salivaires (Rodhain, 1985). Le moustique est alors capable d’infecter un nouvel hôte vertébré pendant toute la durée de sa vie. Aedes aegypti est le principal vecteur épidémique du VDEN. Cependant, il peut être remplacé par d’autres Aedes tels que Aedes albopictus qui sévit essentiellement en Asie et depuis peu en Europe et en Amérique (Madon et al., 2002). Le VZIK a été aussi isolé du moustique Aedes aegypti dans la nature et le rôle vecteur du moustique a été démontré expérimentalement (Marchette et al., 1969 ; Boorman & Portfield, 1956). En milieu selvatique ouest africain les vecteurs habituels des VZIK et VDEN sont du genre Aedes (Aedes furcifer, Aedes luteocephalus, Aedes taylori). Le VZIK a en outre été isolé des genres Mansonia, Anopheles et Eretmapodites. A ce jour, aucune donnée n’est disponible sur les vecteurs responsables de la transmission du VZIK au cours de l’épidémie de Micronésie en 2007. Une transmission verticale des VZIK et VDEN a également été mise en évidence au laboratoire et dans la nature (Cornet et al., 1979 ; Rosen, et al.,1983).
Hôte
En dehors de l’homme, les VZIK et VDEN ont été aussi isolés chez le singe en milieu selvatique en Afrique de l’Ouest (Cornet et al., 1984 ; Hervy et al., 1984), en Malaisie (Rudnick et al., 1967 ; Knudsen, 1977) et en Bornéo (Nathan et al., 2001). L’homme, une fois contaminé lors de la piqûre d’un moustique infecté, va permettre pendant la phase de virémie qui est d’environ 7 jours, l’infection d’un autre moustique.
Cycle de transmission
Le cycle de transmission des VZIK et VDEN virus fait intervenir un moustique et un hôte vertébré (homme ou singe). Il se fait selon deux modes épidémiologiques : cycle domestique (dans un contexte urbain ou rural) et un cycle sauvage.
Cycle sauvage
Dans le cycle sauvage, les VZIK et VDEN circulent entre le singe et les vecteurs sauvages tels qu’Aedes furcifer, Aedes taylori, Aedes luteocephalus, Aedes sp, Aedes finlaya (Cornet et al., 1979 ; Cornet et al ., 1984 ; Gubler, 1998 ) (figure 2). Ce cycle se déroule essentiellement en forêt et l’homme peut accidentellement être infecté et initier ainsi un cycle épidémique.
Cycle domestique
Dans le cycle urbain ou rural, le moustique s’infecte sur des humains contaminés et transmet le virus à des humains sensibles. Le vecteur est généralement Aedes aegypti et Aedes albopictus (Wang et al., 2000) (Figure 2) .
Structure et composition des flavivivrus
Comme les autres flavivirus, les VZIK et VDEN sont constitués d’un génome d’ARN simple brin entouré d’une capside d’environ 30 nm de diamètre. Cette nucléocapside est elle-même recouverte d’une enveloppe lipidique et donne au virion mature l’aspect d’une particule sphérique lisse d’environ 50 nm de diamètre (figure 3). Cette organisation structurale fait que ces virus sont très sensibles à de nombreux traitements tels que les lipases, des solvants lipidiques, des détergents et sont très efficacement inactivés par traitement à la betapropiolactone ou à une température supérieure à 56 °C.
Génome viral
Les génomes des flavivirus sont des ARN simples brin d’environ 11 kb (Chambers et al., 1990). La majeure partie du génome consiste en un seul cadre de lecture ouvert qui code pour une polyprotéine d’environ 3400 acides aminés composant l’ensemble des protéines virales (Figure 4). Cet unique cadre de lecture est flanqué d’une région 5’ non codante d’environ 100 nucléotide et la région 3’non codante (3’NC) d’environ 500 et 700 nucléotides (Chambers et al., 1990).
Protéines virales
Les virions matures contiennent trois protéines structurales. La protéine de la capside C, composant structural unique de la capside de symétrie icosaédrique, s’associe à l’ARN viral lors de l’encapsidation. La nucléocapside ainsi formée, est entourée d’une enveloppe composée de la protéine d’enveloppe E et de la protéine de membrane M associées aux lipides provenant de l’hôte cellulaire. Les virions immatures intracellulaires contiennent également la protéine prM, précurseur de M. Les protéines structurales C, prM/M et E du virion sont codées à l’extrémité 5’ du génome viral suivies des 7 protéines non structurales, dans l’ordre, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5 (figure 4) (Perera & Kuhn, 2008).
