Soutenance mémoire
Les cellules cancéreuses
Les cellules tumorales possèdent des propriétés particulières, par rapport aux cellules saines, à l’origine de leur malignité. En effet, elles sont capables de produire elles-mêmes les facteurs de croissance nécessaires à leur division, et sur-expriment les récepteurs à ces signaux, ce qui induit leur prolifération rapide (Figure 1). Ce phénomène est renforcé par leur insensibilité aux signaux inhibiteurs de croissance. Pour supporter cette prolifération, les cellules cancéreuses vont également favoriser la production de vaisseaux sanguins par angiogenèse. Lorsque ces cellules tumorales restent confinées, ne diffusant pas vers des tissus ou organes voisins, on parle d’une tumeur bégnine, potentiellement présente dans tous les tissus. Dans certains cas, ces cellules vont dégénérer. Elles vont proliférer de plus en plus vite, et devenir agressives. On parle alors de tumeur maligne, à l’origine d’un cancer.
Détection et ciblage de cellules cancéreuses
Lorsqu’un diagnostic médical doit être établi, notamment lorsque l’on suspecte un cancer, il est important de pouvoir détecter de façon rapide et précise les cellules cancéreuses. Cette détection se fait de manière générale par ciblage de marqueurs spécifiques exprimés à leur surface. Alshaer et al. ont par exemple fonctionnalisé des liposomes à l’aide d’un aptamère anti-CD44 afin de reconnaître des cellules présentant cette glycoprotéine à leur surface. Ce système a été employé avec succès afin de cibler deux lignées cellulaires distinctes, A549 (cancer du poumon) et MDA-MB 231 (cancer du sein), exprimant CD44. Une autre manière de détecter des cellules cancéreuses emploie des anticorps spécifiques de certains marqueurs cellulaires4–6. Lv et al.7 ont décoré des microbilles magnétiques commerciales avec des anticorps anti-EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) par le biais d’une synthèse multi-étapes (Figure 2). Ces microbilles fonctionnalisées par les anticorps anti-EpCAM ont ensuite été appliquées à la capture de cellules tumorales circulantes d’un patient souffrant d’un cancer des poumons métastatique. Pour ce faire, ils ont incubé leurs particules dans un échantillon sanguin avant d’observer la nature des cellules capturées par celles-ci (Figure 3). Afin de mieux observer les cellules capturées, ils ont choisi trois marqueurs de coloration. L’ADN était coloré en bleu afin de savoir si les cellules immobilisées étaient des globules rouges (absence de noyau) ou non. Les cyto-kératines étaient colorées en vert. Ces polymères de kératine étant des marqueurs de cellules épithéliales, ils sont présents à la surface des cellules tumorales circulantes (issus de tissus épithéliaux cancéreux)8–10 mais absents des globules blancs. Enfin, le complexe de différenciation 45, ou CD45, était coloré en rouge. Ce complexe étant exprimé par les globules blancs mais pas par les cellules tumorales circulantes, cela permettait de confirmer la nature des cellules capturées. Une seule cellule compétitrice, un globule blanc (présentant une coloration rouge) a été capturée. Ce système est efficace, spécifique et sélectif, et donc adapté à la détection et à la capture de cellules tumorales circulantes. Les méthodes actuelles de détection de cellules cancéreuses employant des anticorps ou des aptamères sont certes très efficaces, mais également coûteuses en temps et en moyens financiers lors de leur synthèse, et possèdent une durée de vie limitée. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux systèmes de reconnaissance cellulaire.
Les défis inhérents aux protéines lors de leur impression…
La synthèse de polymères à empreintes de protéines reste encore aujourd’hui un domaine de recherche difficile mais stimulant. Lorsque l’on parle des défis apparaissant lors de l’impression de protéines, on fait principalement référence au fait que la synthèse de polymères à empreintes moléculaires a traditionnellement lieu dans un solvant organique62–64, avec un amorçage de polymérisation se faisant par chauffage65–67. Or les protéines sont des molécules biologiques, présentant une structure tertiaire particulière, très sensible aux différentes conditions expérimentales. Il est donc nécessaire d’adapter les conditions de synthèse afin de pouvoir travailler à des températures proches de l’ambiante dans des solvants aqueux68,69. Les défis liés à l’impression des protéines sont également inhérents à leur taille70. En effet, les protéines sont de grosses molécules, en tout cas comparées à ce qui était imprimé auparavant52,57,60 . En raison de cette taille, le transfert de masse des protéines au sein du polymère est très lent, et ce lors de leur adsorption ou extraction. Différentes stratégies de synthèse sont apparues afin de pallier ce problème, telles qu’un meilleur contrôle des polymérisations, l’impression non pas de protéines entières mais de parties de celles-ci nommées épitopes71,72 (Figure 14), ainsi qu’une immobilisation des protéines sur une surface68,70,73 . Cette deuxième stratégie est présentée plus en détails dans la partie suivante.
