Soutenance mémoire
Préparation des broyats et extraction de l’ADN
Diversité taxonomique des champignons
La connaissance des champignons des zones tempérées est plus ancienne et développée qu’en zones tropicales. Toutefois, au cours des deux dernières décennies, la mycologie tropicale a bénéficié des techniques de séquençage Sanger et NGS pour l’exploration de la diversité de ces écosystèmes (e.g. Courtecuisse et al., 2012 ; Bordez et al., 2016). En plus des études de la diversité taxonomique, des approches fonctionnelles sont également menées. Nombre d’études ont été motivées par une volonté de description des espèces pour leur préservation et leur conservation face à l’évolution de l’habitat ou la destruction de zones forestières naturelles induisant une érosion conséquente de la biodiversité (Yamashita et al., 2015 ; Kerfahi et al., 2016). Les conditions d’échantillonnage conditionnent alors l’estimation de la diversité des communautés fongiques étudiées (Yamashita et al., 2015).
Il apparaît que les conditions environnementales biotiques et abiotiques (pente, humidité relative, température du sol, profondeur et composition de la litière, qualités de la canopée, contenu en eau du sol) affectent de manière sensible la composition des communautés fongiques (Gomez-Hernandez et al., 2012, Dighton et al., 2005). Gibertoni et al. (2016) ont comparé la distribution des champignons polypores dans trois centres d’endémisme en Amazonie brésilienne. Sur 153 espèces de polypores récoltées, une analyse de similarité basée sur un test de Bray-Curtis n’a pas permis de mettre en évidence de différence de diversité fongique entre ces centres de diversité. Urbina et al. (2016) se sont attachés à étudier la diversité fongique dans les sols de différents écosystèmes de Porto Rico. Pour mener cette étude, les auteurs ont utilisé une méthode de séquençage massif leur permettant de produire 566 613 séquences qu’ils ont groupées en 4 140 Unités Moléculaires Taxonomiques opérationnels (OTUs). Ils démontrent ainsi que les populations fongiques sont structurées en fonction des écosystèmes, avec une dominance d’Ascomycètes et de Basidiomycètes. Pour ce dernier groupe, les communautés sont dominées par des décomposeurs et des champignons ectomycorhiziens. Les études de la structuration des communautés fongiques ne permettent pas encore de comprendre les mécanismes de cette structuration (Dighton et al., 2005). d’espèce en mycologie est en évolution continue (Taylor et al., 2000 ; Lutzoni et al., 2004 ; Blackwell, 2011 ; Hibbett et al., 2011), notamment grâce aux méthodes d’analyses des génomes. En effet l’étude des isolats prélevés in situ a longtemps consisté en une approche culturale puis une caractérisation des isolats en culture pure et une classification basée sur des critères phénotypiques (nécessitant l’observation de fructifications très aléatoires à obtenir) et biochimiques.
Ces méthodes classiques fondées sur la description de caractères morphologiques et anatomiques sont incontournables mais limitées par le caractère cultivable ou non des isolats ; elles ont longtemps restreint la caractérisation et l’exploration de la diversité des communautés fongiques. Ces méthodes sont désormais complétées par les techniques de biologie moléculaire, permettant une meilleure appréhension de la taxonomie et de la phylogénie de ces organismes (Lutzoni et al., 2004 ; Hibbett et al., 2011). Aujourd’hui, l’analyse de l’opéron ribosomique permet une caractérisation suffisante pour reconnaître la plupart des taxons fongiques. L’amplification par réaction de polymérisation en chaine (PCR) puis le séquençage des portions ITS1 et ITS2 (Internal Transcribed Spacer) encadrant le gène 5.8S de l’ADN ribosomal (ADNr) nucléaire avec des amorces spécifiques des champignons, sont des outils très largement utilisés pour la caractérisation moléculaire des champignons (Figure 2). Ces séquences permettent d’une part de constituer des groupes d’homologie ou Unités Taxonomiques Opérationnelles (OTU) à différents niveaux taxonomiques moléculaires (espèce, genre, famille, ordre, classe et phylum au sens moléculaire) et d’autre part de détecter les parentés et reconstruire la phylogénie de ces organismes (Li et Godzick, 2006). La technique est utilisable dans de nombreuses situations : cultures de souches pures identifiées, sporophores de spécimens frais ou d’herbier, échantillons de mycélium indéterminé prélevé in situ, ou encore directement dans des échantillons de bois infectés par des champignons (Zaremski et al., 2005).