La protéine C
C’est une protéine d’environ 11 kDa chargée positivement. Par cette propriété, cette protéine neutraliserait les charges négatives de la molécule d’ARN viral, à laquelle elle est associée (Rice et al., 1985 ; Ma et al., 2004). Elle est la première protéine synthétisée et est essentielle dans l’assemblage et l’encapsidation de l’ARN génomique viral (Ferlenghi et al., 2001).
La protéine M
Deux formes de la glycoprotéine M ont été caractérisées : prM, contenue dans les virions intra-cellulaires immatures et précurseur de la protéine structurale M ; et la protéine M, contenue dans les virions extracellulaires matures. La glycoprotéine précurseur de la protéine M, prM est d’environ 26 kDa. La protéine prM joue un rôle dans l’assemblage et la morphogenèse des flavivirus. Le clivage de prM en M par les protéases de type furine du compartiment, trans-golgien permet aux virions de devenir infectieux (Perera & Kuhn, 2008).
La protéine E
La protéine E (environ 53 kDa) est la protéine majeure de structure. Elle est impliquée, à la fois, dans les processus d’attachement et d’entrée du virus dans la cellule (Lozach et al., 2005). La connaissance des différents épitopes (Heinz et al., 1990) et des ponts disulfures formés par les 12 cystéines parfaitement conservés chez les flavivirus (Nowak & Wengler, 1987), a permis de proposer un modèle de structure bidimensionnelle et tridimensionnelle pour l’ensemble des protéines E du genre (Rey et al., 1995). Ce modèle fait apparaître trois domaines antigéniques distincts A (domaine II), B (domaine III) et C (domaine I) (figure 5). Les propriétés antigéniques du domaine I seraient liées à la présence des ponts disulfures, en l’absence desquels la plupart des anticorps monoclonaux ne le reconnaissent plus (Heinz et al., 1990). Ce domaine est reconnu par les anticorps monoclonaux présentant les plus fortes activités de neutralisation et d’inhibition de l’hémagglutination. Le domaine III contient les sites de liaison aux récepteurs (Roehrig, 2003 ; Crill & Roehrig, 2001). De plus, les mutations responsables du changement de tropisme, affectant l’entrée virale, et responsables de modifications de virulence (Roehrig, 2003) y sont localisées. Le domaine II est formé par une boucle qui n’est maintenue par aucun pont disulfure ; en revanche, il porte pour de nombreux flavivirus un site de glycosylation. La protéine E du VDEN a 2 sites de glycosylation potentiels : Asn-67 (N67) et Asn-153 (N153). Ce dernier est conservé chez la plupart des flavivirus alors que l’Asn-67 n’est observé que chez le VDEN (Heinz et al., 2003). La glycosylation de ces sites jouerait un rôle dans l’attachement et l’entrée du virus dans la cellule (Scherret et al., 2001 ; Shirato et al., 2004 ; Lozach et al., 2005 ; Beasley et al., 2005; Bryant et al., 2007 ; Mondotte et al., 2007 ; Vasilakis et al., 2007).
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Table des matières
INTRODUCTION
A. GENERALITES
A. 1. RAPPELS SUR LES FLAVIVIRUS ZIKA ET DENGUE
A. 1. 1. CLASSIFICATION
A. 1. 2. CYCLE ECOLOGIQUE
A. 1. 2. 1. Vecteurs
A.1. 2. 2. Hôte
A.1.2.3. Cycle de transmission
A.1.2.3.1. Cycle sauvage
A.1.2.3.2. Cycle domestique
A.1.3. STRUCTURE ET COMPOSITION DES FLAVIVIVRUS
A.1.3.1. Génome viral
A.1.3. 2. Protéines virales
A.1.2.2.1. La protéine C
A.1.2.2.2. La protéine M
A.1.2.2.3. La protéine E
A.1.2.2.4. La protéine NS1
A.1.2.2.5. La protéine NS3
A.1.2.2.6. La protéine NS5
A.1.2.2.7. Les protéines NS2 et NS4
