Production de mycélium pour les études moléculaires

Amplification de l’ITS de l’ADNr nucléaire par PCR (Polymerase Chain Reaction)

Un protocole d’amplification adapté aux champignons mycorhiziens, inspiré par White et al. (1990) et mis au point au Laboratoire des Symbiotes des Racines (INRA de Montpellier) a été utilisé.
Les champignons, qui sont des organismes eucaryotes, ne possèdent pas les mêmes ARN ribosomiques que les bactéries qui sont des organismes procaryotes. Ils doivent donc être analysés séparément. Or, l’étude de la diversité par biologie moléculaire est moins répandue chez les eucaryotes, en particulier au niveau des champignons. Le choix des amorces et donc du gène cible à amplifier pour identifier les champignons d’un échantillon environnemental est encore discuté. Cependant l’étude de la région de l’ADN codant pour les sous-unités ribosomiques est aujourd’hui établie La figure 1 montre de façon schématique l’opéron ribosomique avec les sites des différentes amorces utilisées ou utilisables pour l’étude de l’ADN ribosomique nucléaire.
Les réactions d’amplification sont réalisées dans des plaques propres de PCR. Le volume réactionnel est le suivante : 4 μl de dNTP ; 10 μl tampon 5X ; 2 μl de chaque amorce (20pmol/μl) : ITS1-myc et ITS4-myc ; 5 μl ADN total extrait (environ 50ng) ; 26,8 μl eau millipore ou stérile (pour compléter à 50μl); 0,3 μl Taq polymérase.
Des témoins sans ADN sont réalisés pour tester la présence d’éventuelles contaminations dans les réactifs et dans les tampons.
Les 50μl du mélange sont ensuite recouverts d’1 goute d’huile minérale pour éviter les phénomènes d’évaporation et de condensation dans les tubes. La plaque est ensuite recouverte d’un papier adhésif et placée dans un thermocycleur programmé de la façon suivante :
– une phase initiale de dénaturation à 96°C pendant 5 min.
– 30 cycles comprenant une phase de dénaturation à 96°C pendant 30 sec, une phase d’hybridation à 55°C pendant 30 secondes. Puis une phase d’extension à 72°C pendant 1.30min
– allongement de la phase d’extension ou phase finale d’élongation à 72°C pendant 7 min
-conservation du produit d’amplification à 4°C avant congélation à -20°C
Ce protocole permet d’amplifier correctement la région qui nous intéresse; il est toutefois nécessaire de rechercher la concentration en ADN qui permet d’obtenir une réaction d’amplification optimale.
La vérification du bon fonctionnement de la réaction d’amplification est réalisée grâce à la visualisation des amplifiats sur un gel de contrôle. Dix μl d’amplifiats sont déposés sur un gel d’agarose à 0.8% dans un tampon TAE 1X. La migration s’effectue par électrophorèse à 120V pendant une heure.

Digestion des ITS amplifiés par des enzymes de restriction (Restriction Fragment Length Polymorphism : RFLP) : analyse des profils de restriction

Le protocole de digestion est utilisé avec les trois enzymes suivantes : AluI (5’AG^CT3’), TaqI (5’T^CGA3’), et Sau96 (5’G^GNCC3’) choisies suite à une étude pour leur potentiel discriminant c’est-à-dire pour leur aptitude à mettre en évidence une certaine diversité au sein du groupe des champignons basidiomycètes (Zaremski, 1999).
Note : N : A ou C ou T ou G ^ : Site de coupure des enzymes
Les réactions de digestion des ITS sont réalisées avec 10 μl d’amplifiat (produits de PCR) et 20 μl d’un mélange de 17 μl H2O ultra pure, 2 μl d’un tampon correspondant à l’enzyme et 1μl d’enzyme.
Ces réactions sont réalisées :
– à 37°C pendant 15minutes avec l’enzyme AluI (5’AG^CT3’),
– à 37°C pendant 5minutes avec l’enzyme Sau96 (5’G^GNCC3’)
– à 65°C pendant 5minutes avec l’enzyme TaqI (5’T^CGA3’).
Les dépôts dans les puits des différents gels ont été réalisés avec 15 μl d’un mélange composé de 15 μl des produits de digestion de l’ADN amplifié et 5 μl de tampon de charge « 6XDNA loading » (bleu de bromophénol, glycérol 87%, EDTA 0,5M, xylène cyanol FF). Les marqueurs de poids moléculaire sont placés de part et d’autre du gel afin d’estimer le nombre de paires de base des fragments obtenus.
L’ADN obtenu est visualisé sous UV après électrophorèse en gel d’agarose révélé dans un bain qui contient du bromure d’éthidium (BET) à 2 μg.ml-1.
Les gels de contrôle sont réalisés dans du TBE 1X avec différents types d’agarose et différentes conditions de migration suivant les cas et présentés dans le chapitre 2.8. « Gels de contrôle ».
Des dilutions de concentration d’ADN ont été effectuées au 10ème, 100ème et 1000ème.

Gels de contrôle

Pour chacune des étapes décrites : purification de l’ADN, amplification de l’ITS et digestion de l’ITS par différentes enzymes de restriction, l’ADN obtenu est visualisé en lumière ultra-violette après électrophorèse en gel d’agarose et révélation dans le bromure d’éthidium (BET) à 2 μg.ml-1. Les gels de contrôle sont réalisés dans du TBE 1X ou du TAE 1X, avec différents types d’agarose et différentes conditions de migration suivant les cas (tableau 2).

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Table des matières

REMERCIEMENT
SOMMAIRE
ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ANNEXES
I INTRODUCTION
1.1. Problématique
1.2. Objectifs
1.3. Autres activités de recherche lors de mon stage
II MATERIELS ET METHODES
2.1 Matériel biologique
2.2 Préparation des Milieux de culture
2.3 Isolement : mise en culture, obtention de mycélium pur
2.4 Production de mycélium pour les études moléculaires
2.5 Extraction de l’ADN fongique à l’aide du kit d’extraction Invitrogen « TM purlink plant total DNA purification kit
2.6 Quantification des ADN extraits
2.7 Amplification de l’ITS de l’ADNr nucléaire par PCR
2.8 Digestion des ITS amplifiés par des enzymes de restriction (Restriction Fragment Length Polymorphism : RFLP) : analyse des profils de restriction
III RESULTATS ET DISCUSSIONS
3.1. Isolement : mise en culture, obtention de mycélium pur
3.2. Description morphologique de Ganoderma récolté dans les plantations de Tanah- Gambus
3.3. Extraction de l’ADN fongique à l’aide du kit d’extraction Invitrogen « TM purlink plant total DNA purification kit 3.4. Amplification de l’ITS
IV CONCLUSIONS
V PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES