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Répartition géographique
Combretum glutinosum se rencontre dans toutes les savanes sahélo-soudaniennes et au Cameroun. Il pousse dans les différents types de savane, mais se développe mieux sur le sable et les sols libres de drainage. L’espèce est résistante à la sécheresse, d’où sa présence dans les zones où la pluviométrie annuelle moyenne est de 300 à 700 mm, mais parfois aussi basse que 200 mm (en Mauritanie). C’est une espèce à croissance rapide, largement distribuée et souvent abondante et grégaire [21].
Au Sénégal, cet arbre est très répandu, dans la savane boisée, surtout dans les terres argileuses des plateaux latéritiques. Il forme les peuplements mono spécifiques des dunes fixées du Sahel (Djolof) et la base de nombreux taillis culturaux (Sine, Saloum, Casamance et Tamba) [8].
Composition chimique de la plante
Les feuilles du C. glutinosum renferment quatre hétérosides flavoniques, des sucres, du locacyanidole, du leucodelphinidole et des acides organiques (acide gallique, acide ellagique et acide férullique) [8].
En plus de ce qui a été cité précédemment, Niang (2013) démontre l’existence de tanins condensés tels que la combreglutinine, le 2,3-(S) hexahydroxydiphénoyl-D-glucose, la punicaline et la punicalgine [21].
Les racines contiennent également des hétérosides flavoniques, de leucocyanidol, de leucodelphinol, de l’acide gallique et de l’acide ellagique [28]
Les graines comprennent essentiellement des gommes [28].
Propriétés pharmacologiques et usages de la plante
Une étude clinique réalisée à Dakar par le Docteur Blatt, montre que cette espèce présente des propriétés thérapeutiques. Lors de cette étude, des décoctions aqueuses de feuilles de C. glutinosum (5feuilles / 1litre d’eau) ont présenté des actions diurétique et hypotensive très intéressante.
Selon Ouattara et al. (2006), l’extrait méthanolique des jeunes feuilles du C.glutinosum présente une forte action antipaludique contrairement à l’extrait aqueux utilisé habituellement dans la médecine traditionnelle [23]. Asres et al, (2001) montrent que les tannins présents sont les responsables de la lutte contre le Plasmodium falciparum [1].
Une action antimicrobienne est énoncée par Yahaya et al, (2012) ; en effet ses résultats révèlent un niveau beaucoup plus élevé d’inhibition du Salmonella typhi et Escherichia coli par l’extrait méthanolique [31].
Autres usages
Les feuilles sont broutées par les ruminants, et l’espèce ligneuse est préférée des girafes adultes. Le bois est dur, jaune et relativement durable. Il est utilisé dans la construction de huttes, de poteaux de clôture, de cadre de cabane, de manche d’outils et en menuiserie générale. Il est également employé comme bois de chauffe et /ou de charbon.
Les extraits d’écorce, de feuilles et surtout des racines donnent un colorant alimentaire jaune.
Les jeunes graines vertes écrasées sont utiles dans le traitement des blessures et de la syphilis ainsi que dans l’art vétérinaire en général.
Radicaux libres
Définition
Un radical libre (RL) est une molécule possédant un ou plusieurs électrons non appariés sur ses orbitales électroniques externes. La présence d’un électron célibataire confère souvent à ces molécules une grande instabilité ; elles ont la possibilité de réagir avec de nombreux composés dans des processus le plus souvent non spécifiques, et leur durée de vie en solution est très courte [13]. La réactivité varie d’un radical libre à un autre et dépend de l’environnement où ils sont présents.
Les sources de radicaux libres
Les radicaux libres sont divisés en radicaux hydroxyles (RH) et en radicaux superoxydes (RS). Les RH sont les plus puissants des espèces réactives de l’oxygène (ERO) avec une durée de vie extrêmement faible (inférieure à la microseconde), elles réagissent quasiment sur leur lieu de production. Contrairement aux RH, les RS ont une durée relativement longue (environ une dizaine de secondes) et diffusent bien au-delà de leur lieu de production [22].
Les radicaux libres centrés sur l’oxygène sont : le radical superoxyde, le radical perhydroxyle, le radical hydroxyle, et le radical alkoxyle [22].
L’oxyde d’azote (NO) est un radical peu réactif du fait qu’il ne possède, en ses orbitales, qu’un seul électron célibataire, synthétisé à partir d’un atome et d’une molécule d’oxygène [22].
Ainsi, les radicaux libres intervenants dans les phénomènes de stress oxydatif partagent pour caractéristiques, un électron célibataire sur un atome d’oxygène ou d’azote. Cela leur confère la dénomination respective d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) ou de l’azote (ERA).
