Soutenance mémoire
Procédé de régénération par embryogenèse somatique
Généralités
Le caoutchouc naturel provient du latex d’un arbre de la famille des euphorbiacées appelé l’hévéa (Hevea brasiliensis), le latex n’est autre que le cytoplasme de cellules spécialisées, les laticifères. La récolte s’effectue en saignant les arbres, c’est-à-dire en pratiquant des incisions en spirales au niveau des laticifères. Le caoutchouc naturel contenu dans le latex est alors coagulé à l’aide d’acide acétique, puis crêpé, découpé en granules qui seront lavés, déshydratés puis conditionnés en balles de 15 kilos. Ces balles seront ensuite exportées vers les usines de transformation pour obtenir le produit final désiré.
L’hévéaculture, situation et enjeux :
Les pays industrialisés ou en voie d’industrialisation sont complètement dépendants de la production de caoutchouc naturel, ne serait-ce qu’à cause de l’industrie automobile. Bien que du caoutchouc synthétique provenant de l’industrie pétrolière soit sur le marché, ce produit de remplacement n’égale pas son homologue naturel. Plus grande élasticité, résistance, bonne capacité d’adhérence, faible échauffement interne, le caoutchouc naturel dispose de nombreux avantages. De plus la fabrication du caoutchouc synthétique devient de plus en plus chère avec la montée du prix du pétrole. Il faut aussi ajouter les avantages écologiques de cette culture, l’hévéa est fixateur de CO2, son utilisation préférentielle par rapport à la pétrochimie permettrai du coup une économie d’énergie fossile. Sa culture permet également la protection des sols tropicaux fréquemment victimes de lessivage ainsi que leur régénération. Enfin, d’un point de vue économique et développemental, l’hévéa étant cultivé en grande partie en Asie (92%) en Afrique et en Amérique Latine, il constitue une source économique non négligeable pour ces pays, et par conséquent aide à leur développement. De plus, les producteurs peuvent effectuer des cultures intercalaires le temps que la parcelle atteigne son âge d’exploitation. Les hévéas peuvent aussi êtres plantés et exploités en petit nombre et en complément d’autres cultures telles que les cultures vivrières. Pour finir, en fin d’exploitation, le bois d’hévéa peut être vendu pour la fabrication de meubles. Depuis 30 ans la demande de caoutchouc ne fait qu’augmenter et la proportion de caoutchouc naturel sur le marché de l’élastomère est passée de 30% à 43%. Cette demande vient d’une part des pays industrialisés, mais surtout des pays émergents dont l’industrialisation est en pleine expansion. Par conséquent, face au progrès de la chimie, et face à cette demande industrielle, l’hévéaculture doit relever le défi d’améliorer sa productivité et ce sur le long terme. Pour ce faire, une amélioration des techniques d’exploitation ainsi que du matériel végétal est nécessaire.
Contexte scientifique :
La sélection par les méthodes conventionnelles est difficile à mettre en place chez l’hévéa. En effet, l’hévéa est une plante allogame, le cycle biologique de l’arbre est long et les taux de fertilité femelle et de nouaison sont faibles. Une forte auto-incompatibilité a également été observée ce qui rend difficile la réalisation d’autofécondation contrôlée (Clement-Demange A. et al., 1997). Ensuite il faut attendre 5 à 7 ans pour effectuer une première saignée et 10 à 15 ans d’exploitation pour évaluer le potentiel de production d’une nouvelle sélection. Aujourd’hui les génotypes haut-producteurs sont propagés par greffage sur semis non sélectionnés.
L’exploitation du caoutchouc naturel provoque naturellement une situation de stress chez l’arbre. En fait, la blessure engendre un stress oxydatif qui entraîne la libération d’une protéine, appelé hévéine, dans le cytoplasme (l’hévéine se trouve dans des vésicules appelées lutoïdes) qui, en se fixant sur un récepteur spécifique, fait coaguler le latex et arrête son écoulement. La surexploitation des arbres exacerbe ce phénomène et peut aboutir à l’arrêt prématuré de l’écoulement ou pire à l’absence d’écoulement (Gidrol et al., 1994). Ce phénomène est appelé encoche sèche. Dans un souci d’amélioration de la productivité et de gestion durable de la production, un des défis actuels est de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la production de caoutchouc, notamment ceux liés au stress d’exploitation.