Modification de l’état de surface des particules
L’analyse du spectre FTIR des nanoparticules après fonctionnalisation met en évidence de nouvelles bandes à 2900 cm-1 correspondant à l’élongation des liaisons C-H, ainsi qu’autour de 1670 cm-1 correspondant aux vibrations de la liaison C=O de la fonction acide carboxylique de l’agent Iniferter (Figure 43a). Cette dernière bande est en réalité constituée de deux bandes proches l’une de l’autre ce qui permet la détermination du type de complexe formé entre la surface des nanoparticules de maghémite et l’agent Iniferter (voir agrandissement Figure 43b).
Pourquoi une polymérisation contrôlée
Deux grands mécanismes de polymérisation sont possibles, la polymérisation par étape (par addition ou condensation) ou la polymérisation en chaîne (polymérisation radicalaire par exemple). Dans ce dernier cas, les réactions ont lieu suite à la formation de centres actifs radicalaires et se font majoritairement par réactions d’addition. Il n’y a pas d’élimination de petites molécules. Les polymérisations radicalaires comportent trois grandes étapes : l’amorçage, afin de créer les centres actifs (radicaux), la propagation qui permet l’addition de nouveaux monomères sur la chaîne en croissance par le biais du centre actif, et la terminaison qui détruit le centre actif et arrête la croissance de la chaîne. Des réactions de transfert peuvent également avoir lieu : le centre actif est transféré de la chaîne en croissance à une autre molécule, arrêtant la croissance du polymère. Les polymérisations radicalaires présentent de nombreux avantages, tels qu’une très grande versatilité des monomères polymérisables, une large gamme de solvants et de températures utilisables, et une industrialisation facile des processus. Elles présentent néanmoins également des inconvénients, tels qu’une absence de contrôle sur la taille ou la morphologie des chaînes obtenues, et des indices de polymolécularité élevés. Afin de conserver les avantages d’une polymérisation radicalaire en évitant ses inconvénients, des méthodes de polymérisation radicalaire contrôlée ont été développées, visant à diminuer le nombre de réactions de terminaison ou de transfert en contrôlant le nombre de radicaux présents dans le milieu. Une fraction des radicaux est protégée sous forme inerte, et un équilibre d’activation-désactivation s’établit entre les chaînes actives en croissance et les chaînes dormantes. Dans l’idéal, les chaînes macromoléculaires sont toutes créées rapidement en début de polymérisation et croissent simultanément suivant ces cycles d’activation désactivation. Le plus souvent, les polymères à empreintes de protéines sont synthétisés à l’aide d’une polymérisation radicalaire libre, du fait de la large gamme de monomères envisageables. Il est cependant difficile de contrôler la croissance des chaînes, et de s’assurer une épaisseur homogène du polymère. L’homogénéité des PEP étant nécessaire à l’obtention de performances reproductibles, des méthodes de polymérisation radicalaires contrôlées ont été développées, entre autres par notre équipe au sein du laboratoire PHENIX. Après un rappel du principe de polymérisation radicalaire contrôlée par la méthode RAFT, nous présenterons les protocoles expérimentaux mis en œuvre pour synthétiser des polymères à empreintes d’albumine sérique bovine (BSA) puis de protéine fluorescente verte (GFP).
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Table des matières
Introduction générale
Chapitre 1 : Les systèmes hybrides oxyde de fer – polymère à empreintes (macro)moléculaires et leur intérêt en nanomédecine
1. Thérapies anti-cancéreuses
1.1. Les cellules cancéreuses
1.2. Détection et ciblage de cellules cancéreuses
1.3. Différentes thérapies et leurs limitations
1.4. Nécessité de nouveaux objets thérapeutiques
2. Les oxydes de fer magnétiques
2.1. Magnétite et maghémite
2.2. Synthèse de la maghémite
2.3. Leurs propriétés magnétiques
3. Les polymères imprimés
3.1. Les polymères à empreintes moléculaires
3.2. Les polymères à empreintes de protéines
3.3. Applications en santé des polymères à empreintes de protéines
3.4. Les polymères à empreintes de virus, bactéries ou cellules
4. Les systèmes hybrides oxyde de fer – polymère à empreintes de protéines (PEP)
4.1. Les objets hybrides
4.2. Une synthèse déjà bien référencée dans la littérature
4.3. Applications des objets hybrides
4.4. Vers de nouvelles thérapies ciblées