Les techniques méta-omiques et l’étude de la composante fongique des microbiotes des écosystèmes forestiers. La contribution récente d’outils moléculaires de séquençage à haut débit (approche méta-omics, NGS) apporte aujourd’hui un nouvel éclairage pour l’étude de la diversité taxonomique, l’écologie et le rôle des communautés microbiennes. Elle conduit, en particulier, à des changements de paradigmes et de nouveaux concepts. Ainsi la théorie de l’hologénome (Rosenberg et Zilber-Rosenberg, 2011) et le concept d’holobionte sont actuellement au coeur de nombreuses réflexions et débats sur le fonctionnement, l’homéostasie des organismes ou leur évolution. La notion d’holobionte a en effet étendu la notion d’organisme à l’ensemble des communautés microbiennes internes ou de surface qui lui est associé.
Echantillons de bois morts
Dispositif d’échantillonnage aléatoire de fragments de bois morts – Dans une première approche, sur chacun de ces 4 sites, cent fragments de bois d’essences indéterminées ont été prélevés de façon aléatoire au sol afin de caractériser la diversité du « ligniocellulobiome », soit l’ensemble des champignons potentiellement impliqués dans la dégradation des bois. Les morceaux de bois sont séchés à 40 °c dans une étuve durant une semaine. L’ensemble des 100 échantillons d’un site est par la suite broyé à l’aide d’un broyeur Restch SM200 en maille 2 mm, dans le but d’obtenir une poudre de bois à partir de laquelle une extraction de l’ADN total puis son étude moléculaire par séquençage ciblé de type Illumina seront réalisées (Figure 3). Dispositif de piégeage fongique constitué d’éprouvettes standardisées – Dans une deuxième approche, nous avons exploité un dispositif de dégradation contrôlée des bois mis à notre disposition par J. Beauchêne en Guyane. Selon ce dispositif, des éprouvettes standardisées de bois mort, de 7 cm de longueur sur 1 cm de largeur et 0.5 d’épaisseur, ont été incubées in situ sur chacun des 4 sites d’étude (Figure 4). Les incubations ont été réalisées sur des durées de 1, 2, 3, 4 et 5 mois, à deux périodes de l’année, une période sèche et une période humide, entre 2009 et 2010. Les éprouvettes sont par ailleurs représentatives de 10 espèces ligneuses forestières, choisies en fonction de la durabilité de leur bois. Les espèces étudiées et les caractéristiques de durabilité de chacune d’elles sont présentées dans l’Annexe 1. Ces éprouvettes peuvent être considérées comme des dispositifs de piégeage (ou des filtres de recrutement) des communautés lignocellulolityques propres à chaque espèce de bois étudiés. A l’issue des périodes d’incubation, le matériel biologique récolté est donc constitué des éprouvettes de bois mort potentiellement infestées de mycéliums indéterminés.
Biodiversité taxonomique au sein des éprouvettes de piégeage
Lié au traitement d’échantillons de PCR issus d’environnements variables, d’importantes variations de rendement de la réaction de PCR ont été observées avec une part souvent importante de séquences inexploitables. Wintzingerode et al. (1997) ont décrit différents mécanismes identifiés comme inhibiteur de la réaction de PCR. Ainsi, en fonction de l’origine d’échantillons environnementaux, des pourcentages de succès de séquençage sont habituellement compris entre 20 % et 50 %. Pour nos échantillons, environ 35 % des séquences ITS1 sont directement exploitables ce qui est donc en accord avec les observations habituellement réalisées. Ce pourcentage de 35 est susceptible d’être augmenté. En effet, les produits PCR doubles, inexploitables en l’état, seront ré-amplifiés par nested-PCR avec des amorces plus spécifiques, notamment l’amorce ITS1b spécifique des Basidiomycètes. L’obtention des séquences reverse est également attendue afin de pouvoir travailler sur des séquences consensus qui offrent toujours une meilleure fiabilité de lecture, notamment quand il est nécessaire de corriger certaines positions.