Stress oxydatif
Des molécules prooxydantes, appelées RL ou ERO sont en permanence produites dans l’organisme. Ces dernières sont cependant contrôlées par les antioxydants [6].
Un stress oxydatif survient lorsque l’équilibre est rompu en faveur des radicaux libres. Toutefois, une production excessive de ces molécules réactives ou une insuffisance des mécanismes antioxydants peut déséquilibrer le rapport oxydant/antioxydant. Cela peut avoir diverses origines, telles que l’exposition aux radiations ionisantes, la pollution, le contact avec certains pesticides et solvants et tous processus susceptibles de surcharger les réactions de détoxication hépatique, comme une perte de poids importante.
Origine de la production des espèces réactives de l’oxygène
Pour fonctionner correctement, l’organisme a besoin d’énergie. Les cellules transforment les nutriments apportés par l’alimentation en énergie et en eau. Cette transformation génère environ 2% de molécules d’oxygène [6].
La production de radicaux libres est en rapport avec l’élévation de la consommation d’oxygène [11].
Radical superoxyde : O2·Une
partie de l’oxygène moléculaire est capable de capter de façon univalente et séquentielle un électron formant ainsi des espèces oxygénées réactives connues sous le nom de l’anion superoxyde [3]. O2 + ē → O2·
Radical libre hydroxyle : (OH˙)
Le radical libre hydroxyle réagit avec de nombreuses molécules comme l’ADN, les glucides, les nucléotides, les protéines. Il peut être à l’origine des lésions de nécrose. C’est un dérivé de l’ion superoxyde [3]
Oxygène singulet
L’état singulet de l’oxygène représente la forme active ; c’est une forme très énergétique de grande réactivité qui peut oxyder de nombreuses molécules. Il est obtenu à partir de l’ion super oxyde : ˙O – O˙ → 1O2.
La figure 4 montre les différentes origines des radicaux libres oxygénés et espèces réactives de l’oxygène impliqué en biologie
Espèces libres non oxygénées
Ce sont les produits des réactions de certaines molécules avec les espèces réactives dérivées de l’oxygène. Elles sont capables de réagir avec d’autres molécules et être à l’origine de la multiplication des réactions d’oxydation et de la propagation de dommages oxydatifs. On peut citer le cas des acides gras peroxydés qui résultent de l’action des espèces oxygénées sur les membranes biologiques, ou les fractions protéiques, les acides aminés et les acides nucléiques (réaction avec ERO) générant des molécules réactives et nocives.
Les défenses antioxydantes
L’organisme limite l’extension des réactions des RL par les réactions enzymatiques, par piégeage des métaux, par différentes molécules connues sous le nom d’antioxydants capables de piéger les radicaux libres.
Enzymes
En effet, le superoxyde dismutase est l’enzyme responsable de l’élimination de l’anion superoxyde, espèce toxique formée au cours de la transformation de l’oxygène en eau. Et le glutathion peroxydase est l’enzyme à sélénium qui détruit les peroxydes et les hydroperoxydes.
Molécules
La ferritine, la transferrine, la ceruleoplasmine sont des molécules réduisant la disponibilité des métaux. Elles maintiennent les métaux dans un état inactif pour la formation d’ERO.
Médicaments
Les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les -bloquants et les anti-hypertensifs sont responsables d’une activité antioxydante.
Alimentation
La vitamine C, la vitamine E et le -carotène constituent les substances antioxydantes provenant de l’alimentation.
L’acide ascorbique ou vitamine C (figure 6) est un réducteur qui joue un rôle important dans la régénération de la vitamine E.
Test de réduction du radical-cation ABTS+• ou TEAC
C’est la capacité des composés à réduire le radical-cation ABTS+• (figure 12), 2,2-azinobis-(acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique), qui présente une bande d’absorption dans le visible avec trois maxima à 645, 734 et 815 nm. Il y a formation du radical par l’oxydation de l’ABTS incolore avec différents composés, comme le dioxyde de manganèse. L’activité des composés est exprimée par la Capacité Antioxydante Equivalente Trolox (TEAC) correspondant à la concentration de Trolox (analogue hydrophile de la vitamine E). Plus la valeur TEAC est élevée, plus l’antioxydant est efficace.
Extraction [23]
60 g de poudre de feuilles et d’écorce de Combretum glutinosum sont séparément macérées avec 600 ml de méthanol pendant 5 jours. L’extrait obtenu avec la poudre d’écorce est nommé E.M. Et cette même macération est faite avec de l’éthanol et la poudre des feuilles de Combretum glutinosum. Cet extrait éthanolique est nommé E.E. Une masse de 60 g de poudre d’écorce et de feuilles de Combretum glutinosum est macérée séparément avec 600 ml d’hexane pendant 1 jour. Les mélanges sont filtrés et les mêmes poudre séchées à nouveau avant d’être macérés avec 600 ml de méthanol pendant 5 jours. L’extrait obtenu avec les feuilles est E.E2 et E.M3 celui obtenu avec les écorces.
Une prise d’essai de 5 g d’extrait E.M3 sec est complètement dissoute dans 250 ml d’eau pure puis un fractionnement liquide-liquide est effectué successivement avec un même volume d’éther diéthylique, d’acétate d’éthyle et de Chloroforme. Ces fractions obtenues sont respectivement nommées fraction aqueuse (F.A), fraction éther diéthylique (F.ED), fraction acétate d’éthyle (F.AE) et fraction chloroformique (F.ch). Ces trois solutions sont évaporées à sec à l’évaporateur rotatif avant d’être utilisées.
Dosage des polyphénols totaux
Les polyphénols produits par les végétaux en tant que métabolites secondaires constituent une large gamme de molécules chimiques, dont la nature chimique et les teneurs sont extrêmement variables d’une espèce à une autre. Il existe une multitude de méthodes analytiques pour la quantification des polyphénols totaux.
On a utilisé la méthode colorimétrique de Folin-Denis avec comme étalon externe l’acide tannique. Le dosage des polyphénols totaux a été effectué par une méthode adaptée par Singleton et Ross (en 1965) avec le réactif de Folin-Ciocalteu [29]. Ce réactif est formé d’acide phosphotungstique H3PW12O40 et d’acide phosphomolybdique H3PMo12O4, qui sont réduits lors de l’oxydation des phénols en oxydes bleus de tungstène (W8O23) et de molybdène (Mo8O3), ce qui facilite le dosage des phénols dans le visible à une longueur d’onde de l’ordre 670 nm [2].
L’échantillon à doser, a été obtenu par la dissolution de 5 mg d’extrait dans 100 mL d’eau distillée sous agitation magnétique. On introduit 3,75 mL de la solution dans 2 tubes à essai, avant d’ajouter dans chacun d’eux 0,75 mL du réactif de Folin-Denis et 0,75 mL et d’une solution saturée de carbonate de sodium (Na2CO3), obtenus au préalable par saturation dans de l’eau distillée. Les échantillons sont centrifugés à 4000 tours/min (trs/min), pendant 4 minutes. On prépare un échantillon témoin dans les mêmes conditions avec de l’eau distillée. La lecture des échantillons a été effectué par spectrophotométrie UV/VIS, calibré au moyen d’une gamme d’étalonnage de l’acide tannique. L’appareil répond aux paramètres suivants avec une mode de lecture, monochromatique, une longueur d’onde à 670nm, un volume d’échantillon de 500μL, un temps de stabilisation de 4 min, et une lecture à 25°C.
Cela nous a permis de faire une lecture directe des teneurs en polyphénols de tous les extraits et fractions de nos échantillons.
L’opération a été répétée pour l’ensemble des extraits et fractions des feuilles et écorces du Combretum glutinosum.
Evaluation du pouvoir antioxydant
Protocole expérimental du test au DPPH
La méthode utilisée a été décrite par Molyneux (2003) puis par Sarr et al. (2015) [19 ; 25].
Une quantité de 4 mg de poudre de DPPH• a été dissoute dans 100 mL d’éthanol et la solution obtenue a été conservée à l’abri de la lumière pendant 12 h.
Ensuite, dans chaque tube à essai contenant 0,8 mL de l’extrait à différentes concentrations (1 à 9 μg/mL), on ajoute 3,2 mL de la solution de DPPH•.
L’acide ascorbique et la quercétine, utilisés comme antioxydants de référence, ont également été testés à ces mêmes concentrations.
La lecture de l’absorbance a été faite au bout de 30 minutes au spectrophotomètre à 517 nm en utilisant l’éthanol comme blanc. Trois mesures de l’absorbance ont été réalisées (n=3).
Protocole expérimental du test a l’ABTS
Une quantité de 38,40 mg d’ABTS est préalablement dissoute dans 10 mL d’eau. On ajoute par la suite 6,75 mg de persulfate de potassium. Le mélange obtenu a été conservé à l’obscurité et à température ambiante pendant 12h avant usage. Ce mélange est dilué avec de l’éthanol afin d’obtenir une absorbance de l’ordre de 0,7 à 734 nm.
