Propriétés anticancéreuses des complexes de ruthénium à ligand nitrosyle sous irradiation

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Sources endogènes de NO•

Chez les mammifères, NO• est biosynthétisé par l’oxydation de l’acide aminé L-arginine en L-citrulline grâce à des enzymes nommées NO-synthases ou NOS. La réaction se fait en présence de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) et de dioxygène. La tétrahydrobioptérine (notée BH4), la flavine mononucléotide (FMN), la flavine adénine dinucléotide (FAD) et un groupe hème sont les cofacteurs nécessaires aux protéines NOS pour la biosynthèse de NO•.
Les NOS sont des protéines homodimériques contenant un fragment hème (avec un atome de fer) et sont constituées de deux domaines catalytiques : un domaine catalytique
« hème oxygénase » NOSox qui se lie au substrat L-arginine et le cofacteur BH4 et un domaine « réductase » NOSred qui se lie aux cofacteurs FMN, FAD et NADPH. Les NOS sont généralement associées à une protéine calmoduline, sensible au taux de calcium dans le milieu. La Figure I-4 schématise la structure des NOS.33
Il existe trois isoformes de NOS, dont les structures et les fonctions diffèrent : la NOS neuronale (nNOS), la NOS endothéliale (eNOS) et la NOS inductible (iNOS). Les NOS neuronale et endothéliale sont exprimées de façon permanente par les cellules, principalement les neurones et les cellules endothéliales respectivement. Ces types de NOS sont régulées par l’influx de calcium dans la cellule. L’activation de l’iNOS n’est pas dépendante de la concentration en calcium mais sa synthèse est régulée par des facteurs transcriptionnels à partir de l’ADN.34,13
Grâce au séquençage génomique, la présence de NOS homologues a pu être mise en évidence chez certains organismes procaryotes et principalement chez les bactéries à Gram +, comme les streptocoques, les bacilles et les staphylocoques. Les NOS bactériennes, notées bNOS, sont très semblables aux mNOS (NOS mammifères) mais elles ne possèdent pas de domaine catalytique « réductase ». Elles sont pourtant capables de catalyser la réaction d’oxydation de l’arginine en utilisant des réductases non spécifiques présentes dans le milieu cellulaire et d’ainsi permettre la synthèse de NO•. 35,36,37

Aspects biologiques

La petite taille de la molécule NO• ainsi que son caractère lipophile lui permettent de traverser les membranes cellulaires. Grâce à ses propriétés, il intervient dans différents processus biologiques pour lesquels il joue le rôle de messager (« signalling molecule »). NO• peut traverser les différents tissus, jusqu’à plusieurs centaines de micromètres, avec une vitesse d’environ 5 à 10 cellules par seconde (environ 50 µm.s-1), mais il est rapidement consommé dans les vaisseaux sanguins à cause de sa forte affinité avec le fer de l’hémoglobine. Ils forment alors le complexe FeII-NO-Hb, dont la constante de dissociation est très faible (entre 10-10 et 10-11 M). 38,39,40
En conditions physiologiques, NO• est impliqué dans des réactions avec d’autres radicaux et particulièrement avec le radical superoxyde pour la formation de péroxynitrites ONOO-. Il peut également réagir avec des métaux de transition comme le fer pour former des complexes, qui sont souvent présents au niveau des sites actifs des enzymes. Ainsi, ce radical est impliqué dans la régulation de l’activité de plusieurs enzymes ainsi que dans la production d’ions péroxynitrites. Dans le corps humain, NO• est donc responsable de différents processus.
La première action de NO•, est la vasodilatation. Il est produit par la eNOS dans les cellules endothéliales puis diffuse à travers les cellules musculaires lisses. Sa fixation sur l’enzyme guanylate cyclase entraîne, par l’intermédiaire de plusieurs réactions biochimiques, la relaxation des cellules musculaires lisses. La concentration endogène de NO• dans ce type de régulation est de 10 à 30 nM.41,39
Les propriétés de signalisation de NO• se retrouvent également dans la neurotransmission. Généré par la NOS neuronale à des concentrations de 0,2 à 10 nM, il réagit à nouveau sur la guanylate cyclase et peut avoir une action sur les systèmes digestif, respiratoire et urogénital et participer au développement de la mémoire, de la reproduction et des fonctions motrices.42,43
Enfin, NO• peut intervenir en tant qu’agent antimicrobien. Les phagocytes, cellules du système immunitaire, absorbent les corps étrangers nocifs et NO• est libéré pour induire leur mort. L’intervention de l’ion superoxyde et la formation de ONOO-, entraînent de nombreuses modifications sur l’ADN et les protéines, qui peuvent induire la mort des bactéries. Dans ce cas, les concentrations de NO• exprimées sont bien plus importantes et peuvent atteindre 1000 nM.44,45,46
La production moyenne de NO• biosynthétisé dans le corps humain est d’environ 0,63±0,45 µmol.kg-1.h-1. Lors d’une infection ou d’une inflammation, ce taux peut augmenter de plusieurs ordres de grandeur.47

Dualité des rôles de NO•

Effets directs et indirects

D’un point de vue général, les effets biologiques de NO• peuvent être séparés en deux groupes qui sont les effets directs et les effets indirects. La première catégorie regroupe les réactions rapides et directes de NO• sur une cible biologique. Dans la seconde, NO• réagit d’abord avec l’oxygène ou l’ion superoxyde pour générer des RNS (espèces réactives de l’azote) qui, elles, interagissent avec une cible biologique. En général, les effets directs ont lieu à faible concentration de NO• alors que les effets indirects sont observables à plus hautes concentrations.39
NO• peut provoquer des dommages à l’ADN par les stress nitrosant et oxydant. Les péroxynitrites ONOO- peuvent oxyder l’ADN et également provoquer des cassures simplebrins. N2O3 transforme les amines en N-nitrosamines et est également capable d’alkyler l’ADN. En milieu aqueux, NO2 peut également se transformer en nitrites et nitrates.
Avec son électron non apparié, NO• est capable de réagir sur des radicaux présents dans le milieu cellulaire, comme des radicaux d’acides aminés, mais également de former des complexes métalliques, notamment avec le fer (II). Cela permet d’expliquer pourquoi NO• est rapidement détruit dans les vaisseaux sanguins.

La concentration en monoxyde d’azote

D’après les paragraphes précédents, NO• joue différents rôles dans différents processus biologiques chez l’homme comme chez les organismes procaryotes. Mais il est aussi impliqué dans différentes pathologies. Ainsi, il peut avoir un effet bénéfique ou délétère dans de nombreux troubles de la santé.
De nombreuses études ont été menées pour comprendre la relation entre NO• et les cancers. Certaines études démontrent qu’il favorise le développement des cellules cancéreuses alors que d’autres suggèrent un effet anti-prolifératif.13
A des concentrations de l’ordre du micromolaire, le monoxyde d’azote permet la régression des tumeurs et la mort cellulaire. En effet, par la formation de ROS et de RNS, comme le trioxyde d’azote ou les péroxynitrites capables de générer des cassures et des mutations, il induit l’apoptose des cellules cancéreuses.34
Pour des concentrations plus faibles, à l’échelle picomolaire, un effet anti-apoptotique et pro-angiogénique des tumeurs cancéreuses est observé. Les apports sanguin et nutritif sont augmentés et le développement tumoral est favorisé.
De plus, bien que le role de NO• soit moins bien décrit chez les bactéries dans la littérature, NO• a montré des propriétés antimicrobiennes alors que plusieurs études suggèrent que ce radical permet aux bactéries de se défendre contre les attaques d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). En 2016, Knikel et al. ont montré que les NOS chez les staphylocoques (S. aureus) permettent la synthèse de NO•, transformé ensuite en nitrates, utilisés dans le mécanisme de respiration via la nitrate réductase.48
Gusarov et al. ont mis en évidence que la production endogène de NO• participait à la protection de la bactérie contre différents antibiotiques, soit en dégradant l’agent cytotoxique, soit en réduisant le stress oxydant provoqué au sein de la bactérie.49,50
Ensuite, NO• peut avoir des conséquences positives sur la cicatrisation et l’inflammation d’une plaie mais il est aussi impliqué dans les mécanismes de l’inflammation de certaines maladies.51
Ainsi, NO• peut jouer des rôles très différents dans certaines maladies et cette dichotomie dépend de la concentration du radical. Selon les pathologies, une forte concentration en NO• n’entraînera pas forcément l’éradication de la maladie et, inversement, une plus faible concentration n’aura pas obligatoirement un effet malin.
Ainsi, le monoxyde d’azote peut présenter de nombreuses applications biomédicales, résumées sur la Figure I-6, mais pour cela, sa concentration doit être mesurée et contrôlée.

Techniques de détection du NO•

La partie précédente a mis en évidence l’importance considérable de NO• ainsi que de sa concentration dans différents mécanismes biologiques. De nombreux groupes de recherche se sont attachés à développer des méthodes analytiques variées pour permettre la détection de NO• et une mesure précise de sa concentration.52,53
Dans cette partie, l’intégralité des techniques analytiques ne sera pas présentée mais seulement certaines des plus couramment employées. A cause de sa courte durée de vie, certaines techniques utilisent la détection de sous-produits plus stables, issus de réactions avec NO• : ce sont des méthodes indirectes. Au contraire, les techniques permettant la détection du radical non transformé sont des méthodes directes.