En Caroline du Nord, O’Brien et al. (2005) ont analysé les communautés fongiques de divers sols forestiers. Ils trouvent en moyenne des proportions égales de Basidiomycètes (41 %) et d’Ascomycètes (46 %) qui sont majoritaires ; ils estiment la proportion de Zygomycètes à 1,5 %. En Chine, dans une zone semi-aride de transition entre la forêt et la steppe, Tian et al. (2017) trouvent pour leur part des proportions analogues d’Ascomycètes (40 %) et de Basidiomycètes (38 %) et une proportion plus élevée de Zygomycètes (17 %). Bien que le nombre de nos séquences soit encore trop réduit pour calculer des pourcentages fiables, nous observons dans nos échantillons, des proportions équivalentes de Basidiomycètes (8 séquences réparties en 4 OTUS) et d’Ascomycètes (11 séquences réparties en 8 OTUs). Par contre, à ce stade de notre analyse, nous observons une proportion de Zygomycètes (11 séquences réparties en 3 OTUs) beaucoup plus importante. Cette déviation peut être le résultat d’un échantillonnage trop faible et/ou de la distribution en patch des mycéliums dans le sol (Cairney, 2005) ; notre analyse aurait ainsi débutée dans une zone dominée par des Zygomycètes. Les Basidiomycètes, les Ascomycètes et les Zygomycètes sont connus pour leurs implications dans les pourritures des bois, même s’il semble que les Zygomycètes causent des pertes de masse moindres que les Basidiomycètes et les Ascomycètes (Fukasawa et al., 2011). Les séquences de Zygomycètes que nous avons obtenues ont été positionnées parmi les Mucorales, un des plus anciens groupes de champignons, connus pour être principalement des champignons saprophytiques du sol se développant donc au profit la matière organique ; des espèces parasites des plantes et des animaux sont également connues dans ce groupe (Hoffmann et al., 2013).
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Table des matières
REMERCIEMENTS
SOMMAIRE
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
Introduction
Matériels et méthodes
1.Description des sites d’étude
2.Matériels biologiques
2.a. Echantillons de bois morts
2.b. Préparation des broyats et extraction de l’ADN
3.Séquençage de type Sanger relatif au dispositif de piégeage fongique constitué d’éprouvettes standardisées
3.a. Amplification par PCR
3.b. Electrophorèse en gel d’agarose
3.c. Séquençage Sanger des produits de PCR et analyse des séquences
4.Métagénomique ciblée à partir de l’ADN extrait des fragments de bois morts du dispositif d’échantillonnage aléatoire :
4.a. Design des primers de PCR et Préparation de la librairie de séquençage par PCR
4.b. Séquençage Illumina MiSeq et analyse bio-informatique
Résultats
1.Dispositif de piégeage fongique : analyse des données de Séquençage Sanger
1.a. Analyse des produits de PCR sur gel d’électrophorèse
1.b. Alignement des séquences des produits de PCR et assignation taxonomique
1.c. Affiliation des OTUs à des lignées fongiques
1.d. Obtention de séquences et durabilité des bois
2.Dispositif d’échantillonnage aléatoire de bois mort : analyse des données de séquençage Illumina
2.a. Contrôle qualité des échantillons d’ADN environnemental
2.b. Contrôle qualité des produits de PCR
2.c. Analyse et alignement des séquences
Conclusion et perspectives
1.a. Discussion – Conclusion
1.b. Perspectives :
2.Références bibliographiques
ANNEXES
RESUME
SUMMARY
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