Purification par la technique de dialyse

Purification par la technique de dialyse

Influence du stress thermique sur la sensibilité des fruits

Q uatre variété s d’anan as issues des parcelles d’expérimentation du Cirad à la Martinique sont étudiées : le Cayenne lisse, variété la plus répandue et sensible au BI ; le MD2, appelé encore Hawaïan Gold, ou Honey Gold, un hybride résistant au BI développé par Del Monte ; deux hybrides de la collection du Cirad à Rivière-Lézarde (Lamentin, Martinique) (voir Annexe 1) issus du croisement entre le Cayenne lisse et le Perolera : le RL41 et le RL53. Cinq conditions de traitement ont été établies pour le protocole expérimental, à raison de cinq fruits par variété et par traitement (Tableau). Les groupes sont constitués de manière homogène (taille, maturité). A chaque fois, les échantillons sont prélevés, préparés et conservés selon le même principe : deux lamelles de chair diamétralement opposées sont prélevées ; elles sont soit utilisées directement pour l’extraction, soit conservées à -20°C dans des sachets sous vide pour éviter la dégradation des enzymes.
Les fruits non passés au froid (NPF) correspondent au T0 de l’étude car utilisés immédiatement après la récolte, ils montrent l’état physiologique initial ; les fruits vieillis (Tv10, Tv20) permettent de suivre l’évolution de l’expression des enzymes étudiées à température ambiante ; les fruits conservés au froid pendant 10 jours (F10) permettent d’étudier l’expression précoce des enzymes ; les fruits passés au froid puis à température ambiante pendant 10 jours (PF10) permettent d’analyser l’expression des mêmes enzymes en fin du processus de conservation, là où apparaîssent les symptômes de BI.

Influence du stress biotique (nématodes) ou d’éliciteurs sur des variétés de sensibilités différentes.

 Sur ananas Trois variétés d’ananas, la MD2, la Cayenne Lisse et la RL53, sont traitées suivant cinq conditions différentes, à raison de dix échantillons par variété et par traitement. Pour chacune des variétés, les plants sont cultivés : – soit en terre stérilisée par autoclavage à 121°C pendant une heure; – soit en milieu hydroponique enrichi avec une solution nutritive changée chaque semaine (1 g/L de mairol) ; – soit en terre stérile mais traités au bout d’un mois avec deux éliciteurs endogènes différents une fois par semaine pendant quatre semaines : le méthyl jasmonate à 0,1 et 1 mM ou le stifénia1 à 20 g/L. – soit en milieu infesté avec des nématodes (Criconemella Onoensis, Rotylenchulus reniformis) ; L’étude biochimique de la feuille D (feuille représentative de l’état physiologique de la plante) et des racines des plants d’ananas est prévue deux mois après le lancement de l’expérimentation. Cette durée correspond au développement du premier « flush racinaire » c’est-à-dire au terme de la première poussée de croissance racinaire. Sur bananiers Deux variétés de bananiers diploïdes (AA) appartenant au genre Musa acuminata ont été sélectionnées. Il s’agit de la sous-espèce Banksii (BK) et de la variété Long Tavoy (LT), issues de culture in vitro. Les plants sont repiqués soit en milieu stérile (terre autoclavée à 121°C pendant 1h) pour les témoins (notés NI), soit en milieu stérile mais inoculé avec 400 individus de Pratylenchus coffeae (notée I). Pour chaque condition, quatre plants de chacune des espèces de bananiers sont laissés en terre durant 45 jours. Les échantillons sont ensuite préparés directement pour l’extraction ou bien conservés à -20°C dans des sachets sous vide.

Extraction protéique

sur la pulpe d’ananas (thèse BI)