Méthodes indirectes

ILa fluorescence

Cette technique nécessite des molécules initialement peu ou non fluorescentes, qui le deviennent après réaction avec NO• ou avec un sous-produit de dégradation. L’intensité de fluorescence mesurée en spectroscopie est proportionnelle à la quantité de NO• présente dans le milieu.52
Les diaminonaphtalènes (DAN) ou les diaminofluorescéines (DAF) sont des sondes fluorescentes utilisées pour la détection de NO•.
Les sondes de la famille des DAF réagissent sur un produit issu de la transformation de NO• en milieu aqueux qui est le trioxyde d’azote N2O3, comme le montre la Figure I-8.

La chimiluminescence

Le principe de cette technique est similaire à celui de la fluorescence. La réaction chimique entre une molécule donnée et l’analyte entraîne une émission de lumière, qui est mesurée. Dans le cas de la détection du monoxyde d’azote, l’une des réactions utilisées en chimiluminescence implique l’ozone et la production de dioxyde d’azote dans son état excité. Son retour à l’état fondamental s’accompagne de l’émission d’un photon, qui est détecté :
(1) NO• + O3 → NO2•* + O2
(2) NO2•* → NO2• + hν

Le test de Griess

Cette méthode est largement répandue pour la détection indirecte de NO• et la mesure de sa concentration par spectrophotométrie d’absorbance. En effet, elle est assez facile à mettre en œuvre et peut être utilisée en milieu biologique.54
Cette méthode, proposée par Griess en 1879 56, est spécifique des ions nitrites NO2-. Le monoxyde d’azote s’oxydant en nitrites en solution aqueuse, cette technique permet de mesurer indirectement la concentration en NO•.55,56
L’oxydation de NO• en NO2- se fait suivant les réactions suivantes :
2NO• + O2 → 2NO2•
NO2• + NO• → N2O3
N2O3 + H2O → 2 NO2- + 2 H+
La méthode actuelle est dérivée de celle proposée initialement par Griess. Les ions NO2- issus de l’oxydation de NO• réagissent avec le sulfanilamide en milieu acide pour donner un intermédiaire diazonium, qui va ensuite former un colorant « azo » stable après réaction avec la N-(1-naphtyl)éthylènediamine, comme le montre la Figure I-9.
Ce colorant présente un maximum d’absorption vers 540 nm. Sa formation, preuve indirecte de la présence de NO• dans le milieu, peut donc être suivie par spectroscopie d’absorbance et la concentration en nitrites peut être déterminée. La limite de détection de ce test est de 2,5 µmol/L. Mais cette technique présente des inconvénients puisque la concentration en nitrites mesurée peut être sur- ou sous-estimée. En effet, la présence en solution de nitrites qui ne proviennent pas de l’oxydation de NO• peut fausser la valeur de concentration mesurée. De plus, les nitrates n’étant pas détectés par ce test, la concentration en NO3- issus de l’oxydation de NO• ou des NO2- n’est pas mesurée.
Il existe d’autres méthodes de spectrophotométrie d’absorbance utilisables pour la détection de NO•.
Par exemple, la réaction du monoxyde d’azote avec la déoxyhémoglobine est observable car la complexation de NO• avec le FeII de l’hémoglobine entraîne un décalage du maximum d’absorbance. Il passe de 433 nm pour la protéine seule à 406 nm.23 hémoglobine-FeII + NO• → hémoglobine-FeII-NO•
C’est notamment en utilisant cette technique qu’Ignarro a pu montrer que l’EDRF était en réalité NO•.23
La réaction du monoxyde d’azote sur l’oxyhémoglobine permet également une détection par spectrophotométrie d’absorbance. Le fer (II) de l’hémoglobine est oxydé et des nitrates sont formés.
hémoglobine-FeII-O2 + NO• → hémoglobine-FeIII + NO3-Dans ce cas, le changement d’absorption est dû à l’oxydation du fer.57

Méthodes directes

La résonance paramagnétique électronique

La résonance paramagnétique électronique (RPE) est une méthode permettant la détection d’espèces présentant un ou plusieurs électrons non appariés.58
Le principe de la RPE est similaire à celui de la RMN (résonance magnétique nucléaire) excepté le fait que ce sont les spins électroniques qui sont excités et non les spins nucléaires (cf Chapitre II p.102).
NO• étant un radical, il peut être en principe détecté de façon directe par cette méthode spectroscopique. En réalité, sa détection n’est pas aisée car la limite de détection est comprise en 10 et 100 nM et car il présente une durée de vie trop courte. Pour résoudre ces problèmes, des piégeurs de spin (ou « spin traps ») sont utilisés. Leur rôle est de réagir avec NO• pour former des radicaux plus stables.59
Les dithiocarbamates de fer sont communément utilisés comme piégeur de NO•, le fer(II) bas spin étant silencieux en RPE. Ils sont très utilisés car ils présentent des constantes de réactions avec NO• très importantes, de 1,1.108 M−1.s−1 pour le Fe-proline-dithiocarbamate et 4,4.108 M−1.s−1 pour le Fe-N-dithiocarboxy-sarcosine par exemple. Le complexe Fe-N- méthyl-d-glucamine dithiocarbamate [FeII(MGD)2], dont la structure est présentée sur la Figure I-10, est très souvent utilisé pour la détection de NO•.