A.1.4. CYCLE VIRAL
A.1.4.1. Adsorption et pénétration
A.1.4.2. Réplication virale
A.1.4.3. Traduction et maturation des protéines virales
A.1.4.4. Assemblage et relargage des virions
A.1.5. EVOLUTION DES FLAVIVIVRUS
A.1.6. DIAGNOSTIC, TRAITEMENT ET PREVENTION
A.1.6.1. Diagnostic
A.1.6.1.1. Isolement et identification du virus
A.1.6.1.2. Le séro-diagnostic
A.1.6.1.3. Le diagnostic moléculaire
A.1.6.2. Traitement
A.1.6.3. Prévention
A.1.6.3.1. Lutte anti-vectorielle
A.1.6.3.2. Développement de vaccins
A.2. GENERALITES SUR LE VIRUS ZIKA
A.2.1. HISTORIQUE DU VIRUS ZIKA
A.2.2. DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DU VIRUS ZIKA
A.2.3. MANIFESTATIONS CLINIQUES DU VIRUS ZIKA
A.2.4. SITUATION DU VIRUS ZIKA AU SENEGAL
A.3. GENERALITES SUR LE VIRUS DE LA DENGUE
A.3.1. HISTORIQUE DU VIRUS DE LA DENGUE
A.3. 2. DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DU VIRUS DE LA DENGUE
A.3.3. MANIFESTATIONS CLINIQUES
A.3.3.1. La fièvre de dengue classique
A.3.3.2. La fièvre hémorragique de dengue et le syndrome choc
A.3.4. SITUATION DU VIRUS DE LA DENGUE AU SENEGAL
B – EVOLUTION MOLECULAIRE DU VIRUS ZIKA EN AFRIQUE DE L’OUEST
B.1. MATERIEL ET METHODES
B.1.1. MATERIEL
B.1.1.1. Cellules AP61
B.1.1.2. Virus
B.1.2. METHODES
B.1.2.1. Plan général de l’étude
B.1.2.2. Extraction d’ARN du virus Zika
B.1.2.3. Transcription inverse et réaction de polymérisation en chaîne du virus Zika
B.1.2.3.1. RT-PCR des génomes partiels
B.1.2.3.1.1. RT avec le Kit Superscript II
B.1.2.3.1.2. RT avec le kit Promega
B.1.2.3.1.3. PCR des génomes partiels
B.1.2.3.2. RT-PCR des génomes complets
B.1.2.4. Séquençage
B.1.2.5. Analyse phylogénétique
B.1.2.6. Recombinaison
B.1.2.7. Analyse phylodynamique
B.1.2.8. Analyse de migration
B.2. RESULTATS
B.2.1. ANALYSE DES ALIGNEMENTS DE SEQUENCES DU VIRUS ZIKA
B.2.2. ANALYSE PHYLOGENETIQUE DU VIRUS ZIKA
B.2.3. ANALYSE DES SOUCHES RECOMBINANTES DU VIRUS ZIKA
B.2.4. PHYLODYNAMIQUE DU VIRUS ZIKA
B.2.5. ANALYSE DE MIGRATION DU VIRUS ZIKA
B.3. DISCUSSION
B.4. CONCLUSION
C – DEVELOPPEMENT DE METHODES DE DETECTION MOLECULAIRES DU VIRUS ZIKA
C.1. MATERIEL ET METHODES
C.1.1. MATERIEL POUR LA RT-PCR QUALITATIVE ET QUANTITATIVE
C.1.1.1. Cellules Véro
C.1.1.2. Virus
C.1.2. METHODES
C.1.2.1. Plan général de l’étude
C.1.2.2. Méthodes RT-PCR qualitative
C.1.2.2.1. Construction des amorces pour la RT-PCR qualitative
C.1.2.2.2. Amplification par RT-PCR qualitative
C.1.2.2.3. Evaluation de la méthode RT-PCR qualitative
C.1.2.2.3.1. Spécificité
C.1.2.2.3.2. Seuil de détection
C.1.2.2.3.2.1. Titrage du virus Zika par la méthode des plages
C.1.2.2.3.2.2. Détermination du seuil de sensibilité
C.1.2.2.3.3. Répétabilité
C.1.2.3. Méthodes RT-PCR quantitative
C.1.2.3.1. Choix des amorces et de la sonde
C.1.2.3.2. Principe et conditions de la RT-PCR temps réel
C.1.2.3.3. Evaluation de la méthode RT-PCR quantitative
C.1.2.3.3.1. Spécificité
C.1.2.3.3.2. Seuil de détection
C.1.2.3.3.2.1. Préparation d’ARN standard
C.1.2.3.3.2.1.1. Transcription
C.1.2.3.3.2.1.2. Quantification de l’ARN synthétique
C.1.2.3.3.2.2.3. Détermination du seuil de détection
C.1.2.3.3.3. Répétabilité
C.2. RESULTATS
C.2. 1. RESULTATS RT-PCR QUALITATIVE
C.2.1.1. Choix des amorces
C.2.1.2. Evaluation de la méthode RT-PCR qualitative
C.2.2. RESULTATS RT-PCR QUANTITATIVE
C.2.2.1. Choix des amorces
C.2.2.2. Spécificité de la méthode RT-PCR temps réel
C.2.2.3. Seuil de détection de la méthode RT-PCR temps réel
C.3. DISCUSSION
C.4. CONCLUSION
CONCLUSION