Pour obtenir l’extrait enzymatique à partir de la chair d’ananas, 100 g de fruit frais ou décongelé sont broyés dans un blender (Waring Blendor) avec une solution d’extraction contenant 50 ml de tampon phosphate (Na2HPO4 (VWR, France) / NaH2PO4 (Merck, Allemagne)) ; à 0,2 M, pH 6,8, 4°C), 1 g de PVPP (PolyvinylPolypyrrolidone, 2%) (Merck, Allemagne), 0,750 g de NaCl à 1,5% (VWR, France) et 0,088 g d’acide ascorbique (Sigma-Aldrich, Allemagne), jusqu’à obtenir un liquide homogène. Le NaCl permet d’augmenter la force ionique tandis que le PVPP et l’acide ascorbique sont utilisés comme agents protecteurs. Après une première filtration sur étamine, 20 ml du même tampon phosphate (à 0,2 M, pH 6,8) sont rajoutés pour réaliser une deuxième filtration du même type. Les deux filtrats sont alors mélangés pour être centrifugés à 4°C pendant 25 minutes à 20 000 g. Cette étape permet d’éliminer les résidus solides et d’obtenir un surnageant clair qui est ensuite saturé avec du sulfate d’ammonium ((NH4)2SO4, Merck, Allemagne). La précipitation des protéines se fait en deux temps : d’abord à 30% puis à 90% de saturation en (NH4)2SO4 mais toujours à 4°C. A chaque fois, les protéines floculent pendant une nuit, ce sel montrant peu d’effet dénaturant.

sur les feuilles : ananas et bananier (thèse BI et mises au point)

Le protocole sur la pulpe d’ananas a été réajusté pour réaliser l’extraction protéique sur les feuilles d’ananas et de bananier. Pour obtenir l’extrait enzymatique à partir des feuilles, 1 g de tissu lyophilisé est broyé dans un blender (Waring Blendor) avec une solution d’extraction contenant 2 ml de tampon phosphate (Na2HPO4 / NaH2PO4, 0,2 M, pH 6,8, 4°C), 0,32 g de PVPP (PolyvinylPolypyrrolidone,), 0,24 g de NaCl et 0,028 g d’acide ascorbique (Sigma-Aldrich, Allemagne). Le broyat est filtré et lavé avec 2 ml de tampon phosphate (Na2HPO4 / NaH2PO4, 0,2 M, pH 6,8, 4°C). Le filtrat est ensuite centrifugé à 20 000 g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est alors récupéré pour être saturé à 30% puis 90% de sulfate d’ammonium. Une nuit à 4°C et une centrifugation à 20 000 g de 15 minutes à 4°C séparent les deux étapes de saturation.

sur les racines : ananas et bananier (mise au point)

Le protocole d’extraction enzymatique à partir de racines de bananier et d’ananas a été élaboré après recherche bibliographique (Wuyts et al., 2006, Neves et al., 2007, Damodaran et al., 2009). Les protocoles d’extraction détaillés précédemment ont été utiles pour la mise au point de celui-ci. Après récolte, les racines sont congelées à -20°C. Cette étape favorise l’éclatement des cellules et permet une meilleure lyophilisation. La dessiccation des échantillons par sublimation est réalisée à l’aide de l’appareil Alpha 1-4 LD Plus (Bioblock Scientific, France) pendant 24 heures, à -76°C. La pression descend à partir de 1 bar jusqu’à 0,001 mbar. Les échantillons (2.5g) sont ensuite broyés à l’aide d’un Ultra-turrax (modèle T25 Basic, IKA-WERKE, Allemagne) pour homogénéiser l’échantillon dans la solution d’extraction contenant 20 ml de tampon phosphate (Na2HPO4 / NaH2PO4, 0,2 M, pH 6,8, 4°C), 5% de PVPP (PolyvinylPolypyrrolidone) et 0.20% de Tween 20 (Merck, Allemagne). Le broyat est ensuite centrifugé à 4°C pendant 30 minutes à 20 000 g. Le surnageant est récupéré pour être filtré sous vide avec du papier Whatman grade n°1 ( 47 mm, Whatman, Angleterre). Une centrifugation de 20 000 g à 4°C pendant 20 minutes permet de clarifier le filtrat. L’extrait enzymatique est obtenu ainsi à la fois pour les racines de bananiers et d’ananas. Les tests de dosage d’activité enzymatique montrent que l’étape de purification n’est pas nécessaire pour les échantillons issus de ce type de matériel.

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Table des matières

Remerciements
Liste des abréviations
Liste des figures
I – L’ENTREPRISE
II – ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
III – OBJECTIFS
IV – MATERIELS ET METHODES
Matériel biologique
Extraction protéique
Purification par la technique de dialyse
Dosage spectrophotométrique
Electrophorèse sur Phastgel
RESULTATS
Racines de bananiers
Racines d’ananas
Fruit Cayenne Lisse
DISCUSSION / PERSPECTIVES
Racines de bananier
Racines d’ananas
Fruit Cayenne Lisse
BLIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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