La thérapie photodynamique (PDT)

La thérapie photodynamique est une technique de photothérapie dans laquelle une molécule, appelée photosensibilisateur, est excitée par irradiation lumineuse.68 Le photosensibilisateur ne présente aucune toxicité sans irradiation, mais son excitation en présence de dioxygène provoque la destruction sélective de cellules dans la zone d’irradiation.
Sous irradiation, le photosensibilisateur passe de son état fondamental S0 à un état excité singulet S1 de courte durée de vie. Par croisement intersystème, cet état S1 se désexcite vers un état triplet T1. Deux mécanismes sont ensuite possibles.
Le mécanisme de type I implique un transfert d’électron(s) ou d’atome(s) d’hydrogène entre le photosensibilisateur et un substrat (molécule biologique, solvant ou autre sensibilisateur). Cela induit la formation de radicaux, qui vont ensuite réagir avec le dioxygène pour former des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ces ROS provoquent un important stress oxydant chez les cellules traitées.
Le mécanisme de type II implique un transfert d’énergie entre le photosensibilisateur dans son état triplet excité T1 et le dioxygène (dans son état fondamental triplet). Ainsi, de l’oxygène singulet 1O2 est généré et il peut induire également un stress oxydant comme réponse biologique.69
Ces mécanismes sont schématisés sur le diagramme de Jablonski70 de la Figure I-17.
Ces stress oxydants peuvent être induits chez les cellules eucaryotes et procaryotes. Ils provoquent des dommages à l’ADN et aux protéines. La membrane cytoplasmique peut également être endommagée entraînant une fuite du contenu cellulaire ou une inactivation du transport transmembranaire par les enzymes. La PDT peut donc trouver des applications en thérapie anticancéreuse ainsi que dans des traitements antibactériens.
La PDT est déjà utilisée comme traitement dans les hôpitaux. De nombreux photosensibilisateurs ont été mis sur le marché et un encore plus grand nombre est encore en phase clinique. Par exemple, le Photofrin®, dont la structure est représentée sur la Figure I-18, est utilisé pour traiter différents cancers (œsophage, poumon, vessie). L’ensemble de ces molécules est intéressant car elles ne sont pas toxiques pour les cellules humaines et animales et sont capables de s’accumuler dans les tumeurs.
Figure I-18 : Structure de photosensibiliseurs en PDT utilisés en thérapie ou en phase clinique de développement (d’après Hamblin et al., Photochem. Photobiol. Sci., 2004, 3, 436-450)
Les applications sont en effet variées puisque l’irradiation de diverses zones du corps humain est possible pour des thérapies anti-cancéreuses : la peau (Figure I-21, image a)), les yeux, la poitrine (Figure I-19, image b)), les poumons, mais également le pancréas, la prostate ou la langue.71
La PDT est également utilisée pour éradiquer des micro-organismes. Des molécules comme le bleu de méthylène ou le rose bengal72,73 ont montré des propriétés antimicrobiennes sous irradiation. La macromolécule poly-L-lysine chlorine (e6)74, constituée de plusieurs acides aminés lysine, a été utilisée pour améliorer la cicatrisation d’une plaie infection par P. aeruginosa chez la souris.
La chimie de coordination est également une source de photosensibilisateurs.
En 2014, le groupe de recherche de G. Gasser présente deux complexes de ruthénium utilisés comme photosensibilisateurs.75 Ces derniers, composés de ligands polypyridyl (Figure I-20), permettent la production d’oxygène singulet sous irradiation à 420 nm.
Ces complexes, non toxiques dans l’obscurité, présentent des propriétés phototoxiques importantes sur les cellules cancéreuses HeLa avec un IC50 de 620 nM pour (1) et de 15 µM pour (2). Ces photosensibilisateurs permettent aussi une inactivation quasiment totale de bactéries comme S. aureus et E. coli sous irradiation à 380-480 nm.
Bertiaume et al. ont appliqué la PDT antimicrobienne in vivo en étudiant l’effet d’un complexe porphyrinique d’étain sous irradiation sur une plaie infectée par Pseudomonas aeruginosa chez la souris.76
La PDT appliqué au traitement antimicrobien peut être mentionnée PDI (Inactivation Photodynamique), aPDT (« Antimicrobial Photodynamic Therapy ») ou PACT pour « Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy ». Ce dernier acronyme ne doit pas être confondu avec la chimio-thérapie photoactivée présentée dans le paragraphe suivant.
Mais la PDT n’est pas toujours un traitement adapté car il requiert l’intervention d’oxygène. D’après la littérature, les tumeurs cancéreuses sont souvent hypoxiques, cela signifie que la zone tumorale est privée d’oxygène. De même, certaines bactéries ou micro-organismes se développent dans des conditions anaérobies. Dans de tels cas, la PDT n’est pas une solution et la chimiothérapie photoactivée peut être une bonne alternative.

La chimiothérapie photoactivée (PACT)

La chimiothérapie photoactivée (PACT) est une technique thérapeutique dans laquelle une prodrogue inactive est excitée par irradiation lumineuse. La prodrogue ne présente aucune toxicité dans l’obscurité, mais l’irradiation de la molécule à une longueur d’onde spécifique provoque la destruction sélective des cellules dans la zone d’irradiation.
Sous irradiation, la molécule passe de son état fondamental à un état excité, de courte durée de vie. Le retour à l’état fondamental a lieu avec une modification de la structure de la prodrogue. Après la découverte du cis-diamminedichloroplatine cis-[PtII(NH3)2Cl2] et de son effet anticancéreux, la chimie de coordination pour la médecine s’est considérablement développée. En effet, de nombreux complexes à base de métaux de transition (Fe, Ru, Cr) ont été synthétisés et étudiés pour leurs propriétés biomédicales.77,78
Ainsi, dans les années 1990, Morrison propose un complexe de rhodium photoactivable : [RhIII(bpy)2Cl2]Cl.79 Depuis, les chimistes de coordination ne cessent de synthétiser de nouveaux complexes inorganiques car ils présentent des propriétés photochimiques intéressantes et sont de potentiels candidats pour des applications en PACT.71
Il existe différents types de composés avec différents mécanismes. Le premier type regroupe les composés constitués de platine PtIV ou de cobalt CoIII qui peuvent être photoréduits dans le milieu biologique pour former des espèces à base de PtIII ou de CoII qui sont toxiques. Ensuite, le second groupe est celui des complexes à métaux de transition qui présentent souvent des propriétés photophysiques intéressantes, avec dissociation de ligand. Parmi eux, le ruthénium est utilisé depuis des décennies pour former des complexes présentant une activité anticancéreuse.80,81,82,83,84,85,86 La dernière classe est celle des composés dont une liaison C-C peut être rompue sous irradiation.
La synthèse de complexes de coordination capables de libérer le monoxyde d’azote sous irradiation est donc une voie prometteuse en PACT. Le contrôle de l’intensité et du temps de l’irradiation ainsi que de la zone permet ainsi de délivrer une concentration idéale en NO• de façon ciblée.

Complexes de métaux de transition à ligand nitrosyle

La liaison métal-nitrosyle

Dans un complexe métallique, le ligand nitrosyle se lie généralement par l’atome d’azote pour former la liaison M-N-O. D’autres configurations peuvent être obtenues par irradiation de complexes photochromes. Ces configurations correspondent à des états métastables dans lesquels le ligand nitrosyle s’est isomérisé en isonitrosyle (liaison M-O-N) ou a fait une rotation de 90° pour atteindre une géométrie coudée. 87,88,89,90
Selon le diagramme d’orbitales moléculaires, deux composantes interviennent dans la liaison M-N-O. La première est la donation de la densité électronique du ligand nitrosyle au métal par le doublet non liant porté par l’atome d’azote : M←NO. La seconde composante est due au caractère π-accepteur du ligand nitrosyle : la densité électronique des orbitales dπ du métal est délocalisée vers l’orbitale anti-liante π* du ligand. Il s’agit du phénomène de rétro-donation : M→NO.26 Ces composantes de la liaison M-N-O sont représentées sur la Figure I-
Ceci est la description générale de la liaison. En effet, elle peut être perturbée par la nature du métal et des ligands secondaires puis par l’état d’oxydation du ligand nitrosyle.
Le ligand nitrosyle peut se présenter sous trois états d’oxydation différents : NO+, NO• et NO-. L’angle M-N-O est proche de 180° et la conformation est linéaire dans les complexes contenant le fragment NO+. Au contraire, dans le cas de NO-, la conformation est coudée avec un angle M-N-O d’environ 120°. Les deux conformations sont représentées sur la Figure I-23.
En spectroscopie infrarouge, une évolution de la fréquence d’élongation de la liaison N-O est observable entre le monoxyde d’azote libre et le coordiné. Le NO• libre présente une fréquence d’élongation à 1875 cm-1. Dans les complexes à fragment M-N-O linéaire, la fréquence νNO varie entre 1950 et 1450 cm-1 et entre 1720 et 1400 cm-1 pour des complexes contenant le fragment coudé. Ces domaines de fréquences étant larges, la mesure de la fréquence d’élongation de la liaison ne permet pas de déterminer la géométrie du fragment M-N-O avec certitude.26
Afin de simplifier la description de ces systèmes et d’éviter d’avoir à déterminer le degré d’oxydation du métal et du ligand nitrosyle, la notation d’Enemark et Feltham est utilisée. Il s’agit de décrire les trois structures électroniques du complexe à ligand nitrosyle sous la forme {M-NO}n, où n représente le nombre d’électrons présents dans les orbitales d du métal et dans l’orbitale π* du ligand nitrosyle.91
Ainsi, les complexes de ruthénium à ligand nitrosyle notés {Ru-NO}6 peuvent avoir deux structures différentes : [RuII-NO+] ou [RuIII-NO•]. Dans le premier cas, le métal compte six électrons dans sa couche d et le ligand nitrosyle n’en compte pas ; dans la seconde structure, le ruthénium possède cinq électrons et le ligand un dans son orbitale π.