La transgénèse, développée au CIRAD depuis les années 90 (Montoro et al, 2000) se révèle être un outil de choix pour ce type d’étude. Les gènes d’intérêts impliqués dans le processus de détoxification des différentes formes d’oxygène toxiques (ROS) libérées lors du stress ont été identifiés et les premiers essais de transformation avec certains de ces gènes ont été réalisés (Leclercq et al., 2007). La technique de transformation se fait par coculture de cals embryogènes avec une souche d’Agrobacterium Tumefaciens. La technique de transformation par Agrobacterium ainsi que le procédé de régénération par embryogenèse somatique peuvent être à l’origine de perturbations telles que variations génétiques ou épigénétiques ((Lucht et al., 2002); discussed by (Labra et al., 2004), reviewed by (Filipecki and Malepszy, 2006)). Des variations d’expression du transgène ont déjà été remarquées chez le tabac, entre plusieurs lignées transgéniques ainsi qu’au sein d’une même lignée ((Hobbs et al., 1990); (Peach and Velten, 1991); quoted by (Filipecki and Malepszy, 2006)). Des phénomènes d’extinction génique ont aussi été observés. Plusieurs facteurs peuvent êtres corrélés à ces observations : – nombre de copies du transgène – lieu d’insertion du transgène dans le génome hôte – variations somaclonales dues à la technique de régénération – état physiologique des plantes (stade développemental, facteur environnement) – mauvaise standardisation des conditions expérimentales (Filipecki and Malepszy, 2006)
Sujet de l’étude :
Mon étude a pour but d’évaluer le niveau d’expression du gène rapporteur gusA chez des plants régénérés par embryogenèse somatique (plants de première génération) et d’estimer la variabilité de l’expression entre les plants d’une même lignée transgénique (variabilité intralignée), entre les plants de différentes lignées (variabilité inter-lignée) et au cours du développement du plant. L’objectif du projet dans lequel se situe mon sujet est d’apprécier le niveau et la variabilité d’expression du gène gusA en utilisant la technique de dosage de l’activité GUS par fluorimétrie entre les plants de première génération et leurs clones propagés par greffage et par microbouturage (Lardet et al., 1994).
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Table des matières
1- Introduction
1-1 Généralités
1-2 L’hévéaculture, situation et enjeux
1-3 Contexte scientifique
1-4 Sujet de l’étude
2- Matériel et méthodes
2-1 Obtention du matériel végétal transformé
2-2 Procédé de régénération par embryogenèse somatique
2-3 Principe de l’analyse de l’expression du gène GUSA
2-4 Préparation des extraits protéiques
2-5 Dosage des protéines totales
2-6 Minigreffage des vitroplants transformés
2-7 Observation de la fluorescence de la GFP :
3- Résultats
3-1 Variabilité inter-lignée d’activité GUS
3-2 Variabilité intra-lignée d’activité GUS
3-3 Variabilité d’activité GUS entre deux lignées sœurs
3-4 Activité GUS identique dans trois lignées différentes
3-5 Variabilité d’activité GUS dans les différents étages foliaires d’un même plant
4- Discussion
4-1 Evaluation de potentielles erreurs dues à des variations biologiques
4-2 Evaluation de potentielles erreurs dues à des variations expérimentales
4-3 Pas d’effet positionnel détecté pour trois des lignées testées
4-4 Implication des variations somaclonales et lignage cellulaire
4-5 Impacts des facteurs physiologiques sur l’activité GUS
4-6 Intérêt des vitroplants issus d’embryogenèse somatique et perspectives d’utilisation d’autres modes de propagation
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