Rappels sur la physiologie et l’exploration de la coagulation

Physiologie de la coagulation

L’hémostase est le processus physiologique destiné à colmater une brèche vasculaire grâce à la formation rapide d’un caillot fait de plaquettes agrégées entre elles, enserrées dans un réseau de fibrine. Lorsque le vaisseau est intact, le sang reste fluide car il est au contact de la monocouche de cellules endothéliales qui, par ses fonctions régulatrices, protège de la thrombose. L’initiation de la coagulation est due à une effraction vasculaire qui expose les différentes structures du sous endothélium (collagène, facteur tissulaire…) qui ellesmêmes provoquent l’activation des plaquettes et des protéines de la coagulation présentes dans le sang. La transformation du fibrinogène en fibrine est l’aboutissement d’une série de réactions enzymatiques qui s’enchaînent à la surface des plaquettes fixées sur la brèche vasculaire. Plusieurs systèmes de régulation interviennent, de façon à ce que la formation du caillot soit rapide, localisée et limitée, pour permettre la cicatrisation sans obstruer la lumière vasculaire.

Les acteurs 

La thrombine (FIIa) est une enzyme qui est l’acteur majeur de la coagulation. Elle ne peut circuler dans le sang sous sa forme enzymatique et existe donc sous une forme inactive: la prothrombine (FII). Son activation résulte d’une série d’activation d’autres molécules enzymatiques (facteurs de la coagulation) qui elles aussi circulent dans le sang presque tous (sauf le facteur VII) sous forme inactive. Une fois activés les facteurs de la coagulation portent leur nom suivi du suffixe “a”.

Les facteurs de la coagulation sont au nombre de 12 dont la plus part sont désignés par un chiffre romain. A côté de ces facteurs la coagulation plasmatique fait intervenir le facteur tissulaire et les inhibiteurs physiologiques .

En fonction de leurs structures et leurs fonctions ces facteurs sont regroupés en différentes catégories :
● Les pro-enzymes
– Les facteurs (II, VII, IX et X) sont vitamine K dépendants ; ce sont des zymogènes de sérine protéase, enzymes protéolytiques.
– Les facteurs contact : prékallicreine, XI et XII sont également des zymogènes de sérine protéase.
– Le facteur XIII est un zymogène d’une transglutaminase enzyme établissant des liaisons covalentes entre deux protéines.
● Les cofacteurs
Les facteurs V et VIII et le Kiminogène de haut poids moléculaire n’ont pas d’activité enzymatique mais ils jouent un rôle de cofacteur. Les facteurs V et VIII vont acquérir cette fonction après activation par protéolyse.
● Le fibrinogène est le substrat final des réactions de coagulation. Il s’agit d’une protéine soluble transformée par la thrombine en protéine insoluble.

Les mécanismes

Les étapes classiques du phénomène de coagulation 

Thromboplastinoformation
L’hémostase primaire aboutit à la formation d’un clou plaquettaire dont la structure doit être consolidée par les mailles d’un filet formé par la fibrine. Cette fibrine se forme lors de la coagulation plasmatique et provient de la transformation du fibrinogène en fibrine. On observe rapidement une gélification du sang due à la transformation du fibrinogène soluble en fibrine insoluble. Cette transformation est la conséquence de l’action d’une enzyme : la thrombine. Et classiquement ce phénomène de coagulation se fait selon deux voies d’activation qui se rejoignent en une voie commune (Figure 1).

– La voie exogène : le déclenchement de la coagulation a lieu lorsque le sang circulant rentre en contact avec du facteur tissulaire (FT). Ce FT n’existe pas en circulation mais est présent au niveau du sous endothélium mis en contact avec le sang par la brèche vasculaire. Le FT se fixe au facteur VII (FVII) de la coagulation qui est activé en FVIIa. Le complexe FT/FVIIa va, en présence de phospholipides (PL) et de calcium, former un complexe enzymatique qui active un autre facteur circulant, le facteur X en facteur X activé (FXa). Ces phospholipides proviennent des cellules vasculaires lésées et des plaquettes activées.
– La voie endogène : le complexe FT/Facteur VII activé est également capable d’activer le facteur IX ou facteur anti-hémophilique B. Le Facteur IXa se fixe à la surface des phospholipides en présence de facteur VIIIa (facteur anti-hémophilique A activé) pour former en présence de calcium un complexe enzymatique ; le complexe Ténase activateur du FX qui rejoint la voie de la coagulation initiée par le FT.
– La voie commune : A son tour, le facteur Xa se regroupe avec le facteur V sur les phospholipides pour former le complexe Prothrombinase.

● Thrombinoformation
La Prothrombinase qui active la prothrombine en thrombine toujours en présence de calcium. Elle coupe la prothrombine en plusieurs fragments dont la thrombine qui sera activée.
● Fibrinoformation
Le fibrinogène est constitué de 3 paires de chaines polypeptides A/alpha, B/béta, gamma réunies par des ponts sulfuriques (S-S). La thrombine (IIa) clive les peptides A et B de faibles poids moléculaire des chaines A/alpha et B/béta. Il s’en suit une polymérisation des monomères de fibrine soluble et l’action du FXIII ou facteur stabilisant la fibrine créant des liaisons covalentes qui rend la fibrine insoluble.
● Fibrinolyse : Dissolution du caillot de fibrine
Lorsque de la fibrine s’est formée dans l’organisme celle-ci devra être dissoute lorsque le saignement s’est arrêté. Cette phase est appelée fibrinolyse. De nouvelles enzymes interviennent comme la plasmine qui va couper la molécule de fibrine et la rendre soluble. Cette étape contribue également à la réparation du vaisseau blessé.