Libération de NO• par les complexes [M-NO]

Les complexes de métaux de transition sont connus dans la littérature pour présenter des propriétés photochimiques.92 Certains ont donc été étudiés pour leur capacité à libérer NO• sous irradiation et particulièrement les complexes à base de Fe, Mn, Cr et Ru.93,94,95 En effet, la plupart de ces complexes sont stables thermiquement et réagissent seulement sous irradiation.
Le radical NO• peut être libéré à partir de complexes à ligand nitrosyle ou à ligand nitro comme le cis-[RuII(NO2)L(bpy)2]+ où bpy représente le ligand 2,2’-bipyridine et L les ligands pyridine, 4-picoline ou pyrazine.96
La photolibération de NO• peut également se faire à partir de complexes métalliques possédant un ligand nitrite. La liaison O-N est rompue suite à l’irradiation et le NO• est libéré (cf Figure I-24). Mais souvent, la libération de nitrites en solution est également observée, ce qui diminue l’efficacité de cette technique.
Dans la suite de ces travaux, seuls les complexes à ligand nitrosyle seront considérés.
L’efficacité de photolibération de NO• est donnée par le rendement quantique de NO• ΦNO, qui représente le rapport entre le nombre de molécules de NO• libérées sur le nombre de photons absorbés par le complexe par unité de temps et de volume (cf Annexe 5 p.320). Il dépend de la longueur d’onde d’irradiation et de la nature des ligands secondaires.

Exemple de complexes [Fe-NO]

Les complexes de fer à ligand nitrosyle sont très nombreux dans la littérature. En effet, le fer étant l’un des principaux métaux naturellement présents dans l’organisme, ces complexes sont potentiellement biocompatibles. Ainsi, le nitroprussiate de sodium est un médicament couramment administré pour abaisser rapidement la pression sanguine lors de crises d’hypertension. Ce complexe, dont la structure est représentée sur la Figure I-25, est assez stable en milieu physiologique et libère NO• par action de l’irradiation.
La photolibération de NO• est accompagnée de la libération d’ions cyanures toxiques.
Les traitements par le SNP sont donc combinés à l’administration de thiosulfate de sodium Na2S2O3 pour former des thiocyanates éliminés naturellement par l’organisme.66
Les sels de Roussin sont des complexes multi-métalliques de fer comportant plusieurs ligands nitrosyle. Les structures du RRS (Roussin’s Red Salt) et du RBS (Roussin’s Black Salt) sont représentées sur la Figure I-26.

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Table des matières

Introduction générale
Chapitre I : Etat de l’art
I. 1. Le monoxyde d’azote NO•
I. 1. 1- Découverte
I. 1. 2- Aspects physico-chimiques
I. 1. 3- Réactivité
I. 1. 4- Sources endogènes de NO•
I. 1. 5- Aspects biologiques
I. 1. 6- Dualité des rôles de NO•
I. 2. Techniques de détection du NO•
I. 2. 1- Méthodes indirectes
I. 2. 2- Méthodes directes
I. 3. Sources exogènes de NO•
I. 3. 1- Molécules organiques
I. 3. 2- La thérapie photodynamique (PDT)
I. 3. 3- La chimiothérapie photoactivée (PACT)
I. 4. Complexes de métaux de transition à ligand nitrosyle
I. 4. 1- La liaison métal-nitrosyle
I. 4. 2- Libération de NO• par les complexes [M-NO]
I. 5. Complexes de ruthénium à ligand nitrosyle
I. 5. 1- Complexes [Ru-NO] à ligand 2,2’-bipyridine
I. 5. 2- Complexes [Ru-NO] à ligand tridente
I. 5. 3- Complexes [Ru-NO] à ligand tétradente
I. 5. 4- Complexes [Ru-NO] à ligand pentadente
I. 6. Optimisation de la photolibération de NO• pour la PACT
I. 6. 1- Interactions lumière-tissus
I. 6. 2- Optimisation de la libération de NO• par irradiation dans le visible
I. 6. 3- Optimisation de la libération de NO• par excitation à deux photons
I. 7. Voies de synthèse de complexes de ruthénium à ligand nitrosyle
I. 7. 1- Voie de synthèse A
I. 7. 2- Voie de synthèse B
I. 7. 3- Voie de synthèse C
I. 7. 4- Voie de synthèse D
I. 7. 5- Conclusion
I. 8. Application en biologie pour des thérapies anticancéreuses
I. 8. 1- Présentation de la maladie
I. 8. 2- Les traitements du cancer
I. 8. 3- Le rôle du monoxyde d’azote NO•
I. 8. 4- Les stratégies de contrôle de la libération de NO•
I. 8. 5- Conclusion
I. 9. Application en microbiologie pour la lutte contre la résistance antimicrobienne
I. 9. 1- La résistance antimicrobienne
I. 9. 2- Généralités sur les bactéries et les antibiotiques
I. 9. 3- Les biofilms bactériens
I. 9. 4- Les stratégies de lutte contre le développement des biofilms
I. 9. 5- Conclusion
I. 10. Conclusion
Chapitre II : Photolibération de NO• par les complexes cis (Cl,Cl)- et trans (Cl,Cl)- [RuFTCl2NO]PF6 et [RuFT(bpy)NO](PF6)3 dans l’acétonitrile
II. 1. Introduction
II. 2. Synthèses des complexes [RuFTCl2NO]PF6 et [RuFT(bpy)NO](PF6)3
II. 2. 1- Synthèse des complexes cis (Cl,Cl)- et trans (Cl,Cl)-[RuFTCl2NO]PF6
II. 2. 2- Synthèse du complexe [RuFT(bpy)NO](PF6)3
II. 3. Etude des propriétés des complexes cis (Cl,Cl)- et trans (Cl,Cl)-[RuFTCl2NO]PF6 et [RuFT(bpy)NO](PF6)3 sous irradiation monophotonique dans l’acétonitrile
II. 3. 1- Mise en évidence de la libération de NO• sous irradiation
II. 3. 2- Caractérisation des photoproduits de cis (Cl,Cl)- et trans (Cl,Cl)-[RuFTCl2NO]PF6
II. 3. 3- Rendements quantiques de NO• des cis (Cl,Cl)- et trans (Cl,Cl)-[RuFTCl2NO]PF6 et [RuFT(bpy)NO]PF6 dans l’acétonitrile
II. 4. Photolibération de NO• par les complexes cis (Cl,Cl)- et trans (Cl,Cl)-[RuFTCl2NO]PF6 sous irradiation biphotonique
II. 4. 1- Absorption à deux photons
II. 4. 2- Mise en évidence de la libération de NO• par RPE sous irradiation à deux photons
II. 5. Conclusion
Chapitre III : Étude des propriétés de cis (Cl,Cl)- et trans (Cl,Cl)-[RuFTCl2NO]PF6 dans l’eau
III. 1. Introduction
III. 2. Caractérisation de la transformation des complexes cis (Cl,Cl)- et trans (Cl,Cl)- [RuFTCl2NO]+ en présence d’eau
III. 2. 1- Etude préliminaire du spectre d’absorption de trans (Cl,Cl)-[RuFTCl2NO]PF6 en présence d’eau par spectroscopie UV-Vis
III. 2. 2- Spectrométrie de masse sur trans (Cl,Cl)- et cis (Cl,Cl)-[RuFTCl2NO]+ en présence d’eau
III. 2. 3- Analyse par diffraction des rayons X
III. 2. 4- Influence de la transformation des complexes sur la fréquence d’élongation de la liaison N-O
III. 2. 5- Calculs théoriques
III. 2. 6- Suivi des spectres d’absorption des cis (Cl,Cl)- et trans (Cl,Cl)-[RuFTCl2NO]PF6 en présence d’eau par spectroscopie UV-Vis
III. 2. 7- Analyse par résonance magnétique nucléaire des produits transformés dans l’eau
III. 2. 8- Proposition d’interprétation des mécanismes mis en jeu
III. 3. Propriétés photochimiques du complexe trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6 dans l’eau
III. 3. 1- Mise en évidence de la photolibération de NO• dans l’eau
III. 3. 2- Quantification de la libération de NO• dans l’eau
III. 3. 3- Mesure du rendement quantique de NO• dans l’eau