L’activité antioxydante a été mesurée en additionnant 2 mL d’une solution éthanolique de l’extrait testé à 2 mL de la solution d’ABTS+•. Les extraits ont été testés aux concentrations suivantes : 1 à 9 μg/mL.
L’acide ascorbique et la quercétine, utilisés comme antioxydants de référence, ont été testés aux mêmes concentrations. La lecture de l’absorbance a été faite au bout de 2 minutes au spectrophotomètre à 734 nm en utilisant l’éthanol comme blanc.
Trois mesures de l’absorbance ont été effectuées pour chaque concentration testée (n=3).
Dans les deux tests décrits ci-avant, l’activité antioxydante a été exprimée par le pourcentage d’inhibition (PI) de l’absorbance du radical qui correspond à :
A0 : absorbance de la solution d’ABTS+• ou de DPPH• pure
A1 : absorbance de la solution d’ABTS+• ou de DPPH• après ajout de l’extrait testé à une concentration donnée et après un temps donné.
Les résultats obtenus avec le DPPH et l’ABTS de l’activité antioxydantes sont considérés significatifs si p<0,05 versus témoin négatif.
Pouvoir antioxydant
Test au DPPH
Du fait qu’il n’existe pas de mesure absolue de la capacité antioxydante d’un composé, les résultats sont souvent confrontés à un antioxydant de référence, dans notre cas l’acide ascorbique et la quercétine. Le PI du radical libre DPPH• montre la capacité de l’extrait, à une concentration fixée, de réduire ou non les radicaux. Le radical libre DPPH• synthétique de couleur violette vire vers le jaune quand il est capté par les flavonoïdes contenus dans les extraits testés.
De façon fréquente, l’augmentation de la concentration de l’antioxydant amène l’augmentation de ces indices relatifs. Les résultats obtenus montrent une augmentation du pouvoir antioxydant (PI) proportionnelle aux concentrations de l’échantillon.
Feuilles :
Le tableau III présente la capacité d’inhibition du radical libre DPPH• par l’extrait éthanolique, les fractions (chloroformique, acétate d’éthyle et aqueuse) des feuilles ainsi que celle des antioxydants de référence (acide ascorbique et quercétine).
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Table des matières
I Présentation de la plante (COMBRETUM GLUTINOSUM)
I.1 Classification et description botanique
I.1.1 Synonymes et noms vernaculaires
I.1.2 Systématique de la plante [21]
I.1.3 Description botanique
I.1.4 Répartition géographique
I.1.5 Composition chimique de la plante
I.1.6 Propriétés pharmacologiques et usages de la plante
I.1.7 Autres usages
II Radicaux libres
II.1 Définition
II.2 Les sources de radicaux libres
II.3 Stress oxydatif
II.4 Origine de la production des espèces réactives de l’oxygène
II.4.1 Radical superoxyde : O2·
II.4.2 Radical libre hydroxyle : (OH˙)
II.4.3 Oxygène singulet
II.5 Espèces libres non oxygénées
II.6 Dommages oxydatifs des radicaux libres
III ANTIOXYDANTS
III.1 Définition
III.2 Les défenses antioxydantes
III.3 Mesure de l’activité antioxydante
III.3.1 Le -carotène comme indicateur d’oxydation
III.3.2 Le test de Rancimat
III.3.3 Dosage des « thiobarbituric acid reactive substances » (TBARS)
III.3.4 Test de réduction du radical-cation ABTS+• ou TEAC
III.3.5 Piégeage du radical libre DPPH (1,1diphenyl-2-picryl-hydrazyl)
I Objectifs
I.1 Objectif général
I.2 Objectifs spécifiques
II Cadre de l’étude
III MATERIEL ET METHODES
III.1 MATERIEL
III.1.1 Appareillage et verrerie
III.1.2 Réactifs
III.1.3 Matériel végétal
III.2 Méthodes
III.2.1 Extraction [23]
III.2.2 Dosage des polyphénols totaux
III.2.3 Evaluation du pouvoir antioxydant
III.2.3.1 Protocole expérimental du test au DPPH
III.2.3.2 Protocole expérimental du test a l’ABTS
IV Résultats et discussions
IV.1 Rendement de l’extraction
IV.1 Quantification des polyphénols totaux
IV.2 Pouvoir antioxydant
IV.2.1 Test au DPPH
IV.2.1.1 Feuilles
IV.2.1.2 Ecorces
IV.2.2 Tests à l’ABTS
IV.2.2.1 Feuilles
IV.2.2.2 Écorce
V Discussion
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