La conception réelle de la coagulation in vivo 

● Phase d’initiation
Le facteur tissulaire (FT) est exposé et se lie au FVII, qui est ensuite activé en FVIIa. Le complexe entre le FT et le FVIIa active le FIX et le FX. Le FXa se lie au FVa sur la surface cellulaire.
● Phase d’amplification
Le complexe FXa/FVa transforme de faibles quantités de prothrombine en thrombine. La faible quantité de thrombine générée active localement les FVIII, FV, FXI et les plaquettes. Les plaquettes activées fixent les FVa, FVIIIa et FIXa.
● Phase de propagation
Le complexe FVIIIa/FIXa active le FX à la surface des plaquettes activées. Le FXa, en association au FVa, transforme d’importantes quantités de prothrombine en thrombine, engendrant ainsi un “pic de thrombine”. Le “pic de thrombine” provoque la transformation du fibrinogène en fibrine aboutissant à la formation d’un caillot de fibrine stable. La formation de la thrombine (thrombinoformation) est un phénomène explosif, la thrombine est capable d’amplifier la cascade de la coagulation et donc sa propre formation. De plus la thrombine active les plaquettes et favorise l’étape de l’hémostase primaire.

Les processus de régulation 

Tout système d’activation, comme celui de la coagulation, possède un système naturel inhibiteur afin d’éviter son emballement. L’inhibition de la coagulation a lieu principalement grâce à 4 inhibiteurs :
– L’antithrombine qui comme son nom l’indique inhibe la thrombine mais également la plupart des facteurs activés (enzymes) de la coagulation.
– Le couple de la protéine C et de la protéine S qui inhibent les facteurs VIII et V de la coagulation
– le TFPI (inhibiteur de la voie du FT) qui inhibe le facteur VIIa couplé au facteur tissulaire.

Exploration de la coagulation 

Méthodes d’analyseurs de la coagulation 

Technique manuelle 
Bien que beaucoup d’instruments soient proposés pour les tests de coagulation et utilisés partout dans le monde, la technique d’inclinaison manuelle du tube est toujours employée avec succès dans de nombreux centres. Même là où l’automatisation est utilisée, il peut être nécessaire d’effectuer certains tests manuellement en raison de l’incompatibilité occasionnelle entre l’échantillon et l’instrument particulier utilisé. Ceci peut être le cas en présence de concentrations très élevées de lipides plasmatiques, lors de l’analyse d’un échantillon ictérique ou lorsque le mode de formation des caillots dans l’échantillon diffère de façon marquée par rapport aux échantillons normaux, particulièrement lorsque la concentration en fibrinogène est nettement réduite. Les tests manuels de coagulation sont idéalement effectués dans des tubes de verre. Différents types de verre peuvent être utilisés avec succès, mais ils peuvent influencer le temps de coagulation obtenu, surtout dans les tests de dépistage comme le temps de céphaline activée (TCA). Si possible, éviter la réutilisation de tubes à essai après lavage. En raison des nombreuses variables et sources possibles de contamination liées aux techniques manuelles, les tests doivent être effectués en double. Dans tous les cas, si les temps de coagulation obtenus lors des tests en double diffèrent de plus de 10 %, le test doit être fait de nouveau. Les précautions suivantes sont importantes pour la technique d’inclinaison manuelle du tube :
– Les réactifs doivent être préchauffés à 37 °C pendant au moins cinq minutes avant leur utilisation.
– Le mélange du réactif et du plasma testé doit être fait aussitôt que la dernière composante du mélange est ajoutée, en remuant rapidement et de façon contrôlée le tube à essai pendant une à deux secondes au chronomètre.
– Le mélange doit ensuite être incliné à 90° à trois reprises toutes les cinq secondes en observant la formation du caillot. Le temps de coagulation est noté.

Le tube à essai doit être immergé dans un bain d’eau à 37 °C (+/- 0,5 °C) entre les inclinaisons, de sorte que la base du tube d’essai se situe à environ 3 à 4 cm sous la surface, afin de faciliter le maintien de la température du mélange d’incubation aussi près de 37 °C que possible. Le mélange doit être examiné attentivement à l’œil, sous une lampe ou une autre source de lumière semblable et le temps de coagulation doit être noté .

Coagulométres 

L’automatisation dans les laboratoires d’analyse de la coagulation a contribué à l’amélioration de la standardisation et à faciliter les tests qui exigent une formation et des conditions de travail spécifiques. Ainsi, les laboratoires peuvent améliorer leur efficacité et profiter d’un meilleur catalogue de prestations. L’automatisation dans le domaine de l’hémostase est relativement récente. Les méthodes manuelles basées sur la détection visuelle du caillot de fibrine et au moyen de bains-marie à 37 °C étaient autrefois les seules techniques d’étude de la coagulation. Ensuite, dans les années 1970, de nouveaux appareils semi-automatiques sont arrivés qui utilisaient des principes photométriques ou mécaniques pour détecter la fibrine. Plus récemment, des instruments entièrement automatisés sont couramment utilisés dans les laboratoires modernes. Aujourd’hui, de nouveaux appareils connectés à des systèmes de traitements de données spécifiques peuvent effectuer des tests de coagulation, chromogènes et immunologiques [1].

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Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS SUR LA PHYSIOLOGIE ET L’EXPLORATION DE LA COAGULATION
I. PHYSIOLOGIE DE LA COAGULATION
II. EXPLORATION DE LA COAGULATION
DEUXIEME PARTIE : NOTRE ETUDE
I. CADRE D’ETUDE
II. METHODOLOGIE
III RESULTATS
IV DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBIOGRAPHIQUES

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