III. 4. Propriétés photochimiques du complexe trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6 dans le milieu de culture bactérien LB
III. 4. 1- Evolution du spectre d’absorption des isomères de [RuFTCl2NO]PF6 dans le LB
III. 4. 2- Mesure du rendement quantique de NO• du trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6 dans le LB
III. 5. Conclusion
Chapitre IV : Synthèse de nouveaux complexes de ruthénium à ligand nitrosyle et étude de la photolibération de NO•
IV. 1. Introduction
IV. 2. Synthèse des complexes [RuTCC2FCl2NO]PF6, [RuTCC3FCl2NO]PF6 et [RuFFTCl2NO]PF6
IV. 2. 1- Synthèse des trois ligands dérivés de la 4’-(2-fluorényl)-2,2’:6’,2’’-terpyridine
IV. 2. 2- Complexation et bullage de NO•
IV. 2. 3- Séparation des isomères et caractérisation par RMN
IV. 3. Photolibération de NO• par les complexes [RuTCC2FCl2NO]PF6, [RuTCC3FCl2NO]PF6 et [RuFMeFMeCl2NO]PF6 dans l’acétonitrile
IV. 3. 1- Mise en évidence de la photolibération de NO•
IV. 3. 2- Mesures des rendements quantiques de NO•
IV. 3. 3- Mesures des sections efficaces d’absorption à deux photoion
IV. 4. Photolibération de NO• par les nouveaux complexes dans l’eau
IV. 4. 1- Mise en évidence d’une transformation dans l’eau
IV. 4. 2- Mesure des rendements quantiques de NO• des complexes dans l’eau
IV. 5. Conclusion
Chapitre V : Propriétés anticancéreuses des complexes de ruthénium à ligand nitrosyle sous irradiation
V. 1. Introduction
V. 2. Les différents tests de viabilité cellulaire
V. 2. 1- Test MTT
V. 2. 2- Test Presto-Blue
V. 2. 3- Test de clonogénie
V. 3. Etude de la cytotoxicité du trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6 sur deux lignées cellulaires
V. 3. 1- Test clonogénique sur les cellules HCT 116
V. 3. 2- Test de Presto-Blue sur les cellules HCT 116
V. 3. 3- Test de Presto-Blue sur les cellules FaDu
V. 4. Etude de la phototoxicité du trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6 sur deux lignées cellulaires
V. 4. 1- Etude de la toxicité de l’irradiation sur les HCT 116
V. 4. 2- Etude de la phototoxicité du complexe trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6 sur les cellules HCT
V. 4. 3- Etude de la phototoxicité du complexe trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6 sur les cellules FaDu
V. 4. 4- Conclusion
V. 5. Conception de nano-agrégats de trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6
V. 5. 1- Fabrication des auto-assemblages de complexe de ruthénium
V. 5. 2- Propriétés photochimiques des auto-assemblages de complexe trans (NO,OH)- [RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6
V. 6. Conclusion
Chapitre VI : Effet bactéricide du NO• libéré par irradiation des complexes de ruthénium à ligand nitrosyle
VI. 1. Introduction
VI. 2. Choix du modèle Staphylococcus epidermidis
VI. 2. 1- Généralités sur Staphylococcus epidermidis
VI. 2. 2- Description des souches de Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 et ATCC 35984
VI. 3. Effet bactéricide de NO• libéré par irradiation du complexe trans (NO,OH) [RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6
VI. 3. 1- Étude de la cinétique de croissance de Stapylococcus epidermidis ATCC 35984
VI. 3. 2- Suivi de croissance des bactéries traitées par trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6 sans et avec irradiation
VI. 3. 3- Quantification de l’effet bactéricide de trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6 sans et avec irradiation par comptage bactérien
VI. 3. 4- Suivi de croissance des bactéries traitées à la méthicilline. Détermination de la CMI 258
VI. 3. 5- Suivi de croissance des bactéries traitées avec trans (NO,OH)-[RuFT(Cl)(OH)(NO)]PF6 irradiés combinés à la méthicilline. Détermination de la CMI
VI. 3. 6- Etude de l’effet du photoproduit
VI. 4. Études préliminaires de l’effet bactéricide de NO• libéré par irradiation d’autres complexes de ruthénium à ligand nitrosyle
VI. 4. 1- Effet bactéricide de NO• libéré par irradiation de trans (NO,OH)- [RuTCC2F(Cl)(OH)(NO)]PF6
VI. 4. 2- Effet bactéricide de NO• libéré par irradiation de trans (NO,OH)- [RuTCC3F(Cl)(OH)(NO)]PF6
VI. 4. 3- Effet bactéricide de NO• libéré par irradiation de trans (NO,OH)- [RuFFT(Cl)(OH)(NO)]PF6
VI. 4. 4- Conclusion
VI. 5. Conclusion
Conclusion générale
Perspectives

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