Chapitre 2 : Synthèse des nano-objets hybrides γ-Fe2O3@PEP
1. Synthèse et caractérisations des nanoparticules de maghémite γ-Fe2O3
1.1. Synthèse des particules
1.2. Caractérisations des nanoparticules synthétisées
2. Fonctionnalisation de la surface des nanoparticules d’oxyde de fer γ-Fe2O3
2.1. L’agent de fonctionnalisation
2.2. Une fonctionnalisation effective
3. Obtention de polymères à empreintes de protéines (PEP)
3.1. La BSA employée comme gabarit de synthèse
3.2. La mise en œuvre d’une polymérisation contrôlée de type RAFT
3.3. Synthèse des nano-objets hybrides
3.4. Caractérisations des nano-objets hybrides γ-Fe2O3@PEP
4. Conclusion sur la synthèse et la caractérisation des objets hybrides
5. Matériels et méthodes
5.1. Réactifs chimiques
5.2. Techniques de caractérisations et appareils de mesure
5.3. Synthèse des nanoparticules de maghémite
5.4. Fonctionnalisation par l’agent Iniferter
5.5. Synthèse du PEP et du PNI
5.6. Réalisation d’isothermes d’adsorption
Chapitre 3 : Ciblage de la GFP et sa dénaturation par hyperthermie magnétique
1. Les objets hybrides γ-Fe2O3@PEP-GFP
1.1. La protéine fluorescente verte (GFP)
1.2. Caractérisations des objets hybrides
2. Adsorption in vitro de la GFP
2.1. Isothermes d’adsorption
2.2. Visualisation de l’adsorption
2.3. Cinétique d’adsorption
2.4. Résilience de l’adsorption
2.5. Sélectivité et compétition lors de l’adsorption
3. Devenir in vitro de la GFP adsorbée
3.1. Désorption
3.2. Dénaturation
4. Ciblage cellulaire de la protéine fluorescente verte (GFP)
4.1. Adsorption de protéines immobilisées en milieu de culture cellulaire
4.2. Les objets biologiques employés
4.3. Ciblage des cellules COS-7 transfectées TMD-PHluorin
4.4. Ciblage des cellules HeLa transfectées TMD-PHluorin
4.5. Dénaturation de la GFP sur-exprimée par les cellules HeLa
5. Conclusion sur les performances des objets hybrides pour le ciblage et la dénaturation
6. Matériels et méthodes
6.1. Réactifs chimiques
6.2. Appareils de mesure
6.3. Détermination de la concentration en protéines
6.4. Etudes de l’adsorption in vitro
6.5. Devenir in vitro
6.6. Ciblage cellulaire
6.7. Dénaturation de la protéine exprimée par les cellules
Chapitre 4 : Dégradation des hybrides γ-Fe2O3@PEP en amas cellulaires
1. Une dégradation déjà référencée dans la littérature
1.1. Dégradation et toxicité des nanoparticules d’oxyde de fer
1.2. Dégradation et toxicité des polymères
2. Etude de la dégradation en tampon lysosomal
2.1. Choix des milieux d’étude
2.2. Influence de la quantité d’acide citrique
2.3. Influence du polymère imprimé
2.4. Influence de l’enzyme
3. Etude de la dégradation et de la toxicité en amas cellulaire
3.1. Sphéroïdes de cellules souches mésenchymateuse humaines
3.2. Etudes préliminaires sur les interactions particules – cellules
3.3. Dégradation des nano-objets γ-Fe2O3@PEP-GFP dans les sphéroïdes cellulaires
4. Conclusion sur la dégradation des objets hybrides γ-Fe2O3@PEP
5. Matériels et méthodes
5.1. Réactifs chimiques
5.2. Citratation des particules de maghémite
5.3. Synthèse de nanoparticules de polyacrylamide
5.4. Suivi de la dégradation en tampon lysosomal
5.5. Culture des cellules
5.6. Test de cytotoxicité AlamarBlue
5.7. Suivi de la dégradation en amas cellulaires
Chapitre 5 : Vers l’impression d’une protéine d’intérêt pour la nanomédecine : CD44
1. La glycoprotéine transmembranaire CD44
1.1. Présentation de la protéine
1.2. Nécessité d’un nouveau protocole de synthèse
2. Les nouveaux objets hybrides γ-Fe2O3@PEP
2.1. Fonctionnalisation de la maghémite avec un agent RAFT photo-polymérisable
2.2. Photo-amorçage et dénaturation de protéines
2.3. Optimisation du protocole de synthèse avec la GFP
3. Ciblage de cellules sur-exprimant la glycoprotéine transmembranaire CD44
3.1. Mesure de la capacité d’adsorption et du facteur d’impression
3.2. Cellules cancéreuses humaines et toxicité des nano-objets hybrides
3.3. Ciblage cellulaire
4. Conclusion sur les performances des objets hybrides photo-polymérisés
5. Matériels et méthodes
5.1. Réactifs employés
5.2. Appareils de mesure
5.3. Fonctionnalisation de la maghémite par l’agent RAFT photo-polymérisable
5.4. Synthèse du polymère
5.5. Réalisation d’isothermes d’adsorption
5.6. Mesure du facteur d’impression des objets hybrides γ-Fe2O3@PEP-CD44
5.7. Culture des cellules
5.8. Test de cytotoxicité MTT
5.9. Ciblage cellulaire
Conclusion générale et perspectives
Références
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